Name: single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp
Uploaded: 2018-06-20T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

Dr Alexandre Mourot el yazması üzerine onun yorum için teşekkür. Bu eser Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; gelen hibe tarafından desteklenmiştir ANR-15-CE16-0010 ve ANR-17-CE37-0010-03), BLG Fondation pour la Recherche sur Alzheimer bursu tarafından desteklenmektedir. IBPS (Paris, Fransa) hayvan tesisi teşekkür ediyoruz.

Hayvanlar kullanarak tüm deneysel prosedürler Fransız düzenlemeler (kod kırsal R214/87 için R214/130) ile sıkı uygun olarak gerçekleştirilen ve Avrupa Ekonomik Topluluğu (86/609/EEC) ve Fransız Ulusal Charter etik kuralları için standartlarla uyumlu hayvan deney etik üzerinde. Tüm iletişim kuralları Charles Darwin Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve eğitim ve araştırma (onay 2015 061011367540) Fransız Bakanlığa gönderilmiş. IBPS hayvan tesisi Fransız yetkililer (A75-05-24) tarafından akr...

Tek hücre multiplex RT-PCR electrophysiologically tanımlanan hücreleri530'dan fazla genlerin ifade aynı anda ve güvenilir bir şekilde yama-kelepçe yoklama sonra. Gen ifadesinin tek hücre düzeyinde analiz yüksek verimli PCR astar gerektirir. En sınırlayıcı adımlardan biri hücrenin içerik topluluğudur. Verimlilik hücre boyutu eşleştirme sırasında mümkün olduğu kadar büyük olmalıdır yama pipet ucu çapı göre değişir. Pipetler 1-2 µm açık uç çapı en nöronal tü...

Serebral korteks çok sayıda hücre tipleri çeşitli fizyolojik süreçlerinde yer oluşmaktadır. Kendi kimlik ve karakterizasyonu, özel işlevleriyle, anlayış için bir ön koşul kortikal hücre tip1 karakterize büyük morfolojik, fizyolojik ve moleküler çeşitliliği göz önüne alındığında çok zor olabilir ,2,3,4.
Tek hücreli multiplex RT-PCR yama-kelepçe ve RT-PCR teknikleri kombinasyonuna dayanmaktadır. Aynı anda electrophysiologically tanımlanan hücreleri530'dan fazla önceden tanımlanmış genlerin ifade sonda. Histochemical vahiy6,7,8,9, sonra kaydedilen hücrelerin karakterizasyonu morfolojik dahil edilmesi daha fazla kayıt pipet nöronal bir izleyici sağlar 10. onların fenotipik özellikleri5,9,10,11,12 çok değişkenli analize dayalı nöronal türleri sınıflandırılması için çok kullanışlı bir yöntemdir ,13,14. Tek hücre multiplex RT-PCR da astrocytes15,16,17gibi sigara nöronal hücrelerin karakterizasyonu için uygundur ve hemen hemen her beyin yapısı-18uygulanabilir, onlar bütün hücreli yapılandırmada kaydedilebilir varsayarak 19,20,21,22,23 ve hücre tipi.
Bu teknik çok hücresel kaynakları tanımlaması ve/veya iletim sistemleri7,8,15,16,20,21hedefleri için uygundur, özellikle belirli antikor eksik zaman 24,25,26,27,28,. Bu yama-kelepçe kayıtları görsel olarak tanımlanan hücreleri29kullanır ve böylece aynı zamanda hücreleri belirli hücresel ortamı8,15,16hedefleme sağlar. Beyin dokusu cytoarchitecture beyin dilimler halinde korunmuş olduğundan, Ayrıca bu yaklaşım da anatomik ilişkileri nöronal ve nöronal elements7,8 ile karakterize hücrelerinin çalışma sağlar , 18.
Bu tekniği hasat sitoplazma miktarı ve RT verimliliğini tarafından sınırlı olduğu için düşük kopya sayısı ifade mRNA tespiti zor olabilir. Yüksek üretilen iş pahalı sıralayıcılar ihtiyaçları ille RNaseq teknolojisine dayalı diğer yaklaşımlar tek hücreleri3,4,30,31, Bütün transcriptome analiz etmek için izin rağmen Her laboratuvar için kullanılabilir. Tek hücre multiplex RT-PCR tekniği son nokta PCR kullandığından, yalnızca yaygın olarak kullanılan thermocyclers gerektirir. Bu kolayca elektrofizyolojik set-up ile donatılmış laboratuarlarında geliştirilen ve pahalı ekipman gerektirmez. O, bir gün içinde bir kalitatif analiz genler önceden tanımlanmış bir dizi ifade sağlayabilir. Bu nedenle, bu yaklaşım hızlı bir şekilde tek hücreleri moleküler karakterizasyonu kolay bir erişim sunmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>MACAW v.2.0.5</td>
			<td>NCBI</td>
			<td></td>
			<td>Multiple alignement for primer design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443852A</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>11034731001</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-4065-52</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201205</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M5904-5ML</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>PCR / desalted and diluted at 200 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AB0350</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT10 Series - 10 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT10</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT20 Series - 20 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT20</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT200 Series - 200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT200</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BT1000 Series - 1000 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Neptune Scientific</td>
			<td>BT1000.96</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Thermal Cylcer</td>
			<td>Perkin Elmer Cetus</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E1510-10ML</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T4415-1L</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#934;X174 DNA-Hae III Digest</td>
			<td>NEB (New England BioLabs)</td>
			<td>N3026S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDA 290</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth paper with satin appearance</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1748B</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60377</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium D-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G4500</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>M1028</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td>Wescor</td>
			<td></td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>B4261</td>
			<td>Patch clamp internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>49159</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S6191</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>60128</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>31437-M</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S5011</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>63069</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>K3375</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal Healthcare UK</td>
			<td></td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>14047235613</td>
			<td>Slice preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Patch Clamp set-up cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP-83</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td>
			<td>Sony</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCLAMP 10 software suite</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Patch Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-10ES</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E Series with Straight Body (Holder)</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>64-0997</td>
			<td>Expelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S7907</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>S8282</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>X100</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>G7041</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11223</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td>Histochemical revelation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

