Name: immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av kreative funn programmet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtid planlegger (NRF-2017M3D1A1039421) og marin bioteknologi program finansiert av den Departementet av hav og fiskeri, Sør-Korea og stipend (20150220).

Alle eksperimentelle prosedyrer inkludert dyr håndtering, offer og orgel isolasjon ble utført i strengt samsvar med reglene i internasjonale Animal Care og bruk komité i Shanghai klinisk helseavdelingen og Asan Medical Center. Studien protokollen ble godkjent av de respektive komiteene på etikk av dyr eksperimenter i Shanghai klinisk helseavdelingen (mus Protokollnummer: SYXK-2010-0098) og Asan Medical Center (2016-02-168).
1. forberedelse materiale
Merk: En nano-...

<ol>
	<li>Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).</li><li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation.">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li><li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response.">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li><li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+soft+matter+lipid-DNA+nanoparticle+as+the+immunostimulant+via+multiple+routes+of+injection+in+vivo.">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science &amp; Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li><li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., F&#246;rster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease.">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li><li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat.">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li><li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes.">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General anesthesia of mice and rats. , (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Lab+Animal+Research.+Compound+Administration+I.">JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Lab+Animal+Research.+Compound+Administration+III.">JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li></ol>

Mange fremskritt i nanoteknologi og immunologi er oppnådd gjennom terapeutisk forskning av narkotika-leveranser og immunostimulation. Nøye utvalg av injeksjon metoden er kjent for å være viktig for immunostimulation, som var fokus for studien.
Forskjellige injeksjon ruter ble vurdert for en naturlig giftfri og biologisk nedbrytbare DNA-materialet INP (immunostimulatory hydrogenion), til å bestemme hvilken rute gitt det beste resultatet. Denne tilnærmingen er også relevant for levering a...

Fremskritt innen immunologi og nanomaterialer har ført til en overflod av potensielle nye strategier for programmer i biomedisin, inkludert narkotika-leveranser og immunostimulation. Optimalisering av administrasjonen ruten er et viktig aspekt påvirker effekten av immunostimulatory agenter. En immunostimulatory hydrogenion (INP) bestående av DNA er en nyutviklet nano-immune adjuvant selv sammen med microphase separasjon på grunn av amphiphilic strukturen i lipid-DNA1. Derfor protokoller for INP involverer administrasjon av materiale1 i vivo via forskjellige ruter og tre prosedyrer for høsting riktig vev som den lysken lymfeknute (iLN), mediastinal LN (mLN) og milt, er beskrevet. Til slutt, disse vev ble analysert for dendrittiske celle (DC) aktivisering, de mektigste antigen-presentasjon cellene i immunsystemet. Denne protokollen kan også brukes for å vurdere antigener, antistoffer eller andre immun adjuvans2.
Vi testet INP formulering fordi det er en agent som har vist store løftet. INP er en Toll-like reseptor 9 (TLR9) adjuvant materiale som inneholder nucleic syrer, hvilke vurdering av immunostimulation effekten er nødvendig å teste ulike injeksjon metoder3. I denne sammenheng er stimulering av DCs en potent endepunkt for i vivo evaluering. Etter antigen eller immunostimulatory molekyler er phagocytosed ved DCs i perifere vev eller blod, flytte disse cellene til lymfoide organer som milten og LNs4,5. Dermed var DC aktivisering analysert i milten, iLN og millioner av injisert dyrene. Riktig høsting av disse vev er derfor også avgjørende for å vurdere immunforsvaret til en roman adjuvant eller patogener5. Slike vev høsting er også viktig for å utvikle en roman, immunologiske metodikk som kreft terapi. Videre, denne protokollen kan brukes til å kontrollere effektiviteten av andre stoffer, som anti-humant immunsvikt virus therapeutics6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Material</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate buffer saline</td>
			<td rowspan="2" style="width:96px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">21-040-CVR</td>
			<td rowspan="2">Washing organs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(PBS, pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">isoflurane solution&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Aesica Queenborough limited</td>
			<td style="width:119px;">26675-46-7</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tuberculin 1mL syringe -</td>
			<td style="width:96px;">Junglim</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">S.P.L</td>
			<td style="width:119px;">50050</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">1mL Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:96px;">(BD Ultra-FineTM&#173;II)_short needle</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Intramuscular Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:96px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30081.01</td>
			<td>Storing organs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Histopaque</td>
			<td style="width:96px;">&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10771</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Daejung</td>
			<td style="width:119px;">4022-4110</td>
			<td>Disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Equipments</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">FineCycler C100 (Thermocycler)</td>
			<td style="width:96px;">Ssufine</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Anealing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">2052</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:325px;">Automated High-performance Flow Cytometer</td>
			<td style="width:96px;">BD (USA), FACSVerse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation

