Name: investigating teliospore germination using microrespiration analysis and microdissection
Uploaded: 2018-05-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Paul Frost para uso de seu microrespirometer e Nicole Wagner e Alex Bell para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por uma bolsa NSERC para B.J.S.

1. infecção de espiga de milho
<ol><li>Crescer Zea mays (CV. Golden Bantam) até que as espigas são formadas e começaram a seda (aproximadamente 60 dias).</li>
	<li>Cultura haploides compatíveis U. maydis cepas usando protocolos padrão como anteriormente descrito7.</li>
	<li>Infectar as espigas de milho usando protocolos padrão, como descrito anteriormente,7.</li>
</ol>2. teliospore colheita
<ol><li>Equipamento de autocla...

<ol>
	<li>Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E., Swan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. , 411-460 (2012).</li><li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Monograph Number 2. , (1963).</li><li>Caltrider, P. D., Gottlieb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+activity+and+enzymes+for+glucose+catabolism+in+fungal+spores.">Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores.</a> Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).</li><li>Allen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+aspects+of+spore+germination+in+fungi.">Metabolic aspects of spore germination in fungi.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 3, 313-342 (1965).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+tumours.">Metabolism of tumours.</a> Biochemische Zeitschrift. 142, 317-333 (1923).</li><li>Ostrowski, L. A., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+antisense+transcripts+are+linked+to+the+modulation+of+mitochondrial+function+and+teliospore+dormancy+in+Ustilago+maydis.">Natural antisense transcripts are linked to the modulation of mitochondrial function and teliospore dormancy in Ustilago maydis.</a> Mol Microbiol. 103 (5), 745-763 (2017).</li><li>Morrison, E. N., Donaldson, M. E., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+genes+expressed+in+the+Ustilago+maydis+dikaryon:+uncovering+a+novel+class+of+pathogenesis+genes.">Identification and analysis of genes expressed in the Ustilago maydis dikaryon: uncovering a novel class of pathogenesis genes.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 34 (3), 417-435 (2012).</li><li>Doyle, C. E., Cheung, H. Y. K., Spence, K. L., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unh1,+an+Ustilago+maydis+Ndt80-like+protein,+controls+completion+of+tumor+maturation,+teliospore+development,+and+meiosis.">Unh1, an Ustilago maydis Ndt80-like protein, controls completion of tumor maturation, teliospore development, and meiosis.</a> Fungal Genetics and Biology. 94, 54-68 (2016).</li><li>Stade, S., Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+during+fungal+spore+germination:+respiration+and+cytochrome+c+oxidase+in+Neurospora+crassa.">Mitochondrial biogenesis during fungal spore germination: respiration and cytochrome c oxidase in Neurospora crassa.</a> J Bacteriol. 147 (3), 757-767 (1981).</li><li>Brambl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+developing+mitochondrial+genetic+and+respiratory+functions+in+germinating+fungal+spores.">Characteristics of developing mitochondrial genetic and respiratory functions in germinating fungal spores.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (2), 175-186 (1975).</li><li>Sacadura, N. T., Saville, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+and+EST+analyses+of+Ustilago+maydis+germinating+teliospores.">Gene expression and EST analyses of Ustilago maydis germinating teliospores.</a> Fungal Genet Biol. 40 (1), 47-64 (2003).</li><li>Hilderbrand, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+isolation+of+single+microorganisms.">Techniques for the isolation of single microorganisms.</a> Botanical Review. 4 (12), 38 (1938).</li><li>Seto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of gene transcripts during Ustilago maydis teliospore dormancy and germination. , (2013).</li><li>Fr&#246;hlich, J., K&#246;nig, H., K&#246;nig, H., Varma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soil Biology - Intestinal Microorganisms of Termites and Other Invertebrates. , 425-437 (2006).</li><li>Choi, Y., Hyde, K., Ho, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+spore+isolation+of+fungi.">Single spore isolation of fungi.</a> Fungal Diversity. 3, 11 (1999).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started+with+yeast.">Getting started with yeast.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Pt B. 350, 3-41 (2002).</li><li>Chen, Y., Seguin-Swartz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+assessing+the+viability+of+fungal+spores.">A rapid method for assessing the viability of fungal spores.</a> Canadian Journal of Plant Pathology-Revue Canadienne De Phytopathologie. 24 (2), 230-232 (2002).</li></ol>

Patógenos de vegetais basidiomiceto biotrófica causam bilhões de dólares em perdas de safra anualmente. A grande maioria desses patógenos produzem teliospores que são parte integrantes de fungo dispersão e reprodução sexual. Ganhar o conhecimento do desenvolvimento e germinação de teliospores é fundamental para entender a propagação das doenças devastadoras causadas por estes fungos. A fim de identificar alterações moleculares em pontos chave controle criámos um método para identificar o momento de mud...

