Name: efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures at JoVE.com

Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt durch die Finanzierung der Japan Society für die Förderung von Science (JSPS) durch Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 und 18 K 08510) t.t. und Beihilfe für JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant-Nummer 17J07622), a.k., und die Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) durch seine Forschung gewähren "Core Center für iPS Zellforschung, Research Center-Netzwerk für die Realisierung der regenerativen Medizin" K.O. Die Autoren danken Dr. Peter Karagiannis für das Manuskript zu lesen.

Experimente mit hPSCs wurden von der Ethikkommission der Abteilung für Medizin und Graduate School of Medicine, Universität Kyoto genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien
Hinweis: Bereiten Sie alle Medien und Reagenzien für die Zellkultur in einer sterilen Umgebung. Wärmen Sie base Nährmedien auf Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch. Medium für Differenzierung innerhalb 6 h bei RT. Details der Reagenzien verwendet wird finden ...

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Die Generation der PDX1+ Zellen besteht aus mehreren Schritten; Daher ist es wichtig, Zellen zu gegebener Zeit zu behandeln. Unter den Schritten der Induktion Effizienz der endgültigen Entoderm wirkt sich weitgehend auf die endgültige Induktion Effizienz, möglicherweise durch Interferenzen von anderen kontaminierenden Abstammung-Zellen (d. h. Mesoderm und Ektoderm), die vermehren sich und/oder absondern können Faktoren, die die spezifische Differenzierung zu stören. Wenn der Anteil der SOX17+ Z...

Die Bauchspeicheldrüse besteht hauptsächlich aus exokrinen und endokrinen Zellen, und seine Dysfunktion oder Überlastung verursacht mehrere Krankheiten wie Pankreatitis, Diabetes und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Um die Pathogeny des Pancreatopathy zu erhellen, ist es notwendig, den Entwicklungsprozess und die Funktion von Zellen der Bauchspeicheldrüse zu analysieren. Darüber hinaus ist eine stabile Zelle Versorgung mit robuste Qualität herstellen Zellgewebe/Supplementierung Therapie erforderlich. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für diese Zwecke, und die Differenzierung Protokoll gegen Zellen der Bauchspeicheldrüse wurde intensiv studierte1,2,3, 4. Die jüngsten Fortschritte bei der in-vitro-Erzeugung von pankreatischer β-Zellen imitieren die Generation der β-Zellen bei erwachsenen Menschen, und diese Zellen zeigen therapeutische Wirksamkeit bei der Implantation in diabetischen Modell Mäuse2,3. Darüber hinaus ergab die Analyse der β-Zellen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von gesunden und Typ 1 Diabetes Patienten Spender generiert keine funktionalen Unterschiede, auch wenn Sie unter Stress5. Darüber hinaus wurden Krankheit Phänotypen in induzierte Pankreaszellen mit Patienten abgeleitet iPSCs oder hPSCs beherbergen genetische Mutationen am gleichen Standort wie die Patienten6,7teilweise reproduziert.
