Name: immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation at JoVE.com

Denna forskning stöddes av kreativt material Discovery Program genom den nationella forskning stiftelsen av Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT och framtida planering (NRF-2017M3D1A1039421) och marin bioteknik Program finansieras av den Departement av hav och fiske, Republiken Korea och bidrag (20150220).

Alla experimentella rutiner inklusive djurens hantering, offer och orgel isolering utfördes i strikt överensstämmelse med reglerna för den internationella djur vård och användning kommittén på Shanghai folkhälsa kliniska Center och Asan Medical Center. Studieprotokollet godkändes av de respektive utskotten på etik av djur experimenten på Shanghai folkhälsa kliniska Center (mus protokollnummer: SYXK-2010-0098) och Asan Medical Center (2016-02-168).
1. beredning av Material
<p cla...

<ol>
	<li>Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , (2016).</li><li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation.">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li><li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response.">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li><li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+soft+matter+lipid-DNA+nanoparticle+as+the+immunostimulant+via+multiple+routes+of+injection+in+vivo.">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science &amp; Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li><li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., F&#246;rster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease.">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li><li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat.">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li><li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes.">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li><li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+substances+to+laboratory+animals:+routes+of+administration+and+factors+to+consider.">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> General anesthesia of mice and rats. , (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Lab+Animal+Research.+Compound+Administration+I.">JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Lab+Animal+Research.+Compound+Administration+III.">JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+spleen.">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li></ol>

Många framsteg inom nanoteknik och immunologi har uppnåtts genom terapeutisk forskning av drogen leverans och immunostimulering. Noggrant urval av metoden injektion är kända för att vara viktigt för immunostimulering, som var i fokus för föreliggande studie.
Olika injektion rutter utvärderades ett naturligt giftfria och biologiskt nedbrytbara DNA-baserade material, INP (immunstimulerande nanopartiklar), att bestämma vilken väg gav det bästa resultatet. Detta tillvägagångssätt ä...

Framsteg inom immunologi och nanomaterial har lett till ett överflöd av potentiella nya terapeutiska strategier för applikationer inom biomedicin, inklusive drogen leverans och immunostimulering. Optimering av sträckan administration är en viktig aspekt som påverkar effekten av immunstimulerande medel. En immunstimulerande nanopartiklar (INP) som består av DNA är en nyutvecklad nano-immun adjuvant själv monteras av microphase separation på grund av lipid-DNA1amfifila struktur. Därför, protokoll för INP som omfattar administrering av den materiella1 i vivo via olika vägar och tre förfaranden för skörd lämpliga vävnader såsom den inguinal lymfkörtel (iLN), mediastinum LN (MUSD) och mjälte, är beskrivs. Slutligen, dessa vävnader analyserades för dendritiska cellen (DC) aktiveringen, de mest kraftfulla antigen-presenterande cellerna i immunsystemet. Detta protokoll kan också användas för att utvärdera antigener, antikroppar eller andra immun adjuvans2.
Vi testade INP formulering eftersom det är en agent som har visat stort löfte. INP är en Toll-like receptor 9 (TLR9) adjuvant material som innehåller nukleinsyror, för vilken bedömningen av immunostimulering effekt krävs att testa olika injektion metoder3. I detta sammanhang är stimulering av DCs en potent slutpunkt för i vivo utvärdering. Efter antigen eller immunstimulerande molekyler är fagocyteras av DCs i perifera vävnader eller blod, migrerar dessa celler till lymfoida organ som mjälte och LNs4,5. Därför analyserades DC aktivering i mjälte, iLN och mLN injicerade djuren. Korrekt skörd av dessa vävnader är därför också viktigt för att utvärdera immunsvaret mot en roman för adjuvant eller patogener5. Sådan vävnad skörd är också viktigt för att utveckla en ny immunologisk metodik som en cancerbehandling. Detta protokoll kan dessutom användas för att kontrollera effektiviteten av andra läkemedel, såsom anti-humant immunbrist virus therapeutics6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:707px;" width="707">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Material</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate buffer saline</td>
			<td rowspan="2" style="width:96px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">21-040-CVR</td>
			<td rowspan="2">Washing organs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(PBS, pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">isoflurane solution&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Aesica Queenborough limited</td>
			<td style="width:119px;">26675-46-7</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tuberculin 1mL syringe -</td>
			<td style="width:96px;">Junglim</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">S.P.L</td>
			<td style="width:119px;">50050</td>
			<td>Anesthesia process</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">1mL Insulin Syringe&#160;</td>
			<td style="width:96px;">(BD Ultra-FineTM&#173;II)_short needle</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Intramuscular Injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:96px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30081.01</td>
			<td>Storing organs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Histopaque</td>
			<td style="width:96px;">&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10771</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %&#160;</td>
			<td style="width:96px;">Daejung</td>
			<td style="width:119px;">4022-4110</td>
			<td>Disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:325px;">Equipments</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">FineCycler C100 (Thermocycler)</td>
			<td style="width:96px;">Ssufine</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Anealing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tube&#160;</td>
			<td style="width:96px;">FALCON</td>
			<td style="width:119px;">2052</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:325px;">Automated High-performance Flow Cytometer</td>
			<td style="width:96px;">BD (USA), FACSVerse</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostimulatory agent evaluation: lymphoid tissue extraction and injection route-dependent dendritic cell activation

