Name: single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

Vi tackar Dr Alexandre Mourot för hans synpunkter på manuskriptet. Detta arbete stöds av bidrag från Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 och ANR-17-CE37-0010-03), BLG stöds av stipendium från den Fondation pour la Recherche sur Alzheimers. Vi tackar djuranläggningen av IBPS (Paris, Frankrike).

Alla experimentella procedurer använder djur var utfört i strikt enlighet med franska bestämmelser (Code Rural R214/87 till R214/130) och överensstämde med de etiska riktlinjerna både av Europeiska ekonomiska gemenskapen (86/609/EEG) och den franska nationella stadgan om etiska djurförsök. Alla protokoll godkändes av den etiska kommittén som Charles Darwin och lämnats in till det franska ministeriet för utbildning och forskning (godkännande 2015 061011367540). IBPS djuranläggningen är ackrediterat av de fr...

Single cell multiplex RT-PCR efter patch-clamp kan samtidigt och tillförlitligt sond uttrycket av mer än 30 gener i elektrofysiologiskt identifierade celler5. Analysera genuttryck på enstaka cellnivå kräver högeffektiva PCR primers. En av de mest begränsande steg är samling av cellens innehåll. Dess effektivitet beror på diametern på patch pipettspetsen, som måste vara så stor som möjligt medan matchande Cellstorlek. Pipetter med en 1-2 µm öppen spets diameter var visat sig vara l?...

Hjärnbarken består av många celltyper som är inblandade i olika fysiologiska processer. Deras identifiering och karakterisering, en förutsättning för förståelsen av deras specifika funktioner, kan vara mycket utmanande med tanke på den stora morfologiska, fysiologiska och molekylära mångfald som kännetecknar kortikal cell typer1 ,2,3,4.
Encelliga multiplex RT-PCR bygger på kombinationen av patch-clamp och RT-PCR-tekniker. Det kan probe samtidigt uttryck för mer än 30 fördefinierade gener i elektrofysiologiskt identifierade celler5. Införandet av neuronala spårämne i inspelning pipetten ytterligare tillåter morfologisk karakterisering av inspelade cellerna efter histochemical Uppenbarelseboken6,7,8,9, 10. det är en mycket användbar teknik för klassificering av neuronala typer baserat på multivariat analys av deras fenotypiska drag5,9,10,11,12 ,13,14. Enskild cell multiplex RT-PCR lämpar sig också till karakterisering av icke-neuronala celler såsom astrocyter15,16,17, och kan tillämpas praktiskt taget varje hjärna struktur18, 19,20,21,22,23 och cell typ, förutsatt att de kan föras in i hela-cell konfiguration.
Denna teknik är mycket bekvämt för identifiering av cellulära källor eller mål av transmission system7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, särskilt när specifika antikroppar saknas. Det bygger på patch-clamp inspelningar från visuellt identifierade celler29, och därmed kan också inriktningen av celler i en specifik cellulär miljö8,15,16. Dessutom eftersom cytoarchitecture av hjärnvävnaden är bevarade i hjärnan skivor, möjliggör detta tillvägagångssätt också studiet av de anatomiska förhållandena kännetecknas celler med neuronala och icke-neuronala element7,8 , 18.
Eftersom denna teknik begränsas av mängden skördade cytoplasman och av effektiviteten i RT, kan detektion av mRNA uttryckt låg kopia nummer vara svårt. Även om andra metoder baserade på RNaseq teknik tillåter för att analysera det hela transkriptom av enstaka celler3,4,30,31, behöver de hög genomströmning dyra sequencers inte nödvändigtvis tillgängliga för varje laboratorium. Eftersom den enda cell multiplex RT-PCR-tekniken använder slutpunkten PCR, det enda som krävs allmänt tillgängliga thermocyclers. Det lätt kan utvecklas i laboratorier som är utrustade med elektrofysiologiska uppställningar och kräver ingen dyr utrustning. Det kan ge, inom en dag, en kvalitativ analys av uttrycket av en fördefinierad uppsättning gener. Således erbjuder denna strategi enkel tillgång till molekylär karakterisering av enstaka celler på ett snabbt sätt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MACAW v.2.0.5</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>Multiple alignement for primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443852A</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>11034731001</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4065-52</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201205</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>PCR / desalted and diluted at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT10 Series - 10 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT10</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT20 Series - 20 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT20</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT200 Series - 200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT200</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT1000 Series - 1000 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Thermal Cylcer</td>
			<td>Perkin Elmer Cetus</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T4415-1L</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;X174 DNA-Hae III Digest</td>
			<td>NEB (New England BioLabs)</td>
			<td>N3026S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDA 290</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth paper with satin appearance</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1748B</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60377</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G4500</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>49159</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S6191</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60128</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>31437-M</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>63069</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare UK</td>
			<td></td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047235613</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Patch Clamp set-up cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP-83</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 10 software suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10ES</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E Series with Straight Body (Holder)</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>64-0997</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S8282</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G7041</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11223</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

