Name: efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures at JoVE.com

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מימון מן האגודה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) דרך Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI גרנט Number15K09385 ו- 18 K 08510) טי, מענק הסיוע עבור עמיתי מחקר JSPS (מספר גרנט KAKENHI של JSPS 17J07622) משום מקום, ועבור הסוכנות יפן למחקר רפואי, פיתוח (AMED) באמצעות המחקר שלה להעניק "מרכז הליבה עבור שב"ס תא מחקר, מרכז מחקר ברשת המימוש של רפואה רגנרטיבית"בנוקאאוט המחברים תודה ד ר פיטר Karagiannis לקרוא את כתב היד.

ניסויים באמצעות hPSCs אושרו על ידי ועדת האתיקה של החוג לרפואה, בוגר ביה ס לרפואה, אוניברסיטת קיוטו.
1. הכנה של חומרים
הערה: להכין כל מדיה, ריאגנטים תרבית תאים בסביבה סטרילית. לחמם בסיס מדיה תרבות לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש. בינוני עבור בידול מש...

<ol>
	<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC+technology-based+regenerative+therapy+for+diabetes.">iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes.</a> Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).</li><li>Millman, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stem+cell-derived+beta-cells+from+patients+with+type+1+diabetes.">Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes.</a> Nature Communications. 7, 11463 (2016).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Hosokawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+derived+from+'induced+pluripotent+stem+cells'+of+patients+with+fulminant+type+1+diabetes:+Vulnerability+to+cytokine+insults+and+increased+expression+of+apoptosis-related+genes.">Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes.</a> Journal of Diabetes Investigation. , (2017).</li><li>Jennings, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+pancreas+from+foregut+to+endocrine+commitment.">Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment.</a> Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).</li><li>Jorgensen, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+review+of+early+pancreas+development+in+the+mouse.">An illustrated review of early pancreas development in the mouse.</a> Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).</li><li>Jensen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+factors+in+pancreatic+development.">Gene regulatory factors in pancreatic development.</a> Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).</li><li>Hald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+Ptf1a+antiserum+and+localization+of+Ptf1a+in+relation+to+Nkx6.1+and+Pdx1+during+the+earliest+stages+of+mouse+pancreas+development.">Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).</li><li>Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).</li><li>Riedel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterisation+of+cells+co-producing+insulin+and+glucagon+in+the+developing+human+pancreas.">Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas.</a> Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).</li><li>Mae, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells.">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 4, 1367 (2013).</li><li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells.">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li><li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-Associated+Kinases+and+Non-muscle+Myosin+IIs+Inhibit+the+Differentiation+of+Human+iPSCs+to+Pancreatic+Endoderm.">Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).</li><li>Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell+culture:+considerations+for+maintenance,+expansion,+and+therapeutics.">Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Nguyen, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+cellular+heterogeneity+and+cell+state+transitions+between+subpopulations.">Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations.</a> Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).</li><li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edges+of+human+embryonic+stem+cell+colonies+display+distinct+mechanical+properties+and+differentiation+potential.">Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential.</a> Scientific Reports. 5, 14218 (2015).</li><li>Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+heterogeneity+in+pluripotent+stem+cells:+a+stochastic+advantage.">Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage.</a> Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).</li><li>Cahan, P., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+implications+of+pluripotent+stem+cell+variability+and+heterogeneity.">Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).</li><li>Chetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+tool+to+improve+pluripotent+stem+cell+differentiation.">A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation.</a> Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).</li><li>Kimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+AT7867+proliferates+PDX1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland.">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li><li>Suemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+establishment+of+human+embryonic+stem+cell+lines+and+long-term+maintenance+with+stable+karyotype+by+enzymatic+bulk+passage.">Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).</li><li>Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+cell+seeding+density+influences+pancreatic+endocrine+development+during+in+vitro+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+NKX6-1++pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li><li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice.">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li><li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).</li><li>Hohwieler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+acinar/ductal+organoids+generate+human+pancreas+upon+orthotopic+transplantation+and+allow+disease+modelling.">Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling.</a> Gut. 66 (3), 473-486 (2017).</li><li>Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endodermal+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+insulin-producing+cells+in+3D+culture.">Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture.</a> Scientific Reports. 4, 4488 (2014).</li></ol>

הדור של PDX1+ תאים מורכבת מרובי שלבים; לכן, חיוני לטיפול תאי בזמן המתאים. בין הצעדים, יעילות אינדוקציה האנדודרם סופי משפיע במידה רבה את היעילות אינדוקציה הסופי, יכול להיות הפרעה מזהמים שושלת היוחסין תאים אחרים (קרי, והמזודרם ו האאקטודרם), אשר עשוי להתרבות ו/או מפרישים על ידי גורמים לשבש ?...