Um Zellen der Bauchspeicheldrüse aus hPSCs erstellen, wird schrittweise gezielte Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert verwendet. Die Bauchspeicheldrüse leitet sich aus dem Entoderm Layer des frühen Embryos, die Geschlecht-Bestimmung von Region Y-Box 17 (SOX17) zum Ausdruck bringt und Forkhead Box A2 (FOXA2)8. Basierend auf den Studien an Mäusen, bildet die endodermische Schicht der primitiven Darm-Schlauch, der durch den Ausdruck der Hepatozyten nuklearer Faktor 1-Beta (Hnf1β) und Hepatozyten nuklearer Faktor 4-Alpha (Hnf4α) gekennzeichnet ist. Das primitive Darm Rohr verlängert und in die Atemwege Gerät, Verdauungstrakt und Organe entwickelt. Nach Dehnung, der hinteren Foregut Bereich wird der mutmaßlichen Pankreas Region, wie durch den Ausdruck der transcriptional Faktor Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1 (PDX1)8,9,10markiert. Die dorsalen und ventralen Teil der PDX1+ Darm Rohr verdicken, Form pankreatischen Knospen, die durch die Co Ausdruck der Bauchspeicheldrüse Transkription Faktor 1 Untereinheit Alpha (PTF1A) und NK6 Homeobox 1 (NKX6.1)8,11gekennzeichnet sind. Dieser Ausdruck beginnt morphologische der pankreatischen Organogenese. Pankreas Entoderm Zellen, die Komponenten der pankreatischen Knospen sind, bilden ein verzweigtes röhrenförmigen Netz von epithelialen Strukturen12 und schließlich in exokrinen und endokrinen Zellen, einschließlich der β-Zellen Insulin-sezernierenden differenzieren und Glukagon-sezernierenden α-Zellen. Ausdruck der PDX1 ist zunächst der mutmaßlichen Pankreas Region erkannt wird dann während der gesamten Bauchspeicheldrüse Entwicklung beobachtet und zeigt Lokalisierung zu β und δ-Zellen9,13,14. Obwohl die Pdx1+ Zelle Bereich, der nicht Ptf1a oder Nkx6.1 zum Ausdruck bringt unterscheidet in den Magen Antrum, Zwölffingerdarm, extrahepatische Gallenwege und einige Darmzellen bei mittleren bis späten Stadium der Entwicklung in Mäusen9PDX1+ Zellen gelten als Vorfahren der Bauchspeicheldrüse in der frühen Entwicklungsphase beim Menschen.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen für die Erzeugung von Pankreas Abstammungen. Die Protokoll Eingeweihten Differenzierung durch impfen dissoziiert Einzelzellen15,16,17. Im Allgemeinen sind undifferenzierte hPSCs als Kolonien oder Zelle Aggregate in der Schwebe oder Adhäsion gepflegt. Infolgedessen initiieren die meisten Protokolle die Differenzierung kurz nach Passagierung Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für räumliche und transkriptionelle Heterogenitäten18,19,20,21,,22, die behindern könnten die erster Differenzierung Schritt zur endgültigen Entoderm gefolgt von ineffizienten Differenzierung nach PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll kann einfache Handhabung zur Verbesserung und Stabilisierung der Differenzierung Effizienz bieten einige hPSC-Linien, die bisher gefunden wurden, ineffizient, endodermische Linien und PDX1 unterscheiden+ Zellen23, 24 , 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:617px;" width="616">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">3-Keto-N-aminoethyl-N&#8242;-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine</td>
			<td style="width:100px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">K171000</td>
			<td style="width:172px;">CYC</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">SC-203303</td>
			<td style="width:172px;">TTNPB</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339652</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y]</td>
			<td style="width:100px;">Abcam</td>
			<td style="width:123px;">Ab76541</td>
			<td style="width:172px;">Anti-CDX2, &#215; 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">B-27 Supplement (50 &#215;)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">17504-044</td>
			<td style="width:172px;">Serum-free supplement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">BD FACSAria II Cell Sorter</td>
			<td style="width:100px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Biomedical freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U538</td>
			<td>For -30 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450011</td>
			<td style="width:172px;">Counting slide glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR</td>
			<td style="width:100px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">657165</td>
			<td style="width:172px;">For differentiation culture/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">AX-310</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">MX-305</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:100px;">Axon Medchem</td>
			<td style="width:123px;">Axon 1386</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CLEAN BENCH</td>
			<td style="width:100px;">SHOWA KAGAKU&#160;</td>
			<td style="width:123px;">S-1601PRV</td>
			<td style="width:172px;">Clean bench</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Corning CellBIND 6-well plate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3335</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td style="width:172px;">Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Corning Synthemax II-SC Substrate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3535</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cryostat</td>
			<td style="width:100px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">Leica CM1510 S</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm Kit</td>
			<td style="width:100px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">554714</td>
			<td style="width:172px;">Perm/Wash buffer is&#160; Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Dako pen</td>
			<td style="width:100px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S2002</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">dNTP mix (10 mM)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18427-088</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A11055</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10036</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10040</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:100px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:123px;">S30</td>
			<td style="width:172px;">Donkey serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-PBS(-) without Ca or Mg</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">14249-95</td>
			<td style="width:172px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Essential 8 Medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A1517001</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">352235</td>
			<td style="width:172px;">5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 1000 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-1000S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P20S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 200 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P200S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Keyence</td>
