Name: single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

Мы благодарим д-р Александр Mourot за его замечания по рукописи. Эта работа была поддержана от грантов от Agence Nationale de la Recherche (НРУ 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 и АНР-17-CE37-0010-03), BLG поддерживается стипендий от Fondation pour la Recherche sur Альцгеймера. Мы благодарим животных фонда IBPS (Париж, Франция).

Все экспериментальные процедуры с использованием животных были выполнены в строгом соответствии с положениями французского (код сельских R214/87-до R214/130) и соответствует этические руководящие принципы Европейского экономического сообщества (86/609/EEC) и французской национальной хартии по ...

Одной ячейке мультиплексной ПЦР-после того, как патч зажим можно одновременно и надежно зонд выражение более чем 30 генов в клетки electrophysiologically выявленных5. Анализ экспрессии генов на уровне отдельной ячейки требует высокоэффективных праймеры PCR. Одним из наиболее ограничив...

Головного мозга состоит из многочисленных типов клеток, участвующих в различных физиологических процессах. Их определение и характеристика, предварительным условием для понимания их специфических функций, может быть очень сложным ввиду большой морфологических, физиологических и молекулярных разнообразия, что характеризует корковых клеток типы1 ,2,3,4.
Одноклеточных мультиплексной ПЦР-основан на комбинации патч зажим и методов RT-PCR. Она может одновременно зонд выражение более чем 30 предопределенные генов в клетки electrophysiologically выявленных5. Включение трассирующими нейронов в записи пипеткой далее позволяет морфологическая характеристика записанные клеток после гистохимические откровение6,,78,9, 10. это очень полезный метод для классификации типов нейронов, на основе многофакторного анализа их фенотипических признаков5,9,10,11,12 ,,1314. Одна ячейка мультиплексной ПЦР-также подходит для характеризации не нейрональных клеток, таких как астроциты15,16,17и может применяться практически каждый мозг структуры18, 19,20,21,22,23 и ячейки типа, предполагая, они могут быть записаны в целом ячейки конфигурации.
Этот метод очень удобен для выявления клеточных источников и/или цели передачи систем7,8,,1516,20,21, 24,25,26,27,28, особенно, когда отсутствуют специфические антитела. Он опирается на патч зажим записи от визуально выявленных клетки29и таким образом также позволяет ориентации клетки в конкретной клеточной среды8,,1516. Кроме того так как cytoarchitecture ткани мозга сохраняется в срезах головного мозга, этот подход также позволяет исследования анатомических отношений характеризуется клеток с нейронов и не нейрональных элементы7,8 , 18.
Поскольку этот метод является ограниченное количество собранного цитоплазмой и эффективности RT, обнаружение мРНК, выраженные на низких копии номер может быть затруднено. Хотя другие подходы, основанные на RNaseq технологии позволяют анализировать весь транскриптом одиночных клеток3,4,30,31, они не обязательно дорогим секвенсоров высок объём доступны для каждой лаборатории. Так как одну ячейку мультиплексной ПЦР-техника использует конечную точку PCR, он только требует thermocyclers широко доступны. Это могут быть легко разработаны в лабораториях, оснащенных электрофизиологических установок и не требует дорогостоящего оборудования. В течение одного дня, она может обеспечить качественный анализ выражения предопределенный набор генов. Таким образом этот подход предлагает легкий доступ к молекулярная характеристика одиночных клеток в быстрой манере.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MACAW v.2.0.5</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>Multiple alignement for primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443852A</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>11034731001</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4065-52</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201205</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>PCR / desalted and diluted at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT10 Series - 10 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT10</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT20 Series - 20 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT20</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT200 Series - 200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT200</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT1000 Series - 1000 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Thermal Cylcer</td>
			<td>Perkin Elmer Cetus</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T4415-1L</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;X174 DNA-Hae III Digest</td>
			<td>NEB (New England BioLabs)</td>
			<td>N3026S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDA 290</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth paper with satin appearance</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1748B</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60377</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G4500</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>49159</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S6191</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60128</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>31437-M</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>63069</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare UK</td>
			<td></td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047235613</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Patch Clamp set-up cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP-83</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 10 software suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10ES</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E Series with Straight Body (Holder)</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>64-0997</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S8282</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G7041</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11223</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

Головного мозга состоит из многочисленных типов клеток, экспонируется различных морфологических, физиологических и молекулярные особенности. Это разнообразие препятствует простой идентификации и характеристика этих типов клеток, предпосылки для изучения их конкретных функций. Эта статья описывает мультиплекс одной ячейки обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) протокол, который позволяет, после фиксации записи в форме долек, обнаружить одновременно выражение десятки генов в одной ячейке. Этот простой метод может быть реализован с морфологическая характеристика и широко применяется для определения фенотипических признаков различных типов клеток и их конкретной клеточной среды, такие как вблизи кровеносных сосудов. Принцип этот протокол является для записи ячейки с техникой патч зажим, чтобы урожай и обратить вспять транскрибировать его цитоплазматических содержание, и обнаружить качественно выражение предопределенный набор генов мультиплексной ПЦР. Это требует тщательной разработки праймеры PCR и внутриклеточных патч зажим решение, совместимое с RT-PCR. Для обеспечения стенограмме селективный и надежного обнаружения, этот метод также требует надлежащего контроля от цитоплазмы заготовки для усиления действия. Хотя необходимо строго соблюдать правила, обсуждаемых здесь, практически любой электрофизиологической лаборатории можно использовать мультиплекс одну ячейку техника RT-PCR.

Представитель проверки мультиплексной ПЦР-это показано на рисунке 3. Протокол был разработан одновременно зонда выражение 12 различных генов. Глутамата Везикулярный транспортер vGluT1 было принято как позитивный элемент управления для глутаматергическ?...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Одноячеистый мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим

Этот протокол описывает важнейшие шаги и меры предосторожности, необходимые для выполнения одноклеточного мультиплекс обратной транскрипции полимеразной цепной реакции после патч зажим. Эта техника является простой и эффективный метод для анализа выражения профиль заранее определенный набор генов из одной клетки характеризуются патч зажим записей.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Патч-зажим измерения емкости и Са 2 + Изображений на Одноместный нервных окончаний в сетчатке глаза Ломтики

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Всего зажим патч для сотовых изучения механизмов Инфракрасный нервного возбуждения

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Патч зажим Recordings от эмбриональных данио рерио Mauthner клеток

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Компьютерный многоэлектродной патч-зажим система

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Цельноклеточная Записи патч-зажим от Morphologically- и нейрохимически выявленных гиппокампа Интернейроны

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Цельноклеточной патч-зажим Записи в головном мозге Ломтики

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Регистрация цельноклеточных патч-фиксаторов для электрофизиологического определения селективности ионов в канале-каналодопсинах

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Ломтик метод для анализа обучения индуцированная пластичности

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Ответ слуховой ствола мозга и внешние клетки волос поклеточного патч зажим запись в послеродовой крыс

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...