Name: immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de descoberta de materiais criativo através da nacional pesquisa Fundação da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência, TIC e futuro planejamento (NRF-2017M3D1A1039421) e pelo programa de biotecnologia Marinha financiado pelo Ministério dos oceanos e das pescas, República da Coreia e uma concessão (20150220).

Todos os procedimentos experimentais, incluindo o isolamento de manipulação, sacrifício e órgãos animal foram realizados em estrita conformidade com as regras do Comité de uso no centro clínico de saúde pública de Shanghai e Asan Medical Center e cuidado do Animal Internacional. O protocolo de estudo foi aprovado pelas respectivas comissões sobre a ética de experimentos Animal no centro clínico de saúde pública de Shanghai (Mouse protocolo número: SYXK-2010-0098) e Asan Medical Center (2016-02-168).
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	<li>Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).</li><li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation.">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li><li>Pal, I., Ramsey, J. 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Lab Animal Research. Compound Administration I.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Lab+Animal+Research.+Compound+Administration+III.">JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li></ol>

Muitos avanços em nanotecnologia e Imunologia foram obtidos através de pesquisas terapêuticas de entrega da droga e imunoestimulação. A seleção cuidadosa do método de injeção é conhecida por ser importante para imunoestimulação, que foi o foco do presente estudo.
Rotas de injeção diferentes foram avaliadas para um naturalmente atóxico e biodegradável baseado em DNA material, INP (immunostimulatory nanopartículas), para determinar qual rota rendeu o melhor resultado. Essa abor...

Avanços em imunologia e nanomateriais têm levado a uma abundância de potenciais novas estratégias terapêuticas para aplicações em biomedicina, incluindo imunoestimulação e entrega da droga. Otimização da rota de administração é um aspecto vital que afectam a eficácia dos agentes immunostimulatory. Uma nanopartícula immunostimulatory (INP) que consiste de DNA é um adjuvante de nano-imune recém-desenvolvido Self montado por microfases separação devido à estrutura anfifílica de lipídios-DNA1. Portanto, os protocolos para INP envolvendo a administração do material1 no vivo através de diferentes rotas e três procedimentos para colheita de tecidos apropriados como o linfonodo inguinal (iLN), mediastinal LN (mLN) e baço, são descrito. Finalmente, estes tecidos foram analisados para a ativação de células dendríticas (DC), as células apresentadoras mais poderosas no sistema imunológico. Este protocolo também pode ser aplicado para a avaliação de antígenos, anticorpos ou outro adjuvantes imunes2.
Nós testamos a formulação do INP, porque é um agente que tem mostrado grande promessa. INP é um receptor Toll-like 9 (TLR9) material adjuvante que contém ácidos nucleicos, para qual avaliação de imunoestimulação eficácia é necessária para teste de injeção diferentes métodos3. Neste contexto, a estimulação de DCs é um ponto de extremidade potente para avaliação na vivo . Depois de moléculas do antígeno ou immunostimulatory são fagocitadas por DCs no sangue ou tecidos periféricos, essas células migram para órgãos linfoides como o baço e o LNs4,5. Assim, ativação de DC foi analisada no baço, mLN dos animais injetados e iLN. Corretamente colheita desses tecidos, portanto, é também crucial para avaliar a resposta imune para um romance de adjuvante ou patógenos5. Essa colheita de tecido também é importante para o desenvolvimento de uma metodologia imunológica romance como uma terapia de câncer. Além disso, este protocolo pode ser usado para verificar a eficiência de outras drogas, tais como vírus de imunodeficiência humana terapêutica6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Material</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate buffer saline</td>
			<td rowspan="2" style="width:96px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">21-040-CVR</td>
			<td rowspan="2">Washing organs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(PBS, pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">isoflurane solution&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Aesica Queenborough limited</td>
			<td style="width:119px;">26675-46-7</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tuberculin 1mL syringe -</td>
			<td style="width:96px;">Junglim</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">S.P.L</td>
			<td style="width:119px;">50050</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">1mL Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:96px;">(BD Ultra-FineTM&#173;II)_short needle</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Intramuscular Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:96px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30081.01</td>
			<td>Storing organs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Histopaque</td>
			<td style="width:96px;">&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10771</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Daejung</td>
			<td style="width:119px;">4022-4110</td>
			<td>Disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Equipments</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">FineCycler C100 (Thermocycler)</td>
			<td style="width:96px;">Ssufine</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Anealing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">2052</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:325px;">Automated High-performance Flow Cytometer</td>
			<td style="width:96px;">BD (USA), FACSVerse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation

Para a avaliação de um novo agente terapêutico para imunoterapia ou vacinação, análise de ativação de células imunes nos tecidos linfáticos é essencial. Aqui, nós investigamos os efeitos imunológicos de um imunoestimulante romance lipídios-DNA em forma de nanopartículas de rotas diferentes de administração no mouse: oral, intranasal, subcutânea, Whitney, intraperitoneal e intravenosa. Essas injeções influenciará diretamente a resposta imune e colheita de tecidos linfáticos e análise de ativação de células dendríticas (DC) nos tecidos são partes cruciais dessas avaliações. A extração dos linfonodos mediastinais (mLNs) é importante mas bastante complexo devido ao tamanho e localização deste órgão. É descrito um procedimento gradual para colheita do baço, mLN e linfonodo inguinal (iLN) e análise de ativação de DC por citometria de fluxo.

Para avaliar rotas de injeção apropriado do INP para ativação de tecido linfático DC, a população de DC como linhagem foi definida como –CD11c+ células no baço, iLN e mLN e analisados os níveis de expressão de moléculas coestimulatórias. Tratamento de INP por subcutânea (s.c.) e injeção intravenosa (i.v.) promoveu um aumento substancial na expressão CD40, CD80 e CD86 no baço e iLN DCs (Figura 2B e <s...