הלבלב מורכבת בעיקר תאים האנדוקרינית אקסוקרינית, תפקוד לקוי או עומס יתר שלה גורם מספר מחלות, כמו לבלב, סוכרת וסרטן הלבלב. התירי את pathogeny של pancreatopathy, יש צורך לנתח את תהליך התפתחותי והתפקוד של תאים בלבלב. בנוסף, היצע תא יציב עם איכות נדרש להקים תא/רקמות תוספת של טיפול. תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר בתאי הלבלב הם מקור תא מבטיח למטרות אלו, פרוטוקול בידול כלפי בתאי הלבלב כבר למד באופן אינטנסיבי1,2,3, 4. התפתחויות אחרונות הדור במבחנה של תאי β בלבלב לחקות את הדור של תאי β אדם מבוגר, תאים אלה הצג יעילות טיפולית על ההשתלה לתוך מודל סוכרתית-עכברים-2,-3. בנוסף, ניתוח הנתונים של תאי β שנוצר בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) של בריאה, תורמים לחולה סוכרת סוג 1 גילה אין הבדלים תפקודיים כולל כאשר תחת מתח5. יתר על כן, המחלה פנוטיפים כבר חלקית שפירטתי ב המושרה בתאי הלבלב עם המטופל, נגזר iPSCs או hPSCs מחסה מוטציות גנטיות באותו אתר כמו המטופלים6,7.
לייצר תאי הלבלב hPSCs, משמש stepwise התמיינות מכוונת את recapitulates תהליכים התפתחותיים. הלבלב נגזרת לשכבת האנדודרם של העובר מוקדם, המבטאת סקס קביעת אזור Y-box 17 (SOX17) ו- forkhead תיבת A2 (FOXA2)8. על סמך המחקרים העכבר, השכבה endodermal טפסים ברכבת התחתית בטן פרימיטיבי, אשר מסומנת על ידי הביטוי של hepatocyte גרעיני גורם 1-בטא (Hnf1β) ו- 4 גרעיני גורם hepatocyte-alpha (Hnf4α). הצינור בטן פרימיטיביים מאריך ומפתחת לתוך מערכת הנשימה, מערכת העיכול, איברים. לאחר התארכות, האזור האחורי במעי הקדמי הופך האזור הלבלב הרב, שעורר, לפי המסומן על-ידי הביטוי של החלבון פקטור תעתיק הלבלב/תריסריון גנים homeobox 1 (PDX1)8,9,10. החלקים הגבי ו הגחון של PDX1+ בטן צינור לעבות את הטופס ניצנים הלבלב, אשר מסומנים על-ידי הביטוי שיתוף של הלבלב שעתוק מקדם 1 יחידה משנית אלפא (PTF1A), NK6 גנים homeobox (NKX6.1) 18,11. ביטוי זה מסמן את תחילת מורפולוגיים organogenesis הלבלב. תאי הלבלב האנדודרם, שהם מרכיבים של בלוטות הלבלב, יוצרים רשת צינורי מסועף של מבנים אפיתל12 , להבדיל בסופו של דבר לתוך תאים האנדוקרינית אקסוקרינית, לרבות תאי-β הורמון האינסולין, α מפריש גלוקגון-תאים. הביטוי של PDX1 הוא זוהה לראשונה אצל הרב, שעורר באזור הלבלב, אשר נצפית ואז במהלך פיתוח הלבלב כולו ומראה לוקליזציה β-אלפא-תאים ו9,13,14. למרות Pdx1+ אזור תא המבטאים לא Ptf1a או Nkx6.1 מבדילה את antrum קיבה, תריסריון, צינור המרה extrahepatic ואת מספר תאים מעיים באמצע לשלב מאוחר של התפתחות אצל עכברים9, PDX1+ תאים נחשבים המוצא לאגס התרבותי הלבלב בשלב התפתחותי מוקדם אצל בני אדם.
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להתמיין hPSCs PDX1+ תאים לדור של שושלות הלבלב. הבידול יוזם פרוטוקול על ידי זריעה הפומבית תאים בודדים15,16,17. באופן כללי, hPSCs מובחן מתוחזקים מושבות או אגרגטים תא השעיה או אדהזיה. כתוצאה מכך, ברוב הפרוטוקולים ליזום את הבידול זמן קצר לאחר passaging. עם זאת, במצב של מושבות או אגרגטים, התאים הם נוטים המרחבי, תעתיק heterogeneities18,19,20,21,22, אשר ייתכן ה"בלתי בידול צעד לקראת סופי האנדודרם ואחריו בידול לא יעיל כדי PDX1+ תאים. בפרוטוקול הנוכחי עשוי להציע טיפול קל כדי לשפר ולייצב את היעילות בידול של כמה שורות hPSC שנמצאו בעבר להבדיל באופן לא יעיל שושלות endodermal, PDX1+ תאים23, 24 , 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:617px;" width="616">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">3-Keto-N-aminoethyl-N&#8242;-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine</td>
			<td style="width:100px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">K171000</td>
			<td style="width:172px;">CYC</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">SC-203303</td>
			<td style="width:172px;">TTNPB</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339652</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y]</td>
			<td style="width:100px;">Abcam</td>
			<td style="width:123px;">Ab76541</td>
			<td style="width:172px;">Anti-CDX2, &#215; 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">B-27 Supplement (50 &#215;)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">17504-044</td>
			<td style="width:172px;">Serum-free supplement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">BD FACSAria II Cell Sorter</td>
			<td style="width:100px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Biomedical freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U538</td>
			<td>For -30 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450011</td>
			<td style="width:172px;">Counting slide glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR</td>
			<td style="width:100px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">657165</td>
			<td style="width:172px;">For differentiation culture/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">AX-310</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">MX-305</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:100px;">Axon Medchem</td>
			<td style="width:123px;">Axon 1386</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CLEAN BENCH</td>
			<td style="width:100px;">SHOWA KAGAKU&#160;</td>
			<td style="width:123px;">S-1601PRV</td>
			<td style="width:172px;">Clean bench</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Corning CellBIND 6-well plate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3335</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td style="width:172px;">Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Corning Synthemax II-SC Substrate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3535</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cryostat</td>
			<td style="width:100px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">Leica CM1510 S</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm Kit</td>
			<td style="width:100px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">554714</td>
			<td style="width:172px;">Perm/Wash buffer is&#160; Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Dako pen</td>
			<td style="width:100px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S2002</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">dNTP mix (10 mM)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18427-088</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A11055</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10036</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10040</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:100px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:123px;">S30</td>
			<td style="width:172px;">Donkey serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-PBS(-) without Ca or Mg</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">14249-95</td>