För utvärdering av en ny terapeutisk agent för immunterapi eller vaccination är analys av immunceller aktivering i lymfatiska vävnader viktigt. Här, vi undersökte immunologiska effekter av en roman lipid-DNA immunostimulant i nanopartiklar form från olika administreringsvägar i musen: oral, intranasalt, subkutan, footpad, intraperitoneal och intravenös. Dessa injektioner kommer att direkt påverka immunsvaret och skörd lymfatiska vävnader och analys av dendritiska cellen (DC) aktivering i vävnaderna är avgörande delar av dessa utvärderingar. Utvinning av mediastinala lymfkörtlar (mLNs) är viktigt men ganska komplicerat på grund av storlek och läge av detta organ. Ett stegvis förfarande för skörd av inguinal lymfkörtel (iLN), mLN och mjälte och analysera DC aktivering av flödescytometri beskrivs.

Utvärdera lämpliga injektion exponeringsvägar INP för aktivering av lymfatisk vävnad DC, DC befolkningen som härstamning definierades som –CD11c+ celler i mjälte, iLN och mLN och analyseras uttrycksnivåerna av co-stimulatory molekyler. Behandling av INP genom subkutana (s.c.) och intravenös (i.v.) injektion främjat betydande ökningar av CD40, CD80 och CD86 uttryck i mjälte och iLN DCs (figur 2B och <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation at JoVE.com

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Immunstimulerande Agent utvärdering: Lymfoida vävnad utvinning och injektion rutt-beroende dendritiska cellaktivering

Experimentella rutiner för efterföljande utvinning av lymfatiska vävnader att testa lymfoida dendritiska cellen aktiveringen beskrivs efter behandling av en immunstimulerande nanomaterial.

