Name: protrusion force microscopy: a method to quantify forces developed by cell protrusions
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions at JoVE.com

Les auteurs sont reconnaissants envers Anna Labernadie, Guillaume Charrière et Patrick Delobelle pour leur contribution initiale à ce travail et à Matthieu Sanchez et Françoise Viala pour leur aide avec vidéo de tournage et de montage. Ce travail a été soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan Cancer, Fondation Toulouse Cancer et Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).

1. préparation des grilles Formvar-enduit
<ol><li>Nettoyer les grilles de la microscopie électronique avec de l’acétone pur et séchez-les sur du papier filtre. Puis nettoyez avec de l’éthanol pur, une lame de microscope, essuyer avec un papier de lentille et enlever la poussière avec un ventilateur.</li>
	<li>Placez une lamelle de verre nettoyé à l’éthanol verticalement dans l’entonnoir d’un film de dispositif de moulage contenant une solution de Formvar dans la partie inférieure. Recouvrir le haut ...

<ol>
	<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate.">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype.">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification.">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease.">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li><li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration.">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li><li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Forces+in+Cell+Biology.">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li><li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes.">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343 (2014).</li><li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+Together:+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors.">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li><li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking.">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li><li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis.">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li><li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments.">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li><li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A.">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li><li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Macrophage+3d+Migration:+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration.">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li><li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+(Wasp)+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function.">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li><li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+Podosomes+Go+3d.">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li><li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages:+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures.">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li><li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages.">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li><li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podosome+Force+Generation+Machinery:+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring.">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li><li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells.">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li><li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes.">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li><li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory/Effector+T+Cells.">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li><li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion.">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li><li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts.">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li><li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion.">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li><li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis.">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li></ol>

Propriétés des matériaux
Le choix du matériau de la membrane déformable, dans notre cas Formvar, il faut remplir quelques conditions. Le matériel doit être transparent à la lumière visible et fluorescence auto limitée pour permettre des observations dans le champ lumineux et la microscopie de fluorescence. La rugosité de la couche mince doit être bien inférieure à 10 nm pour éviter tout effet topographique sur l’adhérence des cellules et permettre à claire o...

Les cellules animales interagissent physiquement avec la matrice et les autres cellules qui constituent leur environnement1. Cela est nécessaire à leur migration, internaliser les organes, acquérir de l’information externe ou différencier. Dans ces processus, la cellule doit générer des forces mécaniques et, comme de nombreuses études ont montré ces dernières années, la capacité d’une cellule pour générer des forces et sonde son environnement influe sur son comportement biologique, mise en scène par exemple prolifération ou différenciation2,3. À son tour, la mesure des forces cellulaires est une aide importante pour étudier la régulation de la production de force et de comprendre son implication dans la cellule comportement et tissu sort4,5.
Ces dernières années ont vu le développement de nombreuses techniques pour mesurer les forces qu’une cellule peut exercer sur son environnement6. La majorité d'entre eux ont contribué à révéler que la traction des forces que les cellules exercent comme ils tirent sur les sondes mobiles ou un substrat déformable. Cependant, les forces mécaniques impliquées en saillie dans l’environnement extracellulaire souffrent d’un manque de techniques de mesure et sont à ce jour n’est pas bien caractérisé.
Pour contourner cette limitation, nous présentons une méthode pour mesurer les forces exercées perpendiculairement au substrat. Il consiste en la plaquant sur une mince feuille élastique qui peut se déformer dans la direction orthogonale, ce qui permet de mesurer la déformation du substrat par les cellules et en déduire les forces en présence, les cellules vivantes. Topographie de substrat est mesurée à l’échelle nanométrique de résolution à l’aide de la microscopie à force atomique et de l’évaluation des forces de déformation s’appuie sur la connaissance de la géométrie des structures cellulaires protrusive7,8, 9.
Nous décrivons ici le programme d’installation et de son application pour mesurer les forces générées par les podosomes, structures d’adhérence protrusive formés par les macrophages pour leur migration mésenchymateuse dans des environnements en trois dimensions10,11, 12,13,14,15,16,17. Nous pensons que cette technique fera progresser la compréhension de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">200 mesh nickel grids</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">G200-Ni</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:216px;">Filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:216px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10235612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">White stickers 26 x 70 mm</td>
			<td style="width:71px;">Avery</td>
			<td style="width:119px;">DP033-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Film casting device with valve in its outlet</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71305-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Razorblades</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">1.08543.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetone</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20066.321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12 mm coverslips</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Axiovert 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:71px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NanoWizard III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Temperature-controlled sample holder&#160;</td>
			<td style="width:71px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:119px;">BioCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m</td>
			<td style="width:71px;">Veeco Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MLCT-AUHW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Double-sided adhesive tape</td>
			<td style="width:71px;">APLI AGIPA</td>
			<td style="width:119px;">118100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:216px;">FCS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:216px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protrusion force microscopy: a method to quantify forces developed by cell protrusions

Dans nombreux contextes biologiques, cellules animales ont besoin d’interagir physiquement avec leur environnement en développant des forces mécaniques. Parmi ceux-ci, les forces de traction ont été bien caractérisés, mais il y a un manque de techniques permettant de mesurer les forces de protrusion exercée par les cellules orthogonalement à leur substrat. Nous avons conçu un montage expérimental pour mesurer les forces de protrusion exercées par les cellules adhérentes sur leur substrat. Les cellules plaqués sur une feuille de Formvar conforme déforment ce substrat et la topographie qui en résulte est mappée par microscopie à force atomique (AFM) à l’échelle du nanomètre. Valeurs de force sont alors extraites de l’analyse de la déformation de profil basé sur la géométrie des structures cellulaires protrusive. Par conséquent, les forces exercées par les différentes unités qui dépasse d’une cellule vivante peuvent être mesurées au fil du temps. Cette technique va permettre l’étude de la mise sur pied et sa régulation dans les nombreux processus cellulaires impliquant la saillie. Nous décrivons ici son application pour mesurer les forces protrusive générés par podosomes formé par les macrophages humains.

Le protocole ci-dessus décrit comment préparer le montage expérimental de quantifier protrusion forces exercées par les macrophages podosomes sur un substrat de Formvar. Ceci est réalisé en utilisant le manuel de vol et est illustrée à la Figure 1.
Lorsqu’on analyse une image topographique des renflements sous podosomes en utilisant le logiciel de traitement de données JPK, un polynôme d...

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Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

Ici, nous détaillons les techniques expérimentales utilisées pour évaluer les forces de protrusion podosomes applicables sur un film compatible, de la préparation du film pour l’analyse automatique des images topographiques.

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