Name: single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00
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पांडुलिपि पर उनकी टिप्पणी के लिए हम डॉ एलेक्जेंडर Mourot का शुक्रिया अदा करते हैं । यह काम Agence नेशनल डे ला सभ्य (ANR २०११ MALZ ००३ ०१ से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; ANR-15-CE16-0010 और ANR-17-CE37-0010-03), BLG स्नेहा डालो ला सभ्य सुर अल्जाइमर से फैलोशिप द्वारा समर्थित है । हम IBPS (पेरिस, फ्रांस) की पशु सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं ।

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं जानवरों का उपयोग कर फ्रेंच विनियमों के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया (ग्रामीण R214/87 के लिए R214/130) और दोनों यूरोपीय आर्थिक समुदाय के नैतिक दिशानिर्देशों के अनुरूप (86/609/EEC) और फ?...

एकल सेल मल्टीप्लेक्स RT-पीसीआर पैच-दबाना के बाद एक साथ और मज़बूती से electrophysiologically की पहचान की कोशिकाओं5में 30 से अधिक जीनों की अभिव्यक्ति की जांच कर सकते हैं । एकल कोशिका स्तर पर जीन की अभिव्यक्ति का व?...

मस्तिष्क प्रांतस्था कई कोशिका विभिंन शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल प्रकार शामिल हैं । उनकी पहचान और लक्षण वर्णन, उनके विशिष्ट कार्यों की समझ के लिए एक शर्त, बहुत बड़ी रूपात्मक दिया चुनौतीपूर्ण हो सकता है, शारीरिक, और आणविक विविधता है कि cortical सेल प्रकार1 की विशेषता है ,2,3,4.
सिंगल सेल मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर पैच-क्लैंप और आरटी-पीसीआर तकनीकों के संयोजन पर आधारित है । यह एक साथ जांच कर सकते है electrophysiologically में 30 से अधिक पूर्वनिर्धारित जीन की अभिव्यक्ति की पहचान की कोशिकाओं को5। रिकॉर्डिंग पिपेट में एक न्यूरॉन अनुरेखक के शामिल किए जाने के आगे histochemical रहस्योद्घाटन6,7,8,9के बाद दर्ज की कोशिकाओं के रूपात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, 10. यह उनके phenotypic लक्षण5,9,10,11,12 के बहुभिंनरूपी विश्लेषण के आधार पर ंयूरॉन प्रकार के वर्गीकरण के लिए एक बहुत ही उपयोगी तकनीक है ,13,14. सिंगल सेल मल्टीप्लेक्स आरटी पीसीआर भी गैर के लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल है-न्यूरॉनी कोशिकाओं astrocytes जैसे15,16,17, और वस्तुतः हर मस्तिष्क संरचना करने के लिए लागू किया जा सकता18, 19,20,21,22,23 और कक्ष प्रकार, मान लें कि वे पूरे सेल विन्यास में दर्ज किया जा सकता है.
इस तकनीक की पहचान के लिए बहुत सुविधाजनक है सेलुलर स्रोतों और पारेषण प्रणालियों के/या लक्ष्य7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, विशेष रूप से जब विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी है । यह नेत्रहीन पहचाना कोशिकाओं29से पैच दबाना रिकॉर्डिंग पर निर्भर करता है, और इस प्रकार भी एक विशिष्ट सेलुलर वातावरण में कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है8,15,16. इसके अलावा मस्तिष्क ऊतक के cytoarchitecture के बाद से मस्तिष्क के स्लाइस में संरक्षित है, इस दृष्टिकोण भी विशेषता कोशिकाओं के संरचनात्मक संबंधों के अध्ययन में सक्षम बनाता है के साथ ंयूरॉन और गैर-ंयूरॉन तत्वों7,8 , 18.
इस तकनीक के बाद से काटा कोशिका द्रव्य की मात्रा द्वारा सीमित है और आरटी की दक्षता से, कम प्रति संख्या पर व्यक्त mRNA का पता लगाने मुश्किल हो सकता है । हालांकि अंय RNaseq प्रौद्योगिकी पर आधारित दृष्टिकोण एकल कोशिकाओं3,4,30,31के पूरे transcriptome का विश्लेषण करने की अनुमति, वे उच्च प्रवाह की जरूरत है महंगी sequencers जरूरी नहीं हर प्रयोगशाला के लिए उपलब्ध है । चूंकि सिंगल सेल मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर तकनीक अंत बिंदु पीसीआर का उपयोग करता है, यह केवल व्यापक रूप से उपलब्ध thermocyclers की आवश्यकता है । यह आसानी से electrophysiological सेट अप से सुसज्जित प्रयोगशालाओं में विकसित किया जा सकता है और महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं है । यह एक दिन, जीन के एक पूर्वनिर्धारित सेट की अभिव्यक्ति का एक गुणात्मक विश्लेषण के भीतर प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, यह दृष्टिकोण एक तेजी से तरीके से एकल कोशिकाओं के आणविक लक्षण वर्णन करने के लिए एक आसान पहुँच प्रदान करता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MACAW v.2.0.5</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>Multiple alignement for primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443852A</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>11034731001</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4065-52</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201205</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>PCR / desalted and diluted at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT10 Series - 10 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT10</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT20 Series - 20 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT20</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT200 Series - 200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT200</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT1000 Series - 1000 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Thermal Cylcer</td>
			<td>Perkin Elmer Cetus</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T4415-1L</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;X174 DNA-Hae III Digest</td>
			<td>NEB (New England BioLabs)</td>
			<td>N3026S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDA 290</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth paper with satin appearance</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1748B</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60377</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G4500</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>49159</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S6191</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60128</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>31437-M</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>63069</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare UK</td>
			<td></td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047235613</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Patch Clamp set-up cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP-83</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 10 software suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10ES</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E Series with Straight Body (Holder)</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>64-0997</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S8282</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G7041</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11223</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