			<td style="width:123px;">BZ-X700</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Forma Steri-Cycle CO2 incubator</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">370A</td>
			<td style="width:172px;">Incubator</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-1&#946; Antibody (C-20)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-7411</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF1&#946;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-4&#945; Antibody (H-171)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-8987</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF4&#945;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">H3570</td>
			<td style="width:172px;">For nucleus staining, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Human Pancreas Total RNA</td>
			<td style="width:100px;">Ambion</td>
			<td style="width:123px;">AM7954</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human PDX-1/IPF1 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF2419</td>
			<td style="width:172px;">Anti-PDX1, goat IgG, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human SOX17 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF1924</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX17, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Improved MEM Zinc Option medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">10373-017</td>
			<td style="width:172px;">iMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Incubation chamber</td>
			<td style="width:100px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:123px;">10DO</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Latex Examination Gloves</td>
			<td style="width:100px;">Adachi</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MAS coated slide glass</td>
			<td style="width:100px;">Matsunami Glass</td>
			<td>83-1881</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:123px;">CKX41N-31PHP</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microtube</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">131-515CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Monoclonal Anti-&#945;-Fetoprotein</td>
			<td style="width:100px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A8452</td>
			<td style="width:172px;">Anti-AFP, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Nanodeop 8000</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Oligo dT</td>
			<td style="width:100px;">FASMAC</td>
			<td style="width:123px;">Custom made Oligo&#160;</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR of sequence is &#34;TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde, powder</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">26126-54</td>
			<td style="width:172px;">PFA, fixative, diluted in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Pharmaceutical refrigerator</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MPR-514</td>
			<td>For 4 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">PIPETMAN P&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GILSON</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">Pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human KGF/FGF-7</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">251-KG</td>
			<td style="width:172px;">KGF</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Recombinant Human Noggin</td>
			<td style="width:100px;">PeproTech</td>
			<td style="width:123px;">120-10C</td>
			<td style="width:172px;">NOGGIN</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">338-AC</td>
			<td style="width:172px;">Activin A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">ReverTra Ace (100 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:100px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:123px;">TRT-101</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rnase-Free Dnase Set (50)</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">79254</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">74104</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640 with L-Gln</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">30264-85</td>
			<td style="width:172px;">RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sealing Film for Real Time</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td style="width:123px;">NJ500</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 10 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 25 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 5 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4487</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td>
			<td style="width:100px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:123px;">3579S</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX2, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">StepOnePlus</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sucrose</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td>30406-25</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">TB Green 
			Premix Ex Taq II&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td>RR820B</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450101J1</td>
			<td style="width:172px;">Automatic cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek OCT compound 4583&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">35501-15</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450021</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Ultracold freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U33V</td>
			<td>For -80 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15575-038</td>
			<td style="width:172px;">Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Y-27632</td>
			<td style="width:100px;">Wako</td>
			<td style="width:123px;">251-00514</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures

Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für regenerative Medizin und als Plattform für menschliche Entwicklungsprozesse zu studieren. Stufenweise gerichtet, Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert ist einer der wichtigsten Wege, einschließlich Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Zellen der Bauchspeicheldrüse zu generieren (PDX1+) Pankreas Vorläuferzellen. Konventionelle Protokolle initiieren die Differenzierung mit kleinen Kolonien kurz nach dem Durchgang. Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für Heterogenitäten, die die Differenzierung zu PDX1 behindern könnte+ Zellen. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen. Das Protokoll besteht aus vier Schritten und initiiert die Differenzierung nach Aussaat dissoziierten Einzelzellen. Die Induktion von SOX17+ endgültige Entoderm Zellen folgte der Ausdruck der beiden primitiven Darm Rohr Marker, HNF1β und HNF4α und eventuelle Differenzierung in PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll bietet einfache Handhabung zu verbessern und stabilisieren die Differenzierung Effizienz einiger hPSC Zeilen, die bisher gefunden wurden, um ineffizient in endodermische Linien oder PDX1 zu unterscheiden+ Zellen.