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Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

Procedimentos experimentais para a extração subsequente dos tecidos linfáticos para testar a ativação de células dendríticas linfoides são descritos após o tratamento de um nanomaterial imunoestimulante.

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

O objetivo geral deste procedimento é familiarizar a técnica única necessária na isolação do linfonodo mediastinal de camundongos. A operação foi realizada após a injeção de material imunoestimulante em seis rotas diferentes em camundongos. Neste estudo, utilizamos uma nova classe de material formando estruturas nano-dimensionadas.Os surfactantes consistem em grupo chefe hidrofílico e cauda hidrofóbica. Esses formam micela esférica ou outra estrutura secundária devido à separação de microfagos. Nós usamos esta propriedade para uma bio macromolécula que é DNA.Anfífilos de DNA, mostrados aqui, como nucleotídeos regulares como A, C, G, T, tem blocos hidrofílicos, enquanto as nucleobases neurocelulares modificadas lipídicas atuam como unidades hidrofóbicas. O oligo modificado foi sintetizado pelo sintetizador de DNA em octogramas em larga escala. Na mídia, os DNAs lipífilis anfílicos formam espontaneamente micelas esféricas nano-dimensionadas.Quando a micela é formada, o DNA permanece sozinho como um portador vazio com cerca de 10 nanômetros de diâmetro. Para equipar o portador com estimulante imunológico, é simples a questão de estender a sequência de DNA com receptor de pedágio nove adjuvantes ou seja, eCpG. DNA lipídido e base eCpG aqui, portanto, a superfície externa da micela é degradada com sequência cpg.Então nomeamos essa partícula nano estimulante imunológica como o INP. Para determinar a maneira adequada dos INPs para resposta imune, injetamos INPs em camundongos em 64 rotas de injeção e, consequentemente, um tecido linfático adequado foi analisado. Para instruções de injeção mais detalhadas, encontre um artigo JOB publicado por Charles River em 2012.A principal vantagem deste vídeo é mostrar visualmente como obter linfonodos mediastinal. O vídeo mostra explicitamente a localização do linfonodo mediastinal que muitas pessoas encontram dificuldade em isolar os órgãos. Todos os experimentos foram realizados sob as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro Clínico de Saúde Pública de Xangai, ou Faculdade de Medicina da Universidade de Ulsan.Esta parte mostrará a localização específica de órgãos ou tecidos, que são cruciais para a análise imunológica. Baço e dois linfonodos serão isolados. Em primeiro lugar, os camundongos foram sacrificados pela eutanásia de inalação de dióxido de carbono e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento seguindo a orientação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso animal.De agora em diante vamos encontrar os órgãos e isolá-los. Primeiro, conserte corretamente o mouse na mesa de operação com quatro pinos na palma do mouse. Esterilize a área de dissecção com álcool.Dissecar a tampa externa da parte inferior do abdômen do rato com uma tesoura de grande porte. Use fórceps para abrir os dois lados do acessório e fixá-lo com pinos na mesa de operação. A localização do linfonodo inguinal é exposta ao encontrar a conjunção da embarcação descendo em direção à perna esquerda.A forma do vaso parece a letra do alfabeto inclinado Y.Descubra a camada com as fórceps e puxe-a da pele. Corte o peritônio com uma tesoura menor para expor órgãos internos. Mova o intestino para a direita usando fórceps e, em seguida, enrole em baço em forma, que mostram no lado esquerdo, superior esquerdo do abdômen.É necessária atenção adicional durante o procedimento, uma vez que o baço é fácil de interromper. Finalmente, o ponto chave deste vídeo:coleta de linfonodo mediastinal. Está localizado sob a parte superior do pulmão, que é difícil de ver devido ao seu pequeno tamanho e localização um pouco escondida.Exponha cuidadosamente a área usando pequenas tesouras e fórceps. Corte os dois lados das costelas e o diafragma também. Corte as costelas acima do peito.Durante o procedimento evite danificar o coração e os vasos sanguíneos, pois pode cegar o local, encontrando o linfonodo mediastinal translúcido. Se por acidente o vaso sanguíneo estourou, limpe suavemente o sangue com gaze. Pegue o lado esquerdo do pulmão e vire-o suavemente para o outro lado para ver debaixo do pulmão.Puxe o linfonodo mediastinal usando fórceps. Depois de colher o linfonodo mediastinal, certifique-se de remover perfeitamente toda a gordura e sangue ao redor do linfonodo, uma vez que o tecido indesejado pode influenciar a análise. Finalmente, todos os órgãos isolados em uma placa de petri cheia de mídia.Foram analisadas 0,1 vezes 10 para a sexta célula nesta citometria de fluxo. Com base na população de leucócitos de getter de força e tamanho foi fechada e que as células foram excluídas pela coloração escura. 24 horas após a injeção inp por 64 rotas de injeção, baço, linfonodo inguinal e linfonodo mediastinal foram colhidos e analisados ativação dc por citometria de fluxo.Com base na estratégia da população de citometria de fluxo DC foi definida como células negativas cd11C positivas e de linhagem no leucócito vivo. Notavelmente, a injeção intranasal do INP promoveu aumentos significativos na expressão CD40, 80, 86 no linfonodo mediastinal em comparação com a PBS para o controle. Portanto, esses dados sugeriram que a injeção intranasal de INP pode ser usada como adjuvante mucosa para o aprimoramento da imunidade no pulmão.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Imunologia e Infecção

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Geração e Rotulagem de murino derivadas da medula óssea Células Dendríticas com Nanocristais Qdot de Estudos de rastreamento

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Análise da maturação das células dendríticas e migração pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...