Os fungos (Ustilaginales) consistem em mais de 1.600 espécies que infectam de gramíneas, incluindo as importante cereais de milho, cevada e trigo, causando bilhões de dólares em perdas de safra anualmente1. Estes fungos são caracterizados pela produção de teliospores, que tem sombriamente pigmentado paredes celulares e são os agentes de dispersão. Teliospores a função de proteger o material genético durante o stress da dispersão entre plantas hospedeiras e pode persistir em um estado dormente por anos2. Como tal, teliospores são um componente essencial da propagação da doença.
A fim de estudar Biologia teliospore, nosso laboratório utiliza o fungo de obscenidade modelo Ustilago maydis (U. maydis), que é o agente causal da doença 'ferrugem comum do milho'. Maduras U. maydis teliospores caracterizam-se pela detenção de crescimento, metabolismo celular reduzido e baixos níveis de respiração celular3. Em condições ambientais favoráveis (ex., a presença de açúcares específicos), U. maydis teliospores germinar e completar basidiósporos meiose, produzindo que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação é caracterizada por aumento da respiração, a atividade de retorno para metabólica e a progressão por etapas morfológicas observáveis de germinação4.
A fase inicial de germinação inclui aumento da respiração e função metabólica, no entanto, não há morfológicos indícios de mudança. As originais de alteração respiratória em U. maydis foram efectuadas medições mais de 50 anos atrás, medição do consumo de oxigênio manometrically com um balão de Warburg aparelho5. Nós desenvolvemos um método de estudar alterações precisas na respiração durante a germinação de teliospore pela medição do consumo de oxigênio durante um tempo de germinação, usando um microrespirometer de Clark-tipo novo, simples. Anteriormente, usamos este método para estudar alterações na frequência respiratória entre o selvagem-tipo U. maydis células haploides e mutantes com mitocôndrias defeituosas6e adaptaram o protocolo aqui para estudar alterações na respiração teliospore durante germinação. Isso fornece um meio de identificar com precisão o momento da mudança de respiração para que nós pode direcionar teliospores no momento oportuno, após o início da germinação para investigar eventos moleculares precoce. A progressão de germinação pode ser seguida ao microscópio uma vez que o promycelia emerge o teliospore, mas a natureza assíncrona inibiu o isolamento de bastante teliospores em uma determinada fase para investigação. Desenvolvemos uma técnica de microdissection similar àqueles usados para fertilização in vitro para coletar fisicamente teliospores em distintas fases morfológicas da germinação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:437px;">Streptomycin Sulfate</td>
			<td style="width:75px;">BioShop</td>
			<td style="width:124px;">STP101</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>KAN201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potato Dextrose Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>254920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L Waring Laboratory blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>7011S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cheesecloth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5310-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Unisense MicroRespiration system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">MicroRespiration Sensor (O2)</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>OX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroOptode Meter Amplifier</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MR-Ch Small</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>MR-Ch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SensorTrace Rate Software</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroRespiration Rack</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>MR2-Rack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroRespiration Stirrer</td>
			<td>Unisense</td>
			<td>MR2-Co</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microdissection system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coarse Manipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMN-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MMO-202ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pneumatic Microinjector</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-11-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TransferTip (ES)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5175107004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating teliospore germination using microrespiration analysis and microdissection

Fungos são os agentes etiológicos de várias doenças agrícolas devastadores. Eles são caracterizados pela produção de teliospores, que são agentes de dispersão de paredes grossas. Teliospores podem permanecer dormentes por décadas. A dormência é caracterizada por baixas taxas metabólicas, pausado biossíntese macromolecular e reduzido os níveis de respiração. Ao receber sinais ambientais necessários, teliospores germinam para produzir células haploides, que podem iniciar novas rodadas de infecção. Germinação de teliospore caracteriza-se pela retomada de biossíntese macromolecular, aumento da respiração e dramáticas mudanças morfológicas. Para medir precisamente as alterações na respiração celular durante os estágios iniciais de germinação, nós desenvolvemos um protocolo simples, empregando um respirometer Clark-tipo. Os estagios de germinação são distinguidos por alterações morfológicas específicas, mas a germinação é assíncrona. Desenvolvemos uma técnica de microdissection que nos permitirá coletar teliospores em fases distintas de germinação.

Usando o método de Clark-tipo com base em microrespirometer de medir as mudanças na respiração durante a dormência teliospore e germinação, Confirmámos que dormente teliospores apresentam um baixo nível de respiração (~ 1.075 µmol/h/mg), comparado a germinação teliospores (~ 2.614 µmol/h/mg; Figura 1A). Isto representa uma mudança de ~2.4-fold em média taxa de respiração entre dormentes teliospores e teliospores que têm sido induzidos a ge...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection at JoVE.com

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Fungos causam muitas doenças agrícolas devastadores. Eles estão dispersos como teliospores latentes que germinam em resposta aos sinais ambientais. Nós esboçamos dois métodos para investigar mudanças moleculares durante a germinação: aumento da respiração para detectar ativação metabólica de medição e avaliar alterar eventos moleculares isolando teliospores em fases morfológicas distintas.

Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser Microdissecção Captura de tecidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...