सेरेब्रल प्रांतस्था कई कोशिका विभिन्न रूपात्मक, शारीरिक, और आणविक सुविधाओं का प्रदर्शन प्रकार से बना है. इस विविधता आसान पहचान और इन कोशिकाओं के प्रकार के लक्षण वर्णन करता है, उनके विशिष्ट कार्यों का अध्ययन करने के लिए आवश्यकताएँ प्रभावित करता है । यह लेख मल्टीप्लेक्स एकल सेल रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) प्रोटोकॉल, जो की अनुमति देता है, के बाद पैच दबाना स्लाइस में रिकॉर्डिंग, एक ही सेल में जीन के दसियों की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए वर्णन करता है । इस सरल विधि रूपात्मक लक्षण वर्णन के साथ लागू किया जा सकता है और इस तरह के रक्त वाहिकाओं के आसपास के क्षेत्र में के रूप में विभिन्न कोशिका प्रकार और उनके विशेष सेलुलर वातावरण, के phenotypic लक्षण निर्धारित करने के लिए व्यापक रूप से लागू है । इस प्रोटोकॉल के सिद्धांत को पैच-दबाना तकनीक के साथ एक सेल रिकॉर्ड है, फसल के लिए और रिवर्स अपनी cytoplasmic सामग्री टाइप करना, और गुणात्मक मल्टीप्लेक्स पीसीआर द्वारा जीन के एक पूर्वनिर्धारित सेट की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए । यह आर सी पीसीआर के साथ संगत पीसीआर प्राइमरों और intracellular पैच दबाना समाधान के एक सावधान डिजाइन की आवश्यकता है । एक चयनात्मक और विश्वसनीय प्रतिलिपि का पता लगाने सुनिश्चित करने के लिए, इस तकनीक को भी कोशिका द्रव्य संचयन से उचित नियंत्रण प्रवर्धन कदम की आवश्यकता है । हालांकि सावधानियों की चर्चा यहां कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए, वस्तुतः किसी भी electrophysiological प्रयोगशाला मल्टीप्लेक्स एकल सेल आरटी-पीसीआर तकनीक का उपयोग कर सकते हैं ।

मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर का एक प्रतिनिधि सत्यापन चित्रा 3में दिखाया गया है । प्रोटोकॉल को एक साथ जांच के लिए डिजाइन किया गया था 12 विभिंन जीन की अभिव्यक्ति । vesicular ग्लूटामेट ट्रां?...

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Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

एकल सेल मल्टीप्लेक्स रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के बाद पैच-दबाना

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करता है और पैच-दबाना के बाद एकल सेल मल्टीप्लेक्स रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया करने के लिए आवश्यक सावधानियों । यह तकनीक एक सरल और प्रभावी तरीका है एक एकल सेल से जीन के एक पूर्वनिर्धारित सेट की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने के लिए पैच-दबाना रिकॉर्डिंग की विशेषता है ।

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

समाई माप पैच दबाना और Ca 2 +</supरेटिना स्लाइसें में एकल तंत्रिका टर्मिनल पर इमेजिंग

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

इन्फ्रारेड तंत्रिका उत्तेजना के तंत्र की जांच के लिए पूरे सेल पैच दबाना

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

भ्रूणीय Zebrafish Mauthner कोशिकाओं से पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

एक कम्प्यूटर की मदद से बहु इलेक्ट्रोड पैच दबाना सिस्टम

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Morphologically- और Neurochemically पहचान Hippocampal interneurons से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

ब्रेन स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

चैनलरहादोपिस में आयन की चुनिंदा के इलेक्ट्रोफिज़ियोलोजिकल निर्धारण के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

सीखने-प्रेरित प्लास्टिक विश्लेषण के लिए स्लाइस पैच दबाना तकनीक

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

श्रवण Brainstem प्रतिक्रिया और बाहरी बाल कोशिका पूरी सेल पैच दबाना जन्मोत्तर चूहों में रिकॉर्डिंग

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

तैयारी और पूरे सेल पैच दबाना के लिए प्रोटोकॉल Xenopus laevis Tectal ंयूरॉंस की रिकॉर्डिंग

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...