Name: immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata dal programma di Creative materiali scoperta attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro pianificazione (NRF-2017M3D1A1039421) e dal programma di biotecnologie Marine finanziato dalla Ministero degli oceani e pesca, Repubblica di Corea e una borsa di studio (20150220).

Tutte le procedure sperimentali tra cui isolamento di manipolazione, sacrificio e organo animale sono state eseguite in stretta conformità con le regole del Comitato uso presso centro clinico di salute pubblica di Shanghai e Asan Medical Center e International Animal Care. Il protocollo di studio è stato approvato dai rispettivi comitati di etica di animale esperimenti presso Shanghai Public Health Clinical Center (numero di protocollo del Mouse: SYXK-2010-0098) e Asan Medical Center (2016-02-168).
<p class="jove_t...

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	<li>Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).</li><li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation.">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li><li>Pal, I., Ramsey, J. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes.">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. 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Lab Animal Research. Compound Administration I.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Lab+Animal+Research.+Compound+Administration+III.">JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li></ol>

Molti progressi nella nanotecnologia e immunologia sono stati raggiunti attraverso ricerca terapeutica della somministrazione di farmaci e immunostimolazione. Un'attenta selezione del metodo di iniezione è conosciuta per essere importante per immunostimolazione, che era l'obiettivo del presente studio.
Itinerari di iniezione differenti sono stati valutati per un naturalmente non tossici e biodegradabile basati sul DNA materiale, INP (immunostimulatory delle nanoparticelle), per determinare qu...

Progressi in immunologia e nanomateriali hanno portato ad un'abbondanza di nuove strategie terapeutiche potenziali per applicazioni nel campo della biomedicina, tra cui immunostimolazione e consegna della droga. Ottimizzazione della via di somministrazione è un aspetto fondamentale che influenzano l'efficacia degli agenti immunostimulatory. Una nanoparticella di immunostimulatory (INP) costituito da DNA è un nuova concezione adiuvante di nano-immunitario auto-assemblato da microphase separazione a causa della struttura anfifilica di lipido-DNA1. Di conseguenza, protocolli per INP che coinvolge amministrazione del materiale1 in vivo tramite percorsi diversi e tre procedure per la raccolta di tessuti appropriati come il linfonodo inguinal (iLN), LN (mLN) mediastinica e la milza, sono descritto. Infine, questi tessuti sono stati analizzati per l'attivazione delle cellule dendritiche (DC), le cellule presentanti l'antigene più potente del sistema immunitario. Questo protocollo può essere applicato anche per la valutazione di antigeni, anticorpi o altri adiuvanti immuni2.
Abbiamo testato la formulazione INP perché è un agente che ha mostrato grande promessa. INP è un recettore Toll-like 9 (TLR9) materiale ausiliario che contiene acidi nucleici, per la cui valutazione di immunostimolazione efficacia è necessario verificare iniezione differenti metodi3. In questo contesto, la stimolazione di DCs è un potente endpoint per la valutazione in vivo . Dopo molecole dell'antigene o immunostimulatory phagocytosed dal DCs in tessuti periferici o sangue, queste cellule migrano verso organi linfoidi come la milza e LNs4,5. Così, attivazione delle DC è stato analizzato in milza, iLN e mLN degli animali iniettati. Pertanto è anche cruciale per valutare la risposta immunitaria ad un romanzo di adiuvante o agenti patogeni5correttamente la raccolta di questi tessuti. Tale raccolta di tessuto è anche importante per lo sviluppo di una nuova metodologia immunologica come terapia del cancro. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per verificare l'efficacia di altri farmaci, come il virus dell'immunodeficienza umana terapeutica6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Material</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate buffer saline</td>
			<td rowspan="2" style="width:96px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">21-040-CVR</td>
			<td rowspan="2">Washing organs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(PBS, pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">isoflurane solution&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Aesica Queenborough limited</td>
			<td style="width:119px;">26675-46-7</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tuberculin 1mL syringe -</td>
			<td style="width:96px;">Junglim</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">S.P.L</td>
			<td style="width:119px;">50050</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">1mL Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:96px;">(BD Ultra-FineTM&#173;II)_short needle</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Intramuscular Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:96px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30081.01</td>
			<td>Storing organs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Histopaque</td>
			<td style="width:96px;">&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10771</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Daejung</td>
			<td style="width:119px;">4022-4110</td>
			<td>Disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Equipments</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">FineCycler C100 (Thermocycler)</td>
			<td style="width:96px;">Ssufine</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Anealing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">2052</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:325px;">Automated High-performance Flow Cytometer</td>
			<td style="width:96px;">BD (USA), FACSVerse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation

