Name: immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af kreative materialer Discovery Program gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT og fremtidige planlægning (NRF-2017M3D1A1039421) og af Marine bioteknologi Program finansieret af de Ministeriet af oceaner og fiskeri, Republikken Korea og et tilskud (20150220).

Alle eksperimentelle procedurer herunder animalske håndtering, offer og orgel isolation blev udført i nøje overensstemmelse med reglerne i International Animal Care og brug Udvalget på Shanghai folkesundhed klinisk Center og Asan Medical Center. Undersøgelse-protokollen blev godkendt af de respektive udvalg på etik af dyr eksperimenter på Shanghai folkesundhed klinisk Center (mus protokolnummer: SYXK-2010-0098) og Asan Medical Center (2016-02-168).
1. forberedelse af materiale
<p clas...

<ol>
	<li>Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).</li><li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation.">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li><li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response.">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li><li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+soft+matter+lipid-DNA+nanoparticle+as+the+immunostimulant+via+multiple+routes+of+injection+in+vivo.">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science &amp; Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li><li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., F&#246;rster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease.">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li><li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat.">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li><li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes.">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General anesthesia of mice and rats. , (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Lab+Animal+Research.+Compound+Administration+I.">JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Lab+Animal+Research.+Compound+Administration+III.">JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li></ol>

Mange fremskridt inden for nanoteknologi og Immunologi har opnået gennem terapeutiske forskning medicinafgivelse og immunostimulation. Omhyggelig udvælgelse af injektion metode er kendt for at være vigtige for immunostimulation, som var genstand for den foreliggende undersøgelse.
Forskellige injektion ruter blev evalueret for et naturligt, ikke-giftige og biologisk nedbrydelige DNA-baseret materiale, INP (immunstimulerende nanopartikel), til at bestemme, hvilken rute gav det bedste resulta...

Fremskridt inden for immunologi og nanomaterialer har ført til en overflod af potentielle nye terapeutiske strategier for programmer i biomedicin, herunder medicinafgivelse og immunostimulation. Optimering af ruten administration er et vigtigt aspekt, der påvirker effekten af immunstimulerende agenter. En immunstimulerende nanopartikel (INP) bestående af DNA er en nyudviklet nano-immune adjuverende selv samlet af microphase separation på grund af lipid-DNA1amphiphilic struktur. Derfor protokoller for INP involverer administrationen af de materielle1 i vivo via forskellige ruter, og tre procedurer for høst passende væv som den ingvinal lymfeknude (iLN), mediastinale LN (mio.), og milt, er beskrevet. Endelig blev disse væv analyseret for dendritiske celler (DC) aktivisering, de mest magtfulde antigen-præsenterer celler i immunsystemet. Denne protokol kan også anvendes til at vurdere antigener, antistoffer og andre immun adjuvanser2.
Vi testede INP formulering, fordi det er en agent, der har vist lovende. INP er en Toll-lignende receptor 9 (TLR9) adjuverende materiale, der indeholder nukleinsyrer, for hvilke vurderingen af immunostimulation effektivitet er forpligtet til at teste forskellige injektion metoder3. I denne sammenhæng er stimulation af DCs en potent slutpunkt i vivo evaluering. Efter antigen eller immunstimulerende molekyler er phagocytosed af DCs i perifere væv eller blod, vandrer disse celler til lymfoid organer som milt og LNs4,5. Således blev DC aktivering analyseret i milten, iLN og mLN af de injicerede dyr. Ordentligt høst af disse væv er derfor også afgørende for at vurdere immunrespons på en roman adjuverende eller patogener5. Sådanne væv høst er også vigtige for at udvikle en roman immunologiske metoder som en kræftbehandling. Denne protokol kan desuden bruges til at kontrollere effektiviteten af andre lægemidler, såsom anti-human immundefekt virus therapeutics6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Material</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate buffer saline</td>
			<td rowspan="2" style="width:96px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">21-040-CVR</td>
			<td rowspan="2">Washing organs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(PBS, pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">isoflurane solution&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Aesica Queenborough limited</td>
			<td style="width:119px;">26675-46-7</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tuberculin 1mL syringe -</td>
			<td style="width:96px;">Junglim</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">S.P.L</td>
			<td style="width:119px;">50050</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">1mL Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:96px;">(BD Ultra-FineTM&#173;II)_short needle</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Intramuscular Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:96px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30081.01</td>
			<td>Storing organs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Histopaque</td>
			<td style="width:96px;">&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10771</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Daejung</td>
			<td style="width:119px;">4022-4110</td>
			<td>Disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Equipments</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">FineCycler C100 (Thermocycler)</td>
			<td style="width:96px;">Ssufine</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Anealing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">2052</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:325px;">Automated High-performance Flow Cytometer</td>
			<td style="width:96px;">BD (USA), FACSVerse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation

