Name: investigating teliospore germination using microrespiration analysis and microdissection
Uploaded: 2018-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection at JoVE.com

Nous tenons à remercier le Dr Paul Frost pour utilisation de son microrespirometer et Nicole Wagner et Alex Bell pour l’assistance technique. Ce travail a été financé par une subvention du CRSNG à B.J.S.

1. corn Cob Infection
<ol><li>Zea mays (CV Golden Bantam) de croître jusqu'à ce que les épis sont formés et ont commencé à la soie (environ 60 jours).</li>
	<li>La culture haploïdes compatibles U. maydis souches à l’aide de protocoles standard comme précédemment décrit7.</li>
	<li>Infecter les épis de maïs à l’aide de protocoles standard comme décrit précédemment7.</li>
</ol>2. téliospores récolte
<ol><li>...

<ol>
	<li>Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. , 411-460 (2012).</li><li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Monograph Number 2. , (1963).</li><li>Caltrider, P. D., Gottlieb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+activity+and+enzymes+for+glucose+catabolism+in+fungal+spores.">Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores.</a> Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).</li><li>Allen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+aspects+of+spore+germination+in+fungi.">Metabolic aspects of spore germination in fungi.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+tumours.">Metabolism of tumours.</a> Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).</li><li>Ostrowski, L. A., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+antisense+transcripts+are+linked+to+the+modulation+of+mitochondrial+function+and+teliospore+dormancy+in+Ustilago+maydis.">Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis.</a> Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).</li><li>Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+genes+expressed+in+the+Ustilago+maydis+dikaryon:+uncovering+a+novel+class+of+pathogenesis+genes.">Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).</li><li>Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unh1,+an+Ustilago+maydis+Ndt80-like+protein,+controls+completion+of+tumor+maturation,+teliospore+development,+and+meiosis.">Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis.</a> Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).</li><li>Stade, S., Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+during+fungal+spore+germination:+respiration+and+cytochrome+c+oxidase+in+Neurospora+crassa.">Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa.</a> J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).</li><li>Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+developing+mitochondrial+genetic+and+respiratory+functions+in+germinating+fungal+spores.">Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).</li><li>Sacadura, N. T., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+EST+analyses+of+Ustilago+maydis+germinating+teliospores.">Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores.</a> Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).</li><li>Hilderbrand, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+isolation+of+single+microorganisms.">Techniques for the isolation of single microorganisms.</a> Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).</li><li>Seto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , (2013).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H., K&#246;nig, H., Varma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. , 425-437 (2006).</li><li>Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+spore+isolation+of+fungi.">Single spore isolation of fungi.</a> Fungal Diversity. 3, 11 (1999).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+with+yeast.">Getting started with yeast.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).</li><li>Chen, Y., Seguin-Swartz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+viability+of+fungal+spores.">A rapid method for assessing the viability of fungal spores.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).</li></ol>

Pathogènes basidiomycète biotrophe causent milliards de dollars en pertes de récoltes par an. La grande majorité de ces agents pathogènes produire des téliospores qui font partie intégrante de la dispersion fongique et reproduction sexuée. Acquérir les connaissances du développement et la germination des téleutospores est essentielle à la compréhension de la propagation des maladies dévastatrices provoquées par ces champignons. Afin d’identifier les changements moléculaires aux points de contrôle clés...

