Name: isolation of enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of the adult mouse
Uploaded: 2018-08-15T13:00:00
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저자는 인정 (JLM)에 R37 DK045729, R01 AR060837 (HX)를 미시간 위장 연구 센터 분자 코어 P30 DK034933의 대학에서 지원 하고자 합니다.

설명 하는 모든 동물 실험 동물의 관리 및 사용에 미시간 대학 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 멸 균 폴 리-D-리 (PDL)와 Laminin 솔루션의 준비
<ol><li>셀 격리 전에 적어도 1 일 폴 리-D-리 (PDL)와 laminin 코팅 접시를 준비 합니다. 참고: 6-잘, 12-잘 접시 실험 목표에 따라 준비 되었다. 일반적으로 12-잘 접시 서쪽 오 점;를 사용 하 여 정량 분석을 위해 사용 했다 반면, 6 잘 플레이트 im...

<ol>
	<li>Grubisic, V., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia:+the+most+alimentary+of+all+glia.">Enteric glia: the most alimentary of all glia.</a> Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).</li><li>Rao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Glia+Regulate+Gastrointestinal+Motility+but+Are+Not+Required+for+Maintenance+of+the+Epithelium+in+Mice.">Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice.</a> Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).</li><li>Rao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+express+proteolipid+protein+1+and+are+a+transcriptionally+unique+population+of+glia+in+the+mammalian+nervous+system.">Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system.</a> Glia. , (2015).</li><li>McClain, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++responses+in+enteric+glia+are+mediated+by+connexin-43+hemichannels+and+modulate+colonic+transit+in+mice.">Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice.</a> Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).</li><li>Cunha Franceschi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+reactivity+to+systemic+LPS+administration+Changes+in+GFAP+and+S100B+protein.">Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein.</a> Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).</li><li>Kabouridis, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+controls+the+homeostasis+of+glial+cells+in+the+gut+lamina+propria.">Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria.</a> Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).</li><li>Yu, Y. B., Li, Y. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+Glia:+The+Origin+of+Duodenal+Gastrinomas?.">Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?.</a> Gastroenterology. , (2017).</li><li>Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+preparation+of+isolated+enteric+neurons+and+glia+from+the+myenteric+plexus+of+the+adult+mouse.">An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Fried, D. E., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+of+the+enteric+nervous+system.">In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).</li><li>Bernstein, C. N., Vidrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+identification,+and+culture+of+normal+mouse+colonic+glia.">Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia.</a> Glia. 12 (2), 108-116 (1994).</li><li>Jaeger, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+enteric+ganglia+from+the+myenteric+plexus+of+adult+rats.">Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats.</a> Journal of Neural Transplantation &amp; Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).</li><li>Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+enteric+glia+and+GDNF+during+gut+inflammation.">Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation.</a> BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).</li><li>Rosenbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Myenteric+Glia+during+Acute+Inflammation+In+Vitro+and+In+Vivo.">Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo.</a> Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).</li><li>Zhuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hGFAP-cre+transgenic+mice+for+manipulation+of+glial+and+neuronal+function+in+vivo.">hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo.</a> Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).</li><li>Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+phenotypic+plasticity+of+glial+cells+in+the+mammalian+enteric+nervous+system.">Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system.</a> Glia. 63 (2), 229-241 (2015).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Kabouridis, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+keeps+enteric+glial+cells+on+the+move;+prospective+roles+of+the+gut+epithelium+and+immune+system.">The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system.</a> Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).</li><li>Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+neurally+related+laminin+binding+protein+by+neural+crest-derived+cells+that+colonize+the+gut:+relationship+to+the+formation+of+enteric+ganglia.">Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia.</a> The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).</li></ol>

EGCs 직감 항상성에 중요 한 역할 그리고 분리 하 고 그들 에 체 외연구 필수적 이다. 이 프로토콜에서 성인 마우스 내장의 lamina propria에서 EGCs를 격리 하기 위한 간단한 방법 장 폐해 기능을 공부 도입 되었다.
면봉으로 부착 mesentery와 LMMP를 제거 경도 원형 근육 사이 있는 간 myenteric 명과의 일부를 제거, 버퍼 submucosal 표면에의 접근성 증가 하 고 많은 큰 모세 혈관을 제거...