Verbreitende HiPSCs (585A129,30) verdichten sich und bilden eine homogene Monolayer (Abbildung 1 b), die zur Differenzierung geeignet ist. Undifferenzierte HiPSCs (Stufe 0) sind getrennt und neu ausgesät als Einzelzellen bei niedrigen Zelldichten (1-1,5 x 105 Zellen/cm2). Innerhalb von 1 h die Zellen sind an der Platte befestigt und zu Vorsprung zu zeigen beginnen. Am 1. Tag werden die Zellen stark vermehrt und...

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Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass vor der Stimulation, Zellen gleichmäßig verteilt und dann gleichmäßig in Tandem-Zell-Adhäsion stimuliert werden. Demonstriert wird das Verfahren von Azuma Kimura, einer Doktorandin unseres Labors. Um dieses Verfahren zu beginnen, übertragen Sie sechs Milliliter RPMI 1640 in eine auf vier Grad Celsius gekühlte Röhre auf Eis.Mit gekühlten ein Milliliter Pipettenspitzen, fügen Sie zwei Milligramm Keller Membran Matrix. Mischen Sie gut durch sanfte Pipettierung, um es eine Kellermembran-Matrix mit einer Konzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter zu machen. Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um zwei Milliliter der verdünnten Kellermembranmatrix in jeden Brunnen einer Sechs-Well-Zell-Kulturplatte zu übertragen.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 60 bis 90 Minuten. Danach halten Sie die Platte bis zu drei Stunden bei Raumtemperatur, bis sie einsatzbereit ist. Zuerst aspirieren Sie das verwendete Medium und verwenden Sie eine Pipette, um zwei Milliliter 0,5 Millimolar EDTA zu jedem Brunnen hinzuzufügen, um die in der Sechs-Brunnen-Platte kultivierten hPCSs zu waschen.Dann die EDTA aus den Brunnen aspirieren und zwei Milliliter frische 0,5 Millimolar EDTA zu jedem Brunnen hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Danach, aspirieren Sie die EDTA aus jedem Brunnen.Fügen Sie einen Milliliter hPSC Wartungsmedium bei Raumtemperatur, ergänzt mit 10 Mikromolar Y27632 zu jedem Brunnen. Pipette sanft, aber schnell, um die angeschlossenen Zellen auf der Platte abzublasen und alle verklumpten Zellen in einzelne Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit vier MilliliterhPS-Wartungsmedium, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y27632 pro Brunnen, und mischen Sie sie durch Pipetten.Als nächstes mischen Sie 15 Mikroliter Zellsuspension mit 15 Mikroliter Trypanblau in der Röhre. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um 10 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension in doppelter Ausführung simperbar in zellzählige Dias zu übertragen. Zählen Sie mithilfe eines automatisierten Zellzählers die Zellenzahl, und berechnen Sie die Zelldichte in der Zellsuspension.Ordnen Sie die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-Rohr mit einer Dichte von ein bis eineinhalb Millionen Zellen für jeden zu verwendenden Brunnen zu. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 200 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Danach verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu aspirieren und die Zellen mit einem Milliliter Stufe 1A Medium pro Brunnen wieder aufzuhängen.Die Zellsuspension vorsichtig pipette und dann einen weiteren Milliliter Stufe 1A Medium pro Brunnen hinzufügen. Mit einer 1000-Mikroliter-Pipette die verdünnte Kellermembranmatrix aus den Brunnen der zuvor vorbereiteten Zellkulturplatte ansaugen. Sofort die Aufhängung im Rohr sanft abpfeifen und zwei Milliliter in jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte übertragen.Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen, und legen Sie die Platte 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur auf eine saubere Bank. Danach die Platte vorsichtig 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in einen Inkubator geben. Zuerst schütteln Sie die Platte vorsichtig und verwenden Sie eine Pipette, um das verwendete Medium zu aspirieren.Fügen Sie dann zwei Milliliter DPBS zu jedem Brunnen hinzu. Schütteln Sie die Platte vorsichtig wieder und aspirieren Sie die verwendete DPBS. Fügen Sie vier Milliliter Stufe 1B Medium, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius, zu jedem Brunnen.Übertragen Sie die Platte vorsichtig 48 Stunden lang auf einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in kultur. Danach die Platte vorsichtig schütteln und das verwendete Medium ansaugen. Fügen Sie zwei Milliliter DPBS zu jedem Brunnen hinzu.Wiederholen Sie diese Aspiration und Ergänzung von DPBS ein weiteres Mal. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und aspirieren Sie die verwendete DPBS. Fügen Sie vier Milliliter Stufe 1B Medium, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius, zu jedem Brunnen.Übertragen Sie die Platte vorsichtig auf einen Inkubator, bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in kultur für 24 Stunden. Zuerst schütteln Sie die Platte vorsichtig und aspirieren Sie das verwendete Medium. Fügen Sie zwei Milliliter DPBS zu jedem Brunnen der Sechs-Well-Platte hinzu.Dann schütteln Sie die Platte vorsichtig und aspirieren Sie die verwendeten DPBS. Fügen Sie vier Milliliter Stufe zwei Medium, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius, zu jedem Brunnen. Übertragen Sie die Platte vorsichtig vier Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in die Kultur.Schütteln Sie die Platte vorsichtig und aspirieren Sie das verwendete Medium. Fügen Sie zwei Milliliter DPBS zu jedem Brunnen hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang des Ansamittentenunds und Hinzufügens von DPPS erneut.Danach die Platte vorsichtig schütteln und die verwendete DPBS ansaugen. Fügen Sie vier Milliliter Stufe drei Medium, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius, zu jedem Brunnen. Übertragen Sie die Platte vorsichtig auf einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und einer befeuchteten Atmosphäre in kultur für drei Tage.In dieser Studie werden propagierende hIPSEs kondensiert und bilden eine homogene Monoschicht, die für die Differenzierung geeignet ist. Undifferenzierte hIPSEs werden dissoziiert und als Einzelzellen bei geringer Zelldichte neu gesetzt. Innerhalb einer Stunde werden die Zellen an der Platte befestigt und beginnen, Vorsprung zu zeigen.Am ersten Tag werden die Zellen vermehrt und gut verteilt, um 80 bis 90% der Oberfläche zu bedecken. An den Tagen drei und vier bilden die Zellen ein homogenes Monolayer-Blatt, das als Kopfsteinpflaster-Erscheinungsbild beschrieben werden kann. An diesem Punkt beenden die meisten Zellen die Exprimion von SOX2, einem Marker für undifferenzierte Zellen, und drücken stattdessen einen definitiven Endodermmarker, SOX17, bei mehr als 90% Ausdrücken von FOXA2 aus.Dann beginnen die Zellen, die primitiven Goptupe-Marker, HNF1-beta und HNF4-alpha auszudrücken, und schließlich drücken sie einen hinteren Foregrate Pankreas-Vorläufermarker, PDX1, bei mehr als 90%Die PDX1-positive Zellinduktion ist reproduzierbar in einer anderen hIPSE-Linie, 1231A3, und einer hESE-Linie, KhES-3. DIE QRTPCR-Ergebnisse der MRNA-Expression von Stufenmarkern stimmen mit der Immunfärbung überein und die MRNA-Expression von PDX1 ist auf Stufe drei offensichtlich und nimmt danach erheblich zu. Da undifferenzierte ESIPS-Zellen als Kolonien angebaut werden, befinden sich einzelne Zellen lokal in einem anderen Zustand.Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, Zellen gleichmäßig für die gewählte Differenzierung zu stimulieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...