Evaluering af en ny terapeutisk agent for immunterapi eller vaccination er analyse af immun celle aktivering i lymfatisk væv afgørende. Her, vi undersøgte immunologiske effekter af en novel lipid-DNA immunostimulant i nanopartikel form fra forskellige administrationsveje i musen: oral, intranasal, subkutane, footpad, intraperitoneal, og intravenøs. Disse injektioner vil direkte påvirke immunrespons, og høst lymfatisk væv og analyse af dendritiske celler (DC) aktivering i væv er afgørende dele af disse evalueringer. Udvinding af mediastinale lymfeknuder (mLNs) er vigtig, men ganske komplekse på grund af størrelsen og placeringen af dette organ. En trinvis procedure til høst ingvinal lymfeknude (iLN), mLN og milt og analysere DC aktivering ved flowcytometri er beskrevet.

For at vurdere relevante injektion ruter af INP til aktivering af lymfatisk væv DC, DC befolkningen som afstamning var defineret som -CD11c+ celler i milt, iLN og mLN og analyseret udtryk niveauer af co-stimulatory molekyler. Behandling af INP af subkutant (s.c.) og intravenøs (IV) injektion forfremmet betydelige stigninger i CD40, CD80 og CD86 udtryk i milt og iLN DCs (figur 2B og 2 C). Footpad og in...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation at JoVE.com

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Immunstimulerende middel evaluering: Lymfoide væv udvinding og injektion rute-afhængige dendritiske celle aktivering

Eksperimentelle procedurer for efterfølgende udvinding af lymfatisk væv til at teste lymfoide dendritiske celle aktivering er beskrevet efter behandling af en immunstimulerende nanomateriale.