Serebral korteks çeşitli morfolojik, fizyolojik ve moleküler özellikler sergileyen çok sayıda hücre türleri oluşur. Bu hücre türleri, özel işlevleriyle çalışmak için Önkoşullar malzemelerin kolay tanımlanması ve bu çeşitliliği engellemektedir. Bu makalede, sonra yama-kelepçe dilimler halinde kayıt aynı anda onlarca genlerin ifade tek bir hücreye algılamak için sağlar multiplex tek hücre Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) protokolünü açıklar. Bu basit yöntem ile morfolojik karakterizasyonu uygulanabilir ve kan damarlarının çevresinde gibi çeşitli hücre tiplerinin ve belirli hücresel çevreleri, fenotipik özellikleri belirlemek için yaygın olarak uygulanabilir. Bu iletişim kuralı bir hücre hasat ve ters yama-klemp tekniği ile uyarlamak sitoplazmik içeriğini kaydetmek için ve niteliksel algılamaya genler tarafından önceden tanımlanmış bir dizi ifade multiplex PCR ilkedir. PCR astar ve hücre içi yama-kelepçe çözüm RT-PCR ile uyumlu dikkatli bir tasarım gerektirir. Seçici ve güvenilir transkript sağlamak için algılama, bu teknik aynı zamanda sitoplazma amplifikasyon merdiven-e doğru hasat uygun denetimlerinin gerektirir. Burada tartışılan önlemler kesinlikle takip edilmesi gereken rağmen hemen hemen her elektrofizyolojik laboratuvar multiplex tek hücre RT-PCR tekniği kullanabilirsiniz.

Multiplex RT-PCR temsilcisi doğrulamasına Şekil 3' te gösterilmiştir. Protokol aynı anda 12 farklı genler ifade soruşturma için tasarlanmıştır. Veziküler glutamat ışınlama vGluT1 glutamatergic nöronlar42için pozitif kontrol olarak alınmıştır. Enzimler (GAD65 ve GAD 67), peptit Y (NPY) ve Somatostatin (SOM) sentezleme GABA GABAergic interneurons3,5,</s...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp at JoVE.com

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...