For evaluering av en ny terapeutisk agent for immunterapi eller vaksinasjon er analyse av immun celle aktivering lymfatisk vev viktig. Her vi undersøkt immunologiske virkningene av en roman lipid-DNA immunostimulant i hydrogenion skjemaet fra ulike administrasjon ruter i musen: muntlig, intranasal, subkutan, footpad, intraperitoneal og intravenøs. Disse injeksjoner vil direkte påvirke immunforsvaret og høsting lymfatisk vev analyse av dendrittiske celle (DC) aktivering i vev er viktige deler av disse vurderinger. Utvinning av mediastinal lymfeknuter (mLNs) er viktig, men ganske komplisert på grunn av størrelsen på og plasseringen av denne organ. Trinnvis fremgangsmåte for høsting lysken lymfeknute (iLN), mLN og milt og analysere DC aktivering av flowcytometri er beskrevet.

For å vurdere aktuelle injeksjon ruter INP for lymfatisk vev DC aktivisering, DC befolkningen som linjen ble definert som -CD11c+ celler i milten, iLN og mLN og analysert uttrykk nivåene av co-stimulatory molekyler. Behandling av INP subcutaneous (SC) og intravenøs (IV) injeksjon forfremmet betydelige økninger i CD40, CD80 og CD86 uttrykk i milten og iLN DCs (figur 2B og 2 C). Footpad og intraperito...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation at JoVE.com

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Immunostimulatory Agent evaluering: Lymfoid vev utvinning og injeksjon Ruteavhengig dendrittiske celle aktivering

Eksperimentell prosedyrer for påfølgende utvinning av lymfatisk vev å teste lymfoide dendrittiske celle aktivering er beskrevet etter behandling av en immunostimulating nanomaterial.

