Name: investigating teliospore germination using microrespiration analysis and microdissection
Uploaded: 2018-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection at JoVE.com

Wir möchten danken Dr. Paul Frost für den Gebrauch von seinem Microrespirometer und Nicole Wagner und Alex Bell für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde finanziert durch einen NSERC Grant, b.

(1) Corn Cob Infektion
<ol><li>Zea Mays (CV Golden Bantam) wachsen bis Kolben gebildet sind und damit, Seide (ca. 60 Tage begonnen haben).</li>
	<li>Kultur kompatibel haploiden U. Maydis Stämme mit Standardprotokollen wie zuvor beschrieben7.</li>
	<li>Maiskolben mit Standardprotokollen wie zuvor beschriebenen7zu infizieren.</li>
</ol>2. Teliospore Ernte
<ol><li>Autoklaven-Ausrüstung (Büchner Trichter, Büchner Flasks, Mixer, ...

<ol>
	<li>Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. , 411-460 (2012).</li><li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Monograph Number 2. , (1963).</li><li>Caltrider, P. D., Gottlieb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+activity+and+enzymes+for+glucose+catabolism+in+fungal+spores.">Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores.</a> Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).</li><li>Allen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+aspects+of+spore+germination+in+fungi.">Metabolic aspects of spore germination in fungi.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+tumours.">Metabolism of tumours.</a> Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).</li><li>Ostrowski, L. A., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+antisense+transcripts+are+linked+to+the+modulation+of+mitochondrial+function+and+teliospore+dormancy+in+Ustilago+maydis.">Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis.</a> Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).</li><li>Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+genes+expressed+in+the+Ustilago+maydis+dikaryon:+uncovering+a+novel+class+of+pathogenesis+genes.">Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).</li><li>Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unh1,+an+Ustilago+maydis+Ndt80-like+protein,+controls+completion+of+tumor+maturation,+teliospore+development,+and+meiosis.">Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis.</a> Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).</li><li>Stade, S., Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+during+fungal+spore+germination:+respiration+and+cytochrome+c+oxidase+in+Neurospora+crassa.">Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa.</a> J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).</li><li>Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+developing+mitochondrial+genetic+and+respiratory+functions+in+germinating+fungal+spores.">Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).</li><li>Sacadura, N. T., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+EST+analyses+of+Ustilago+maydis+germinating+teliospores.">Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores.</a> Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).</li><li>Hilderbrand, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+isolation+of+single+microorganisms.">Techniques for the isolation of single microorganisms.</a> Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).</li><li>Seto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , (2013).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H., K&#246;nig, H., Varma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. , 425-437 (2006).</li><li>Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+spore+isolation+of+fungi.">Single spore isolation of fungi.</a> Fungal Diversity. 3, 11 (1999).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+with+yeast.">Getting started with yeast.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).</li><li>Chen, Y., Seguin-Swartz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+viability+of+fungal+spores.">A rapid method for assessing the viability of fungal spores.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).</li></ol>

Basidiomycete biotrophe Pflanzenpathogene verursachen jährlich Milliarden von Dollar in Ernteausfälle. Die überwiegende Mehrheit dieser Erreger produzieren Brandsporen, die integraler Bestandteil der Pilz Zerstreuung und geschlechtliche Fortpflanzung. Bei der Entwicklung und Keimung der Brandsporen zu gewinnen ist entscheidend für das Verständnis der Ausbreitung der verheerenden Krankheiten verursacht durch diese Pilze. Um molekulare Veränderungen an wichtigen Kontrollpunkten zu ermitteln haben wir eine Methode, um...