Hjärnbarken är sammansatt av många celltyper som uppvisar olika morfologiska, fysiologiska och molekylära funktioner. Denna mångfald hämmar enkel identifiering och karakterisering av dessa celltyper, förutsättningar för att studera deras specifika funktioner. Denna artikel beskriver multiplex enda cell omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) protokollet, vilket tillåter, efter patch-clamp inspelning i skivor, att upptäcka samtidigt uttryck för tiotusentals gener i en enda cell. Den här enkla metoden kan genomföras med morfologisk karakterisering och är allmänt tillämplig att avgöra de fenotypiska drag av olika celltyper och deras cellulära miljö, såsom i närheten av blodkärl. Principen om detta protokoll är att spela in en cell med patch-clamp teknik, skörda och omvända transkribera cytoplasmiska innehållet, och för att upptäcka kvalitativt uttrycket av en fördefinierad uppsättning gener av multiplex PCR. Det kräver en noggrann utformning av PCR primers och intracellulära patch-clamp-lösning som är förenlig med RT-PCR. För att säkerställa en selektiv och tillförlitlig utskrift kräver identifiering, denna teknik också lämpliga kontroller från cytoplasman skörd förstärkning steg. Även om försiktighetsåtgärder som diskuteras här måste följas strikt, kan praktiskt taget alla elektrofysiologiska laboratoriet använda multiplex enda cellen RT-PCR-teknik.

En representativ validering av multiplex RT-PCR visas i figur 3. Protokollet var avsedd att probe samtidigt uttrycket av 12 olika gener. Det vesikulära glutamat transportör vGluT1 togs som en positiv kontroll för glutamatergic nervceller42. GABA syntetisera enzymer (GAD65 och GAD 67), neuropeptid Y (NPY) och Somatostatin (SOM) användes som markörer för GABAergic interneuroner3,...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Polymeraskedjereaktion i enskild Cell Multiplex omvänd Transkription efter Patch-clamp

Det här protokollet beskriver de kritiska steg och försiktighetsåtgärder som krävs för att utföra enstaka cell multiplex omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion efter patch-clamp. Denna teknik är en enkel och effektiv metod för att analysera uttryck profilen av en förutbestämd uppsättning gener från en enda cell som kännetecknas av patch-clamp inspelningar.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Mått kapacitans och Ca 2 + Imaging vid enstaka nervterminaler i näthinnan Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch Clamp för att undersöka mekanismer Infraröd nervstimulering

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Inspelningar från embryonala Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Ett Datorstödd Multi-elektrod Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Hel-cell Patch-clamp Inspelningar från Morphologically- och neurokemiskt identifierade Hippocampus Interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Whole-cell Patch-clamp inspelningar för elektrofysiologisk bestämning av jonselektivitet i Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Slice Patch Clamp teknik för att analysera lärande-inducerad plasticitet

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Auditiv hjärnstammen svar och yttre hår Cell hela-cell Patch Clamp inspelning i Postnatal råttor

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparat och protokoll för hela cellen Patch Clamp inspelningen av Xenopus laevis Tectal nervceller

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...