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å gjøre den unike teknikken som kreves for å isolere mediastinal lymfeknute fra mus. Operasjonen ble utført etter injeksjon av immunostimulerende materiale på seks forskjellige ruter hos mus. I denne studien brukte vi en ny klasse av materiale som danner nanostore strukturer.Tensider består av hydrofil hodegruppe og hydrofob hale. De danner sfærisk micelle eller annen sekundær struktur på grunn av mikrophage separasjon. Vi benyttet denne egenskapen til en bio makromolekyl som er DNA.DNA amfifil, vist her, som vanlige nukleotider som A, C, G, T, har hydrofile blokker mens lipid modifiserte nevrocellekjerner fungerer som hydrofobe enheter. Den modifiserte oligo ble syntetisert av DNA synthesizer i storskala oktogrammer. I equi-media amfifil lipid DNAs spontant danner nano-sfæriske micelles.Når micelle dannes, forblir DNA-et en-strandet som en tom bærer med ca 10 nanometer i diameter. For å utstyre bæreren med immunstimulerende, er det enkelt å utvide DNA-sekvensen med tolllignende reseptor ni adjuvant nemlig eCpG. Lipid DNA og eCpG base her derfor den ytre overflaten av micelle er degradert med CpG sekvens.Vi nevner deretter denne immunstimulerende Nano-partikkelen som INP. For å finne den riktige måten INPs for immunrespons injiserte vi INPer til mus i 64 injeksjonsruter, og dermed ble et riktig lymfeknutevev analysert. For mer detaljert injeksjon instruksjon vennligst finn en JOB artikkel publisert av Charles i 2012.Den største fordelen med denne videoen er visuelt å vise hvordan du får mediastinal lymfeknute. Videoen viser eksplisitt plasseringen av mediastinal lymfeknute som mange mennesker finner en vanskelighet med å isolere organene. Alle eksperimenter ble utført i henhold til retningslinjene til Institutional Animal Care and Use Committee ved Shanghai Public Health Clinical Center, eller University of Ulsan College of Medicine.Denne delen vil vise den spesifikke plasseringen av organer eller vev, som er avgjørende for immunologisk analyse. Milten og to lymfeknuter vil bli isolert. Først av alt ble mus ofret av karbondioksidinnåndings-eutanasien, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse som følge av veiledning fra Institutional Animal Care and Use Committee.Fra nå av la oss finne organene og isolere dem. Først fikse musen på operativsystemet med fire pinner på håndflaten av musen. Steriliser disseksjonsområdet med alkohol.Dissekere det ytre dekselet bunnen av muselivet med en stor saks. Bruk tang til å åpne begge sider av tilbehøret og fest den med pinner på operasjonsbordet. Plasseringen av inngangslymfeknute er utsatt ved å finne konjunksjonen av fartøyet som går ned mot venstre ben.Formen på fartøyet ser ut som vippet alfabetbokstav Y.Avdekk laget med tang og trekk det fra huden. Klipp bukhinnen med mindre saks for å avsløre indre organer. Flytt tarmen til høyre ved hjelp av tang og pakk deretter i formet milt, som viser til venstre, øvre venstre side av magen.Ekstra oppmerksomhet er nødvendig under prosedyren, siden milten er lett å forstyrre. Endelig hovedpoenget med denne videoen: høsting mediastinal lymfeknute. Den ligger under oversiden av lungene, noe som er vanskelig å se på grunn av sin lille størrelse og noe skjult plassering.Utsett området forsiktig ved hjelp av liten saks og tang. Klipp begge sider av ribbeina og membranen også. Fest de avskårne ribbeina over brystet.Under prosedyren unngå å skade hjerte og blodkar siden det kan blinde området, finne gjennomskinnelig mediastinal lymfeknute. Hvis blodkaret ved et uhell brister, tørk forsiktig ut blodet med gasbind. Ta tak i venstre side av lungene og snu den mykt til den andre siden for å se under lungen.Trekk opp den mediastinale lymfeknuten ved hjelp av tang. Etter høsting av den mediastinale lymfeknuten, sørg for å fjerne alt fett og blod rundt lymfeknuten siden uønsket vev kan påvirke analysen. Til slutt, alle de isolerte organene på en petriskål fylt med media.Totalt 0,1 ganger 10 til de sjette cellene ble analysert på denne flyten cytometri. Basert på force getter og størrelse getter leukocyte befolkningen ble inngjerdet og at cellene ble utelukket av mørk farging. 24 timer etter INP-injeksjon med 64 injeksjonsruter ble milten, inguinal lymfeknute og mediastinal lymfeknute høstet og analysert DC-aktivering ved strømningscytometri.Basert på strategien for strømningscytometri DC befolkningen ble definert som CD11C positive og avstamning negative celler i live leukocytter. Spesielt, intranasal injeksjon av INP fremmet betydelige økninger i CD40, 80, 86 uttrykk i mediastinal lymfeknute sammenlignet med PBS for kontroll. Derfor, Disse dataene antydet at intranasal injeksjon av INP kan brukes som en slimhinneadjuvans for forbedring av immunitet i lungene.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse av Pulmonal dendrittiske celle modning og migrasjon under Allergisk Airway betennelse

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivisering og måling av NLRP3 Inflammasome aktivitet Bruke IL-1β i Human Monocyte-avledet dendrittiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generering av murine Plasmacytoid dendrittiske celler fra Common Lymfoid stamfedre bruker AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generering av umoden, moden og tolerogene dendrittiske celler med ulik Metabolsk fenotyper

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infeksjon av menneskelig lymfoid vev og Female Genital Mucosa humant immunsviktvirus 1 og Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

En i Vivo musemodell mål naiv CD4 T celle aktivering, spredning og Th1 differensiering av Ben margtransplantasjon-avledet dendrittiske celler

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...