			<td style="width:172px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Essential 8 Medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A1517001</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">352235</td>
			<td style="width:172px;">5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 1000 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-1000S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P20S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 200 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P200S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Keyence</td>
			<td style="width:123px;">BZ-X700</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Forma Steri-Cycle CO2 incubator</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">370A</td>
			<td style="width:172px;">Incubator</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-1&#946; Antibody (C-20)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-7411</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF1&#946;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-4&#945; Antibody (H-171)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-8987</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF4&#945;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">H3570</td>
			<td style="width:172px;">For nucleus staining, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Human Pancreas Total RNA</td>
			<td style="width:100px;">Ambion</td>
			<td style="width:123px;">AM7954</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human PDX-1/IPF1 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF2419</td>
			<td style="width:172px;">Anti-PDX1, goat IgG, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human SOX17 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF1924</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX17, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Improved MEM Zinc Option medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">10373-017</td>
			<td style="width:172px;">iMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Incubation chamber</td>
			<td style="width:100px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:123px;">10DO</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Latex Examination Gloves</td>
			<td style="width:100px;">Adachi</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MAS coated slide glass</td>
			<td style="width:100px;">Matsunami Glass</td>
			<td>83-1881</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:123px;">CKX41N-31PHP</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microtube</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">131-515CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Monoclonal Anti-&#945;-Fetoprotein</td>
			<td style="width:100px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A8452</td>
			<td style="width:172px;">Anti-AFP, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Nanodeop 8000</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Oligo dT</td>
			<td style="width:100px;">FASMAC</td>
			<td style="width:123px;">Custom made Oligo&#160;</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR of sequence is &#34;TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde, powder</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">26126-54</td>
			<td style="width:172px;">PFA, fixative, diluted in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Pharmaceutical refrigerator</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MPR-514</td>
			<td>For 4 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">PIPETMAN P&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GILSON</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">Pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human KGF/FGF-7</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">251-KG</td>
			<td style="width:172px;">KGF</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Recombinant Human Noggin</td>
			<td style="width:100px;">PeproTech</td>
			<td style="width:123px;">120-10C</td>
			<td style="width:172px;">NOGGIN</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">338-AC</td>
			<td style="width:172px;">Activin A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">ReverTra Ace (100 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:100px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:123px;">TRT-101</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rnase-Free Dnase Set (50)</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">79254</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">74104</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640 with L-Gln</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">30264-85</td>
			<td style="width:172px;">RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sealing Film for Real Time</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td style="width:123px;">NJ500</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 10 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 25 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 5 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4487</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td>
			<td style="width:100px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:123px;">3579S</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX2, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">StepOnePlus</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sucrose</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td>30406-25</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">TB Green 
			Premix Ex Taq II&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td>RR820B</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450101J1</td>
			<td style="width:172px;">Automatic cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek OCT compound 4583&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">35501-15</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450021</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Ultracold freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U33V</td>
			<td>For -80 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15575-038</td>
			<td style="width:172px;">Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Y-27632</td>
			<td style="width:100px;">Wako</td>
			<td style="width:123px;">251-00514</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures

תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר בתאי הלבלב הם מקור תא מבטיח עבור רפואה רגנרטיבית ופלטפורמה ללמוד תהליכים פיתוחיים אנושי. Stepwise ביים בידול זה recapitulates תהליכים פיתוחיים היא אחת הדרכים הגדולות ביותר ליצירת תאי הלבלב כולל הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) ובתאים הלבלב. פרוטוקולים קונבנציונאלי ליזום את הבידול עם מושבות קטנות זמן קצר לאחר המעבר. עם זאת, במצב של מושבות או אגרגטים, התאים הם נוטים heterogeneities, אשר ייתכן ה"בלתי הבידול כדי PDX1+ תאים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להתמיין hPSCs PDX1+ תאים. הפרוטוקול כוללת ארבעה שלבים ויוזמת את הבידול על ידי תאים בודדים הפומבית זריעה. אינדוקציה של SOX17+ תאים האנדודרם סופית בעקבות הביטוי של סמנים צינור שני הבטן פרימיטיבית, HNF1β, HNF4α, בידול בסופו של דבר לתוך PDX1+ תאים. בפרוטוקול הנוכחי מספק טיפול קל, עשוי לשפר ולייצב את היעילות בידול של כמה שורות hPSC שנמצאו בעבר להבדיל באופן לא יעיל שושלות endodermal או PDX1+ תאים.