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Det övergripande målet med detta förfarande är att bekanta den unika teknik som krävs för att isolera mediastinal lymfkörtel från möss. Operationen genomfördes efter att ha injicerat immunstimulant material på sex olika vägar hos möss. I denna studie använde vi en ny klass av material som bildar nano-stora strukturer.Tensider består av hydrofil huvudgrupp och hydrofoba svans. De bildar sfärisk micelle eller annat sekundärt strukturerar tack vare microphageseparation. Vi utnyttjade denna egenskap till en bio makromolekyl som är DNA.DNA-amphiphile, visas här, som vanliga nukleotider som A, C, G, T, har hydrofila block medan lipid modifierade neuro-cell nukleobases fungera som de hydrofoba enheterna. Den modifierade oligo var syntetiseras av DNA synthesizer i stora skala octograms. I equi-media den amfifila lipid DNAs spontant bilda nano-sized sfäriska miceller.När micelle bildas förblir DNA-tet enkelsträngat som en tom bärare med ca 10 nanometer i diameter. För att utrusta transportören med immun-stimulerande, är det enkel fråga om att förlänga DNA-sekvensen med toll-liknande receptor nio adjuvant nämligen eCpG. Lipid-DNA och eCpG baserar här därför ytbehandlar yttern av micelle försämras med CpG-ordna.Vi döpa sedan denna Immunstimulerande Nano partikel som INP. För att bestämma det rätta sättet för INPs för immunsvar vi injiceras INPs till möss i 64 injektion vägar och följaktligen en ordentlig lymfkörtel vävnad analyserades. För mer detaljerad injektion instruktion vänligen hitta en JOB artikel publicerad av Charles River i 2012.Den största fördelen med denna video är visuellt visar hur man får mediastinala lymfkörtel. Videon visar uttryckligen platsen för mediastinal lymfkörtel som många människor har svårt att isolera organen. Alla experiment utfördes enligt riktlinjerna från den institutionella animal care and use committee vid Shanghai Public Health Clinical Center, eller University of Ulsan College of Medicine.Denna del kommer att visa den specifika placeringen av organ eller vävnader, som är avgörande för immunologisk analys. Mjälte och två lymfkörtlar kommer att isoleras. Först av allt, möss offrades av koldioxid inandning dödshjälp och alla ansträngningar gjordes för att minimera lidande som efter ledning av institutionella Animal Care and Use Kommittén.Från och med nu ska vi hitta organen och isolera dem. Först ordentligt fixa musen på driftsdisken med fyra stift på handflatan på musen. Sterilisera dissektionsområdet med alkohol.Dissekera den yttre täcka botten av musen buken med en stor storlek sax. Använd pinps för att öppna båda sidorna av fastsättning och fixa den med stift på operationsbordet. Placeringen av inguinal lymfkörtel är utsatt genom att hitta den konjunktion av fartyget går ner mot vänster ben.Formen på fartyget ser ut som lutade alfabetet bokstaven Y.Avslöja lagret med tärna och dra den från huden. Skär peritoneum med mindre sax för att exponera inre organ. Flytta tarmen till höger genom att använda tövövingar sedan linda i formad mjälte, som visar på vänster, övre vänstra sidan av buken.Ytterligare uppmärksamhet krävs under förfarandet eftersom mjälte är lätt att störa. Slutligen den viktigaste punkten i denna video:skörd mediastinala lymfkörtel. Det ligger under den övre sidan av lungan, vilket är svårt att se på grund av sin ringa storlek och något dolda plats.Exponera försiktigt området med hjälp av små saxar och tulktorer. Skär båda sidor av revbenen och membranet också. Klipp av de avskurna revbenen ovanför bröstet.Under förfarandet undvika att skada hjärta och blodkärl eftersom det kan förblinda platsen, hitta den genomskinliga mediastinala lymfkörtel. Om av en slump blodkärlet brast, försiktigt utplåna blodet med gasbinda. Ta tag i den vänstra sidan av lungan och mjukt vända den över till andra sidan för att se under lungan.Dra upp mediastinala lymfkörtel med hjälp av tlykningar. Efter skörden mediastinala lymfkörtel nod, se till att perfekt ta bort allt fett och blod som omger lymfkörtel eftersom oönskad vävnad kan påverka analysen. Slutligen alla isolerade organ på en petriskål fylld med media.Totalt 0,1 gånger 10 till de sjätte cellerna analyserades på detta flöde cytometry. Baserat på kraft getter och storlek getter leukocyte befolkningen var gated och att celler uteslöts genom mörk färgning. 24 timmar efter INP injektion av 64 injektion vägar, mjälte, inguinal lymfkörtel och mediastinal lymfkörtel skördades och analyseras DC aktivering av flödescytometri.Baserat på strategin för flödescytometri DC befolkningen definierades som CD11C positiva och härstamning negativa celler i levande leukocyte. Noterbart är att intranasal injektion av INP främjat betydande ökningar i CD40, 80, 86 uttryck i mediastinal lymfkörtel jämfört med PBS för kontrollen. Därför föreslog dessa data att intranasal injektion av INP kan användas som en mucosal adjuvant för förbättring av immunitet i lungan.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Optimerade protokoll för effektiv Transfektion av dendritiska celler utan cellmognaden

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generering och märkning av murina härledd från benmärg dendritiska celler med Qdot Nanokristaller för spårning studier

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analys av Pulmonell mognad av dendritiska celler och migration under Allergisk luftvägsinflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Övervakning dendritceller Migration hjälp<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering och Mätning av NLRP3 inflamma aktivitet med användning av IL-1β i human monocyt-härledda dendritiska celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

I vitro Generation av murina Plasmacytoid dendritiska celler från Common lymfoid stamfäder med hjälp av AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generation av omogna, mogna och tolerogena dendritiska celler med olika Metabolic fenotyper

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infektion av mänskliga lymfoida vävnad och kvinnliga genitala slemhinnan med humant immunbristvirus 1 och Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

En In Vivo musmodell åtgärd naiva CD4 T-cellsaktivering, spridning och Th1 differentiering induceras av benmärgen-derived dendritiska celler

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...