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Det overordnede mål med denne procedure er at gøre den unikke teknik, der kræves i at isolere mediastinal lymfeknude fra mus. Operationen blev udført efter injektion af immunstimulansmateriale på seks forskellige ruter i mus. I denne undersøgelse brugte vi en ny klasse af materiale, der danner nano-størrelse strukturer.Overfladeaktive stoffer består af hydrofile hovedgruppe og hydrofobe hale. Disse danner sfæriske micelle eller anden sekundær struktur på grund af mikrofag adskillelse. Vi udnyttede denne egenskab til en bio makromolekyle, der er DNA.DNA amfifile, vist her, som regelmæssige nukleotider som A, C, G, T, har hydrofile blokke, mens lipid modificeret neuro-celle nukleobaser fungere som hydrofobe enheder. Den modificerede oligo blev syntetiseret af DNA synthesizer i store otte ottekant octograms. I equi-media de amphifile lipid DNAs spontant danner nano-størrelse sfæriske micelles.Når micelle dannes, forbliver DNA'et enkeltstrenget som en tom bærer med omkring 10 nanometer i diameter. For at udstyre luftfartsselskabet med immun-stimulerende, er det simpelt spørgsmål om at udvide DNA-sekvens med vejafgift-lignende receptor ni adjuvans nemlig eCpG. Lipid DNA og eCpG base her derfor den ydre overflade af micelle nedbrydes med CpG sekvens.Vi navngiver derefter denne immunstimulerende nanopartikel som INP. For at bestemme den korrekte måde at INPs for immunrespons vi injiceres INPs til mus i 64 injektion ruter og dermed en ordentlig lymfeknude væv blev analyseret. For mere detaljeret injektion instruktion kan du finde en JOB artikel udgivet af Charles River i 2012.Den største fordel ved denne video er visuelt viser, hvordan man får mediastinal lymfeknude. Videoen viser eksplicit placeringen af mediastinal lymfeknude, som en masse mennesker finder en vanskelighed i at isolere organer. Alle forsøg blev udført i henhold til retningslinjerne fra Den Institutionelle Animal Care and Use Udvalg på Shanghai Public Health Clinical Center, eller University of Ulsan College of Medicine.Denne del vil vise den specifikke placering af organer eller væv, som er afgørende for immunologisk analyse. Milt og to lymfeknuder vil blive isoleret. Først og fremmest blev mus ofret af kuldioxid indånding dødshjælp og alle bestræbelser blev gjort for at minimere lidelser som efter vejledning af Institutionelle Animal Care and Use Committee.Fra nu af skal vi finde organerne og isolere dem. Først korrekt fastgør musen på operationsbordet med fire ben på håndfladen. Steriliser dissektionsområdet med alkohol.Disseker det ydre dække bunden af musen maven med en stor størrelse saks. Brug pinp til at åbne begge sider af fastgørelse og fastgør det med stifter på operationsbordet. Placeringen af lyskelymfeknude er udsat ved at finde sammen med fartøjet går ned mod venstre ben.Formen af fartøjet ligner vippet alfabet bogstav Y.Afdække laget med snævren og trække det fra huden. Skær bughinden med mindre saks til at afsløre indre organer. Flyt tarmen til højre ved hjælp af kraftbiske derefter wrap i formet milt, som viser på venstre, øverste venstre side af maven.Yderligere opmærksomhed er påkrævet under proceduren, da milten er let at forstyrre. Endelig det centrale punkt i denne video: høst mediastinal lymfeknude. Det er placeret under den øverste side af lungen, hvilket er svært at se på grund af sin lille størrelse og noget skjult placering.Udsæt omhyggeligt området med en lille saks og en lille sceces. Skær begge sider af ribbenene og mellemgulvet så godt. Klip de afskårne ribben over brystet.Under proceduren undgå at beskadige hjerte og blodkar, da det kan blinde stedet, finde den gennemskinnelige mediastinal lymfeknude. Hvis ved et uheld blodkarret brast, forsigtigt udslette blodet med gaze. Grib venstre side af lungen og forsigtigt vende det over til den anden side for at se under lungen.Træk den mediastinal lymfeknude op ved hjælp af saft. Efter høst af mediastinal lymfeknude, Sørg for at perfekt fjerne alle de fedt og blod omkring lymfeknuden, da uønsket væv kan påvirke analysen. Endelig alle de isolerede organer på en petriskål fyldt med medier.I alt 0,1 gange 10 til de sjette celler blev analyseret på denne flow cytometri. Baseret på kraft getter og størrelse getter leukocyt befolkning blev gated, og at cellerne blev udelukket af mørk farvning. 24 timer efter INP-injektion med 64 injektionsveje, milt, lyskelymfeknude og mediastinal lymfeknude blev høstet og analyseret DC-aktivering ved flowcytometri.Baseret på strategien for flow cytometri DC population blev defineret som CD11C positive og afstamning negative celler i den levende leukocyt. Især, intranasal injektion af INP fremmes betydelige stigninger i CD40, 80, 86 udtryk i mediastinal lymfeknude sammenlignet med PBS for kontrol. Derfor, disse data foreslog, at intranasal injektion af INP kan bruges som en slimhinde adjuvans for forbedring af immunitet i lungerne.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse af Pulmonal dendritiske celle modning og migration under Allergisk luftvejene

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering og måling af NLRP3 Inflammasome Aktivitet hjælp af IL-1β i Human monocytafledte dendritiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In vitro Generation af murint Plasmacytoide dendritiske celler fra fælles Lymfoid progenitorer ved hjælp af AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generering af Umodne, Modne og tolerogeniske dendritiske celler med forskellige Metabolic fænotyper

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infektion af menneskelige lymfoide væv og kvindelige kønsorganer slimhinde med Human immundefekt Virus 1 og Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

En In Vivo musemodel foranstaltning naive CD4 T-celle aktivering, spredning og Th1 differentiering induceret af knoglemarv-afledte dendritiske celler

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...