장의 glial 세포 (EGCs)의 기능에 대 한 관심 용기 무결성 및 항상성1,2에 그들의 인식된 역할 때문에 꾸준히 증가 했다. 또한, EGCs GI로3,4의 길이 따라 위치에 따라 다릅니다. EGCs glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF) 등 다양 한 영양 요인 해제, 운동1,5 를 직감 하 고 미생물 부산물6,7에 응답을. 연구는 EGC 인구는 이기종 및 그들의 기능 여부 submucosal 또는 myenteric 총1,7내 따라 나타내 었 다. 예를 들어 내는 submucosa EGCs 꽉 접속점8에 기여 한다. 차동 GFAP 표현과 EGCs 인 산화가 장애9의 본질적인 표현 형에 그들의 가능한 연결을 제안 하는 파 킨 슨 병에 연결 되었습니다. 최근, 인접 장 submucosa에서 EGCs의 고립 된 문화에 있는 핵 단백질 menin의 손실을 했다 호르몬 gastrin10의 식을 유도 하기에 충분 한 관찰 되었다. 결과적으로, 그것은 EGCs 십이지 장 gastrinomas, 신경 내 분 비 종양10의 종류의 수 있습니다 제안 했다. 샨 다, 이러한 예 절연된 EGCs neuropathic 질환 및 암11의 기능과 동작의 관련성 밑줄.
필드에 도전 중 하나 또는 모두 EGC 인구에서 생체 외에서연구를 격리 하는 방법 남아 있습니다. 혈통 추적 실험 submucosa 및 lamina propria EGCs myenteric 총7에 조상 세포에서 발생 설명 했다. 여러 게시 된 격리 프로토콜 myenteric EGCs12,13,14,15,,1617의 문화를 생성 하는 사용할 수는 있지만 18,19, 아무도 특히 submucosal/lamina propria EGC 인구의 격리 대상. EGC 격리에 대 한 기존 프로토콜은 특별히 기계적 분리의 조합 또는 효소 분리, 점 막 세포 층을 결국 삭제와 함께 부드러운 근육의 기정을 사용 합니다.
이 원고의 목표 비 효소 lamina propria 생체 외에서 연구에서 기본 EGCs를 분리 하는 단계를 설명 하는 것입니다. 특별히 그는 submucosa에서 myenteric EGCs 구별 없는 마커 때문 평활 근에서 상피 점 막의 공간 분리 submucosal EGCs을 악용 했다. 또한, EDTA chelation 비 효소 분리와 결합 하 여 EGCs 관련된 인터 myenteric EGCs 함께 삭제 되었다 부드러운 근육 달리 submucosa 격리 했다. Submucosa의 lamina propria EGCs 더 분리 glial 세포 친화적인 기판, 예를 들어, 폴 리-D-리 신과 laminin에 세포 배양에 의해 발생 했습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-D lysine (1 mg/ml stock)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Dilute 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (0.5 mg/ml stock)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4544</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL on ICE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (0.5M)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td>Dilute 1:100 in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>36216004</td>
			<td>Dilute 1:100 in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50mg/mL stock)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF (10 &#181;g stock)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SRP3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM stock)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFAP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-10004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-a-Smooth Muscle Actin&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab112022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Pgp9.5&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB600-1160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-E-cadherin&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit S100&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse p75 NTR&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R-37119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone (Amphotericin B) 250 &#181;g/ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Fura-2-AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK peptide</td>
			<td>Anaspec, Fremont, CA</td>
			<td>AS-20741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin peptide (Gastrin-17)</td>
			<td>Abbiotec, Bloomington, IN</td>
			<td>350188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Celll Strainer (100 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Celll Strainer (40 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serologic Pipet 5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of enteric glial cells from the submucosa and lamina propria of the adult mouse

신경 세포 및 평활 근 벽, submucosa 및 lamina propria 상주 장 glial 세포 (EGCs) 장 신 경계 (ENS)에 의하여 이루어져 있다. EGCs 다양 한 영양 요인의 출시를 통해 직감 항상성에서 중요 한 역할을 하 고 상피 방 벽의 무결성을. 기본 장 폐해 문화의 대부분 연구 사용 세포 효소 분리 후 myenteric 총에서 분리. 여기, 격리 하 고 장 submucosa 및 lamina propria EGCs 문화 비 효소 방법 설명 되어 있습니다. 경도 근육 층의 수동 제거 후 EGCs lamina propria submucosa 상용 비 효소 세포 복구 솔루션에 외피 다음 순차 HEPES 버퍼링 EDTA 외피를 사용 하 여에서 해방 되었다. EDTA 외피 세포 복구 솔루션 submucosal EGCs 해방 수 있도록 lamina propria에서 상피 점 막의 대부분을 제거 하기에 충분 했다. 모든 잔여 lamina propria와 부드러운 근육 myenteric 명과 함께 삭제 되었다. EGCs 쉽게 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)를 표현 하는 그들의 능력에 의해 확인 되었다. 세포 현 탁 액의 약 50% 포함 된 GFAP + 셀 조직 외피를 완료 한 후 폴 리-D-리/laminin 기판에 도금 하기 전에. 그러나, glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)에서 세포 배양의 3 일 후-문화 미디어를 포함, 기판 코팅 판에 고착 하는 세포 인구 구성 > 95% 장 명과. 우리는 hGFAP-Cre 마우스 GFAP + 생 세포 형광을 사용 하 여 셀의 비율을 추적 하는 사 tdTomato 기자 라인을 사육 하 여 하이브리드 마우스 라인을 만들었습니다. 따라서, 비-myenteric 장 명과 비 효소 방법으로 격리 하 고 적어도 5 일 동안 배양 될 수 있습니다.

Preps는 GFAP + 셀 준수 하지 않았고 24 h (그림 4A) 내에서 확산 하는 경우 실패 한 고려 되었다. Glial 세포 수 전지와 준수 플랫 집계 (그림 4B)으로 확산의 증거를 보여주었다 때 24 h 이후까지 확인할 수 없습니다. 클러스터의 가장자리에 세포는 긴 프로세스를 확장 하는 경향이 하 고 고전적인 glial 마커, 예를 들어, GFAP, S100b 및...

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Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

여기, 우리 장 submucosa 순차적 EDTA 외피를 사용 하 여 divalent 양이온 그리고 외피 비 효소 세포 복구 솔루션에 킬레이트 하에서 장 glial 세포의 설명. 폴 리-D-리 신과 laminin에 결과 세포 현 탁 액을 도금 기능 분석을 위한 submucosal glial 세포의 매우 풍부한 문화에 발생 합니다.

Submucosa 및 성인 마우스의 Lamina Propria 장의 Glial 세포의 고립

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

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연구

생물학

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Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

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Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

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분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

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Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

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Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

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성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

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