Name: single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00
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Ringraziamo il dottor Alexandre Mourot per i suoi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG è supportato da fellowship dal Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Ringraziamo la struttura animale di IBPS (Parigi, Francia).

Tutte le procedure sperimentali utilizzando animali sono state eseguite in stretta conformità con norme francesi (codice rurale R214/87 R214/130) e conforme alle linee guida etiche di Comunità economica europea (86/609/CEE) e la carta nazionale francese sull'etica della sperimentazione animale. Tutti i protocolli sono stati approvati dal comitato etico di Charles Darwin e presentati al Ministero francese dell'educazione e della ricerca (approvazione 2015 061011367540). La struttura animale IBPS è accreditata dalle aut...

Singola cella RT-PCR multiplex dopo patch-clamp può sondare contemporaneamente e in modo affidabile l'espressione di più di 30 geni in cellule electrophysiologically identificato5. L'analisi di espressione genica a livello di singola cellula richiede gli iniettori di PCR altamente efficienti. Uno dei passi più limitanti è la raccolta del contenuto della cella. Sua efficienza dipende dal diametro del puntale della pipetta patch, deve essere più grande possibile, mentre le dimensioni della cell...

La corteccia cerebrale comprende numerosi tipi cellulari coinvolti in vari processi fisiologici. Loro identificazione e caratterizzazione, un prerequisito per la comprensione delle loro specifiche funzioni, può essere molto difficile data la grande diversità morfologiche, fisiologiche e molecolari che caratterizza di tipi delle cellule corticali1 ,2,3,4.
Cella singola multiplex RT-PCR si basa sulla combinazione di patch-clamp e tecniche di RT-PCR. E ' possibile sondare contemporaneamente l'espressione di predefiniti oltre 30 geni in cellule electrophysiologically identificato5. L'inclusione di un tracciante neuronale in ulteriormente la pipetta di registrazione permette la caratterizzazione morfologica delle cellule registrate dopo la rivelazione istochimica6,7,8,9, 10. è una tecnica molto utile per la classificazione dei tipi neuronali basato sull'analisi multivariata di loro tratti fenotipici5,9,10,11,12 ,13,14. Singola cella RT-PCR multiplex è adatto anche per la caratterizzazione di cellule non neuronali come astrociti15,16,17e può essere applicato praticamente a ogni cervello struttura18, 19,20,21,22,23 e cella tipo, supponendo che essi possono essere registrati nella configurazione di cellule intere.
Questa tecnica è molto conveniente per l'identificazione di fonti cellulari e/o obiettivi di trasmissione sistemi7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, soprattutto quando gli anticorpi specifici sono carenti. Esso si basa su registrazioni di patch-clamp da cellule visivamente identificati29e così permette anche l'ottimizzazione delle cellule in un ambiente cellulare specifico8,15,16. Inoltre poiché la citoarchitettura del tessuto cerebrale è conservato nelle fette del cervello, questo approccio consente inoltre studio dei rapporti anatomici delle cellule caratterizzate con elementi neuronali e non neuronali7,8 , 18.
Poiché questa tecnica è limitata dalla quantità di citoplasma raccolto e dall'efficienza della RT, il rilevamento del mRNA espresso al numero basso di copia può essere difficile. Anche se altri approcci basati sulla tecnologia di RNaseq permettono di analizzare l'intero trascrittoma di singole cellule3,4,30,31, hanno bisogno di alto-rendimento costoso sequencer non necessariamente disponibile per ogni laboratorio. Poiché la tecnica di RT-PCR multiplex singola cella utilizza PCR end-point, richiede solo thermocyclers ampiamente disponibili. Esso può essere facilmente sviluppata nei laboratori attrezzati con allestimenti elettrofisiologici e non richiede costose attrezzature. E ' in grado di fornire, entro un giorno, un'analisi qualitativa dell'espressione di un insieme predefinito di geni. Così, questo approccio offre un facile accesso per la caratterizzazione molecolare delle singole cellule in modo rapido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MACAW v.2.0.5</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>Multiple alignement for primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443852A</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>11034731001</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4065-52</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201205</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>PCR / desalted and diluted at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT10 Series - 10 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT10</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT20 Series - 20 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT20</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT200 Series - 200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT200</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT1000 Series - 1000 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Thermal Cylcer</td>
			<td>Perkin Elmer Cetus</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T4415-1L</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;X174 DNA-Hae III Digest</td>
			<td>NEB (New England BioLabs)</td>
			<td>N3026S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDA 290</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth paper with satin appearance</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1748B</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60377</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G4500</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>49159</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S6191</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60128</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>31437-M</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>63069</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare UK</td>
			<td></td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047235613</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Patch Clamp set-up cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP-83</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 10 software suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10ES</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E Series with Straight Body (Holder)</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>64-0997</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S8282</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G7041</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11223</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

La corteccia cerebrale è composto da numerosi tipi di cellule che esibiscono le varie caratteristiche morfologiche, fisiologiche e molecolari. Questa diversità ostacola la facile identificazione e caratterizzazione di questi tipi di cellule, prerequisiti per studiare le loro funzioni specifiche. Questo articolo viene descritto il protocollo multisala singola cella trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena (RT-PCR), che consente, dopo la registrazione a fette, patch-clamp per rilevare simultaneamente l'espressione di decine di geni in una singola cella. Questo semplice metodo può essere implementato con caratterizzazione morfologica ed è ampiamente applicabile per determinare i tratti fenotipici di vari tipi di cellule e il loro particolare ambiente cellulare, come ad esempio in prossimità di vasi sanguigni. Il principio di questo protocollo è per registrare una cella con la tecnica del patch-clamp, per raccogliere e invertire trascrivere il suo contenuto citoplasmatico, e per rilevare qualitativamente l'espressione di un insieme predefinito di geni di multiplex PCR. Richiede un'attenta progettazione di iniettori di PCR e intracellulare patch clamp soluzione compatibile con RT-PCR. Per garantire una trascrizione selettiva e affidabile rilevamento, questa tecnica richiede anche controlli appropriati dal citoplasma raccolto ai passaggi di amplificazione. Sebbene precauzioni discussi qui devono essere strettamente seguite, praticamente qualsiasi laboratorio elettrofisiologico possibile utilizzare la cella singola multisala tecnica RT-PCR.

Una rappresentanza convalida di RT-PCR multiplex è illustrata nella Figura 3. Il protocollo è stato progettato per sondare contemporaneamente l'espressione di 12 geni diversi. Il vGluT1 del trasportatore vescicolare del glutammato è stato preso come un controllo positivo di neuroni glutamatergici42. Il GABA sintetizzare gli enzimi (GAD65 e GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) e somatostatina (SOM) sono stati usati come indicatori di GABAer...

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Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...