Die Brandpilze (Ustilaginales) bestehen aus über 1.600 Arten, die Gräser, einschließlich der wichtigen Getreide Mais, Gerste und Weizen, verursacht Milliarden von Dollar in Ernteverluste zu infizieren jährlich1. Diese Pilze sind gekennzeichnet durch die Produktion von Brandsporen, die haben Zellwände dunkel pigmentiert und sind die Agenten der Zerstreuung. Brandsporen um genetische Material bei den Belastungen der Verbreitung zwischen Wirtspflanzen Schild funktionieren und können in einem schlafenden Zustand für Jahre2bestehen. Als solche sind Brandsporen ein wesentlicher Bestandteil der Ausbreitung der Krankheit.
Um Teliospore Biologie zu studieren, nutzt unser Labor Modell Smut Pilz Ustilago Maydis (U. Maydis), die der kausalen Agent der Krankheit "gemeinsame Smut von Mais" ist. Reifen U. Maydis Brandsporen zeichnen sich durch Wachstum Verhaftung, reduzierte Zellstoffwechsel und geringe Zellatmung3. Bei günstigen Umweltbedingungen (zB., das Vorhandensein von bestimmten Zuckern), U. Maydis Brandsporen Keimen und komplette Meiose, Herstellung von forstwirtschafter die neue Verhandlungsrunden Infektion auslösen können. Keimung zeichnet sich durch erhöhte Atmung, die Rückkehr zur metabolischen Aktivität und das Fortschreiten durch erkennbare morphologische Stadien der Keimung4.
Die erste Phase der Keimung umfasst erhöhte Atmung und Stoffwechsel-Funktion, es gibt jedoch keine morphologischen Hinweise auf Veränderungen. Das original der Atemwege Änderung U. Maydis vor über 50 Jahren Messungen wurden Sauerstoffverbrauch manometrically mit einem Warburg Kolben Apparat5messen. Wir haben eine neue, einfache Methode des Studiums präziser Änderungen in der Atmung während der Keimung der Teliospore durch die Messung von Sauerstoff-Verbrauch über einen zeitlichen Verlauf der Keimung mit einem Clark-Typ-Microrespirometer entwickelt. Wir zuvor verwendet diese Methode, Veränderungen der Atemfrequenz zwischen Wildtyp studieren U. Maydis haploiden Zellen und Mutanten mit defekte Mitochondrien6, und haben das Protokoll hier angepasst, um Veränderungen in der Teliospore Atmung während zu studieren Keimung. Dadurch können das Timing der Atmung Änderung genau zu identifizieren, so dass wir zum gegebenen Zeitpunkt nach der Einleitung der Keimung zu frühen molekularen Ereignisse untersuchen Brandsporen ausrichten können. Das Fortschreiten der Keimung kann mikroskopisch verfolgt werden, sobald der Promycelia ergibt sich aus der Teliospore, aber die asynchrone Natur, die Isolation der genug Brandsporen zu einem gegebenen Zeitpunkt für die Untersuchung gehemmt. Wir entwickelten eine Mikrodissektion Technik ähnlich denen für die in-vitro- Befruchtung, um körperlich Brandsporen an verschiedene morphologische Stadien der Keimung zu sammeln.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:437px;">Streptomycin Sulfate</td>
			<td style="width:75px;">BioShop</td>
			<td style="width:124px;">STP101</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L Waring Laboratory blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>7011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cheesecloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5310-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unisense MicroRespiration system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">MicroRespiration Sensor (O2)</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>OX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroOptode Meter Amplifier</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MR-Ch Small</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>MR-Ch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SensorTrace Rate Software</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroRespiration Rack</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>MR2-Rack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroRespiration Stirrer</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>MR2-Co</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microdissection system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coarse Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pneumatic Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-11-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TransferTip (ES)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5175107004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating teliospore germination using microrespiration analysis and microdissection

Brandpilze sind die ätiologischen Agenten mehrere verheerende landwirtschaftliche Krankheiten. Sie zeichnen sich durch die Produktion von Brandsporen, die dickwandigen Zerstreuung Agenten sind. Brandsporen können jahrzehntelang inaktiv bleiben. Die Keimruhe zeichnet sich durch niedrige Stoffwechselrate, Makromolekulare Biosynthese angehalten und Ebenen der Atmung stark reduziert. Nach Erhalt der erforderlichen Umweltsignale, Keimen Brandsporen um haploide Zellen zu produzieren, die neue Verhandlungsrunden Infektion auslösen kann. Teliospore Keimung zeichnet sich durch die Wiederaufnahme der makromolekularen Biosynthese, erhöhte Atmung und dramatische morphologische Veränderungen. Um Veränderungen der Zellatmung in den frühen Stadien der Keimung genau zu messen, haben wir ein einfaches Protokoll mit einem Clark-Typ Respirometer entwickelt. Die späteren Stadien der Keimung zeichnen sich durch spezifische morphologische Veränderungen, aber Keimung ist asynchron. Wir entwickelten eine Mikrodissektion-Technik, die es ermöglicht uns Brandsporen auf unterschiedliche Keimung Stufen zu sammeln.

Mit der Clark-Typ Microrespirometer-basierte Methode zur Messung der Veränderungen der Atmung während der Vegetationsruhe Teliospore und Keimung, bestätigt wir, dass schlafende Brandsporen ein niedriges Niveau der Atmung (~ 1.075 µmol/h/mg weisen) im Vergleich zu keimen Brandsporen (~ 2.614 µmol/h/mg; Abbildung 1A). Dies stellt eine ~2.4-fold Änderung im durchschnittlichen Rate von Atmung zwischen schlafenden Brandsporen und Brandsporen, die induziert w...

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Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Brandpilze verursachen viele verheerende landwirtschaftliche Krankheiten. Sie sind als schlafenden Brandsporen zerstreut, die als Reaktion auf ökologische Hinweise zu keimen. Wir skizzieren zwei Methoden zur Untersuchung von molekularer Veränderungen während der Keimung: Atmung Erhöhung um Stoffwechselaktivierung erkennen Messung und Bewertung von molekularen Ereignisse durch die Isolierung Brandsporen in verschiedenen morphologischen Stadien ändern.

Untersuchung von Teliospore Keimen mit Microrespiration Analyse und Mikrodissektion

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Capture Mikrodissektion von Säugetiergewebe

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Forschung

Biologie

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Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

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Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

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Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

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The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

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Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

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Laser Capture Microdissection von hochreinen trabekuläre Geflecht aus Maus Augen für Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...