Per la valutazione di un nuovo agente terapeutico per l'immunoterapia o la vaccinazione, analisi di attivazione delle cellule immuni in tessuti linfatici è essenziale. Qui, abbiamo studiato gli effetti immunologici di un immunostimolante di romanzo del lipido-DNA in forma di nanoparticelle da vie di somministrazione differenti nel topo: orale, intranasale, sottocutanea, zampa, intraperitoneale ed endovenosa. Queste iniezioni influenzerà direttamente la risposta immunitaria e la raccolta dei tessuti linfatici e analisi dell'attivazione delle cellule dendritiche (DC) nei tessuti sono parti cruciali di queste valutazioni. L'estrazione dei linfonodi mediastinici (mLNs) è importante ma abbastanza complessa a causa della dimensione e la posizione di questo organo. È descritta una procedura graduale per la raccolta il linfonodo inguinal (iLN), mLN e la milza e l'analisi di attivazione delle DC tramite flusso cytometry.

Per valutare percorsi appropriati iniezione di INP per l'attivazione del tessuto linfatico DC, la popolazione di DC come lignaggio è stata definita ---CD11c+ cellule nella milza, iLN e mLN e analizzati i livelli di espressione di molecole costimolatorie. Trattamento di INP iniezione endovenosa (i.v.) e sottocutanea (s.c.) ha promosso gli aumenti sostanziali nell'espressione CD40, CD80 e CD86 in milza e iLN DCs (Figura 2B</stron...

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Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche

Procedure sperimentali per l'estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di familiarizzare con la tecnica unica richiesta per isolare il linfonodo mediastino dai topi. L'operazione è stata condotta dopo aver iniettato materiale immunostimolante su sei diverse vie nei topi. In questo studio, abbiamo usato una nuova classe di materiali che formano strutture di dimensioni nanometriche.I tensioattivi sono costituiti da gruppo testa idrofila e coda idrofobica. Questi formano micelle sferiche o altra struttura secondaria a causa della separazione dei microfagi. Abbiamo utilizzato questa proprietà per una bio macromolecola che è il DNA.L'anfifilo del DNA, mostrato qui, come nucleotidi regolari come A, C, G, T, ha blocchi idrofili mentre le nucleobase neuro-cellulari modificate lipidiche agiscono come unità idrofobiche. L'oligo modificato è stato sintetizzato dal sintetizzatore DNA in ottogrammi su larga scala. Negli equi-media i DNA lipidici anfifili formano spontaneamente micelle sferiche di dimensioni nanometriche.Quando si forma la micelle, il DNA rimane mono-filamento come vettore vuoto con circa 10 nanometri di diametro. Per dotare il vettore di immuno-stimolante, è semplice estendere la sequenza del DNA con recettore a pedaggio nove coadiuvanti vale a dire eCpG. Dna lipidico e base eCpG qui quindi la superficie esterna della micella viene degradata con sequenza CpG.Quindi chiamiamo questa nanoparticcella immuno-stimolante come INP. Per determinare il modo corretto degli INP per la risposta immunitaria abbiamo iniettato INP ai topi in 64 vie di iniezione e di conseguenza è stato analizzato un tessuto linfonodo adeguato. Per istruzioni di iniezione più dettagliate si prega di trovare un articolo JOB pubblicato da Charles River nel 2012.Il vantaggio principale di questo video è mostrare visivamente come ottenere il linfonodo mediastino. Il video mostra esplicitamente la posizione del linfonodo mediastino che molte persone trovano difficoltà nell'isolare gli organi. Tutti gli esperimenti sono stati condotti sotto le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee presso lo Shanghai Public Health Clinical Center, o University of Ulsan College of Medicine.Questa parte mostrerà la posizione specifica di organi o tessuti, che sono cruciali per l'analisi immunologica. Milza e due linfonodi saranno isolati. Prima di tutto, i topi sono stati sacrificati dall'eutanasia per inalazione di anidride carbonica e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza come segue la guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.D'ora in poi troviamo gli organi e li isoliamo. Per prima cosa, fissare correttamente il mouse sulla scrivania operativa con quattro perni sul palmo del mouse. Sterilizzare l'area di dissezione con alcol.Sezionare la copertura esterna del fondo dell'addome del topo con una forbice di grandi dimensioni. Utilizzare le pin per aprire entrambi i lati dell'attacco e fissarlo con i perni sul tavolo operatorio. La posizione del linfonodo inguinale è esposta trovando la congiunzione del vaso che scende verso la gamba sinistra.La forma del vaso sembra la lettera dell'alfabeto inclinato Y.Scopri lo strato con le forcep e tiralo dalla pelle. Tagliare il peritoneo con forbice più piccola per esporre gli organi interni. Spostare l'intestino a destra usando le forcep e quindi avvolgere la milza sagomata, che mostra sul lato sinistro, superiore sinistro dell'addome.È necessaria un'ulteriore attenzione durante la procedura poiché la milza è facile da interrompere. Infine il punto chiave di questo video: raccolta del linfonodo mediastino. Si trova sotto il lato superiore del polmone, che è difficile da vedere a causa delle sue piccole dimensioni e della posizione un po 'nascosta.Esporre attentamente l'area utilizzando piccole forbici e forcep. Tagliare entrambi i lati delle nervature e anche il diaframma. Ritagliare le costole tagliate sopra il petto.Durante la procedura evitare di danneggiare il cuore e i vasi sanguigni poiché potrebbe accecare il sito, trovando il linfonodo mediastinico traslucido. Se per caso il vaso sanguigno scoppia, pulire delicatamente il sangue con una garza. Afferrare il lato sinistro del polmone e girarlo dolcemente dall'altra parte per vedere sotto il polmone.Tirare su il linfonodo mediastino usando le forcep. Dopo aver raccolto il linfonodo mediastino, assicurarsi di rimuovere perfettamente tutto il grasso e il sangue che circondano il linfonodo poiché il tessuto indesiderato può influenzare l'analisi. Infine, tutti gli organi isolati su una piastra di Petri piena di media.Totale 0,1 per 10 alla sesta cellule sono state analizzate su questa citometria del flusso. In base al getter di forza e alle dimensioni, la popolazione di leucociti getter fu recinta e le cellule furono escluse dalla colorazione scura. 24 ore dopo l'iniezione in INP per 64 vie di iniezione, milza, linfonodo inguinale e linfonodo mediastinico sono stati raccolti e analizzati l'attivazione CC per citometria del flusso.Sulla base della strategia della citometria del flusso, la popolazione DC è stata definita come cellule positive cd11C e negative di lignaggio nel leucocita vivo. In particolare, l'iniezione intranasale di INP ha promosso aumenti significativi nell'espressione CD40, 80, 86 nel linfonodo mediastino rispetto al PBS per il controllo. Pertanto, questi dati hanno suggerito che l'iniezione intranasale di INP può essere utilizzata come coadiuvante mucoso per il miglioramento dell'immunità nel polmone.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

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Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analisi della maturazione polmonare delle cellule dendritiche e migrazione durante l&#39;infiammazione allergica delle vie aeree

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoraggio migrazione delle cellule dendritiche usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

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In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l&#39;AC-6 Alimentatore Sistema

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Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

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Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infezione della Mucosa genitale umana del tessuto linfoide e donna con il Virus dell'immunodeficienza umana 1 e Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...