Les champignons du charbon (Ustilaginales) se composent de plus de 1600 espèces qui infectent les herbes dont les récoltes de céréale importante de maïs, l’orge et le blé, causant des milliards de dollars en pertes de récoltes par an1. Ces champignons sont caractérisés par la production de téleutospores, ont pigmenté sombrement les parois cellulaires, qui sont les agents de dispersion. Téliospores servent à protéger le matériel génétique au cours du stress de la dispersion entre les plantes hôtes et peuvent persister dans un état dormant pour les années2. Par conséquent, téleutospores sont une composante essentielle de la propagation de la maladie.
Afin d’étudier la biologie téliospores, notre laboratoire utilise le champignon de charbon modèle Ustilago maydis (U. maydis), qui est l’agent causal de la maladie « charbon commun du maïs ». Mature U. maydis téliospores sont caractérisent par l’arrêt de croissance, le métabolisme cellulaire réduit et faible niveau de la respiration cellulaire3. Dans les conditions environnementales favorables (par exemple., la présence de sucres spécifiques), U. maydis téleutospores germent et toutes les basidiospores de la méiose, production qui peuvent initier de nouveaux cycles d’infection. La germination est caractérisée par une augmentation de la respiration, l’activité Retour à métabolique et la progression à travers les stades morphologiques observables de germination4.
La première étape de germination comprend une augmentation de la respiration et de la fonction métabolique, cependant, il n’y a pas d’indications morphologiques du changement. La taille originale du changement respiratoire dans U. maydis ont été effectuées depuis plus de 50 ans, mesurant la consommation d’oxygène manométriquement avec Warburg fiole appareil5. Nous avons développé une méthode simple d’étudier les changements précis dans la respiration durant la germination des téliospores en mesurant la consommation d’oxygène pendant un cours temps de germination à l’aide d’un microrespirometer de type Clark. Nous avons déjà utilisé cette méthode pour étudier les changements de rythme respiratoire entre le type sauvage mutants avec6de mitochondries défectueuses et U. maydis cellules haploïdes et ont adapté le protocole ici pour étudier les changements dans la respiration téliospores durant germination. Ceci fournit un moyen d’identifier avec précision le moment du changement de la respiration pour que nous puissions cibler téliospores le moment venu, après le début de la germination pour étudier les événements moléculaires précoces. La progression de la germination peut être suivie au microscope une fois le promycélium émerge de la téliospore, mais la nature asynchrone a inhibé l’isolement d’assez téleutospores à un stade donné pour enquête. Nous avons développé une technique de microdissection semblable à ceux utilisés pour la fécondation in vitro pour recueillir des téliospores physiquement à des stades morphologiques distincts de la germination.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:437px;">Streptomycin Sulfate</td>
			<td style="width:75px;">BioShop</td>
			<td style="width:124px;">STP101</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L Waring Laboratory blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>7011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cheesecloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5310-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unisense MicroRespiration system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">MicroRespiration Sensor (O2)</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>OX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroOptode Meter Amplifier</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MR-Ch Small</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>MR-Ch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SensorTrace Rate Software</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroRespiration Rack</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>MR2-Rack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroRespiration Stirrer</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>MR2-Co</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microdissection system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coarse Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pneumatic Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-11-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TransferTip (ES)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5175107004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating teliospore germination using microrespiration analysis and microdissection

Champignons du charbon sont les agents étiologiques de plusieurs maladies agricoles dévastateurs. Ils sont caractérisés par la production de téleutospores, qui sont des agents de dispersion à parois épaisses. Téliospores peuvent rester dormants pendant des décennies. La dormance est caractérisée par faibles taux métaboliques, suspendu la biosynthèse macromoléculaire et grandement réduit les niveaux de la respiration. À la réception des signaux environnementaux requis, téleutospores germent pour produire des cellules haploïdes, qui peuvent initier de nouveaux cycles d’infection. La germination des téliospores se caractérise par la reprise de biosynthèse macromoléculaire, une augmentation de la respiration et remaniements morphologiques. Afin de mesurer avec précision les changements dans la respiration cellulaire durant les premiers stades de la germination, nous avons développé un protocole simple utilisant un respiromètre Clark-type. Les derniers stades de la germination sont distinguent par des changements morphologiques spécifiques, mais la germination est asynchrone. Nous avons développé une technique de microdissection qui nous permet de recueillir des téliospores aux stades de germination distinctes.

Utilisant la méthode de base microrespirometer Clark-type de mesurer les changements dans la respiration au cours de la germination et la dormance téliospores, nous a confirmé que les dormants téliospores présentent un faible niveau de la respiration (~ 1 075 µmol/h/mg), comparée à germer téliospores (~ 2 614 µmol/h/mg ; Figure 1 a). Il s’agit d’un changement de ~2.4-fold taux moyen de la respiration entre téliospores dormants et téliospores ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection at JoVE.com

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Champignons du charbon causent de nombreuses maladies agricoles dévastateurs. Ils sont dispersés sous forme de téleutospores dormants qui germent en réponse à des stimuli environnementaux. Nous décrivons deux méthodes pour étudier les changements moléculaires au cours de la germination : augmentation de la respiration pour détecter l’activation métabolique de mesure et l’évaluation changeant des événements moléculaires en isolant les téleutospores aux stades morphologiques distincts.

Germination des téliospores chargée de l’enquête à l’aide de l’analyse Microrespiration et Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Microdissection laser des tissus de mammifères

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Recherche

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

À long terme, à haute résolution d&#39;imagerie confocal Time Lapse d&#39;<em&gt; Cotylédon Arabidopsis</emEpiderme&gt; cours de germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Étudier les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l&#39;utilisation des Métazoaires organisme modèle<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Isolement de l&#39;ARN à partir de sous-populations cellulaires spécifiques en utilisant le laser capture microdissection Combiné avec Rapid immunomarquage

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Cryosectioning Méthode de microdissection de murin côlon Muqueuse

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Protocole de laboratoire pour les Analyses de contenu Gut génétiques de macroinvertébrés aquatiques Using Group-specific ADNr amorces

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...