HiPSCs כציוד (29,585A130) הם מרוכז ויוצרים טפט הומוגנית (איור 1B) מתאים בידול. HiPSCs מובחן (שלב 0) חלופה מועדפת, נזרע מחדש כתאי יחיד-צפיפות התאים נמוך (1-1.5 x5 10 תאים/cm2). בתוך 1 h, התאים מחוברים לצלחת ומתחילים להראות בליטה. יום 1, התאים הם התרבו, מחולק...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures at JoVE.com

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחין בתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) לתוך הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) תאים עבור הדור של שושלות הלבלב בהתבסס על הגידול חד שכבתי ללא-המושבה סוג של חלופה מועדפת תאים בודדים. שיטה זו מתאימה בהפקת הומוגנית נגזר hPSC תאים, מניפולציה גנטית וסינון.

יעיל הדור של הלבלב/תריסריון גנים Homeobox חלבון 1+ אבות הלבלב במעי הקדמי/אחורי של hPSCs בתרבויות אדהזיה

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלפני הגירוי, התאים מפוזרים באופן שווה ולאחר מכן מגורה באופן שווה בהיתוך תאים דו-מושביים. הדגמת ההליך תהיה אזומה קימורה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, להעביר שישה מיליליטר של RPMI 1640 לתוך צינור מקורר לארבע מעלות צלזיוס על קרח.בעזרת טיפים מקוררים של פיפיטר אחד מיליליטר, הוסיפו שני מיליגרם של מטריצת קרום מרתף. מערבבים היטב על ידי צינורות עדינים כדי להפוך אותו מטריצת קרום מרתף עם ריכוז של 0.33 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, השתמשו בפיגט כדי להעביר שני מיליליטר של מטריצת קרום המרתף המדוללת לכל באר של צלחת תרבות תאים בת שש בארות.דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 עד 90 דקות. לאחר מכן, לשמור על הצלחת בטמפרטורת החדר עד שלוש שעות, עד מוכן לשימוש. ראשית, שאפו את המדיום המשמש והשתמשו בפיפטה כדי להוסיף שני מיליליטר של EDTA 0.5 מילימולר לכל באר כדי לשטוף את hPCSs בתרבות בצלחת שש בארות.לאחר מכן, שאפו את ה- EDTA מה בארות והוסיפו שני מיליליטר של EDTA טרי 0.5 מילימולר לכל באר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו את ה-EDTA מכל באר.הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום תחזוקת hPSC בטמפרטורת החדר, בתוספת 10 מיקרומולרים Y27632 לכל באר. פיפטה בעדינות אך במהירות כדי לפוצץ את התאים המחוברים על הצלחת כדי לנטרל את כל התאים מקובצים לתאים בודדים. העבר את ההשעיה התא בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של אמצעי תחזוקה hPSC בתוספת 10 micromolar Y27632 ל הבאר לערבב על ידי pipetting.לאחר מכן, מערבבים 15 מיקרוליטרים של השעיית תאים עם 15 מיקרוליטרים של כחול טריפאן בצינור. השתמש פיפסה 10 microliter להעביר 10 microliters של המתלים תא מדולל לתוך תא ספירת שקופיות כפולות. באמצעות מונה תאים אוטומטי, ספור את מספר התא וחשב את צפיפות התאים בהשעיית התא.להקצות את ההשעיה התא לתוך צינור 50 מיליליטר בצפיפות של אחד עד מיליון וחצי תאים עבור כל באר לשמש. צנטריפוגה הצינור ב 200 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי לשאפת את supernatant מחדש להשעות את התאים באמצעות מיליליטר אחד של שלב 1A בינוני ל הבאר.בעדינות pipette ההשעיה התא ולאחר מכן להוסיף עוד מיליליטר אחד של שלב 1A בינוני ל הבאר. באמצעות פיפט 1000 מיקרוליטר, שאפו את מטריצת קרום המרתף המדוללת מ הבארות של צלחת תרבות התאים שהוכנה קודם לכן. מיד pipette ההשעיה בצינור בעדינות ולהעביר שני מיליליטר לתוך כל באר של צלחת שש באר.מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור ומ מניחים את הצלחת על ספסל נקי בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ואטמוספירה לחה במשך 24 שעות. ראשית, לנער בעדינות את הצלחת ולהשתמש פיפטה כדי לשוכך את המדיום בשימוש.לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של DPBS לכל באר. לנער בעדינות את הצלחת שוב ושואפים את DPBS בשימוש. מוסיפים ארבעה מיליליטר של שלב 1B בינוני, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, לכל באר.מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ואטמוספירה לחה לתרבות למשך 48 שעות. לאחר מכן, לנער בעדינות את הצלחת ולוותר את המדיום בשימוש. הוסף שני מיליליטר של DPBS לכל באר.חזור על שאיפה זו ותוספת של DPBS פעם נוספת. לנער בעדינות את הצלחת ושואפים את ה- DPBS המשמש. מוסיפים ארבעה מיליליטר של שלב 1B בינוני, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, לכל באר.מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור, ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ואווירה לחה לתרבות במשך 24 שעות. ראשית, לנער בעדינות את הצלחת ולוותר את המדיום המשמש. הוסף שני מיליליטר של DPBS לכל באר של צלחת שש בארות.לאחר מכן, לנער בעדינות את הצלחת ושואפים את DPBS בשימוש. מוסיפים ארבעה מיליליטר של שלב שני בינוני, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, לכל באר. מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ואווירה לחה לתרבות במשך ארבעה ימים.מנערים בעדינות את הצלחת ושווים את המדיום המשמש. הוסף שני מיליליטר של DPBS לכל באר. חזור על תהליך זה של שאספירה והוספת DPPS פעם נוספת.לאחר מכן, לנער בעדינות את הצלחת ולופות את DPBS בשימוש. מוסיפים ארבעה מיליליטר של שלב שלוש בינוני, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, לכל באר. מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ואווירה לחה לתרבות למשך שלושה ימים.במחקר זה, hIPSEs הפצה מרוכזים ויוצרים monolayer הומוגני שמתאים ההידול. hIPSEs מופקדים ניתוקים ונזרעים מחדש כתאים בודדים בצפיפות תאים נמוכה. תוך שעה, התאים מחוברים לצלחת ומתחילים להראות בלט.ביום הראשון, התאים מתרבים ומופצים היטב כדי לכסות 80 עד 90% משטח הפנים. בימים 3 ו-4, התאים יוצרים גיליון מונוליאר הומוגני שניתן לתארו כמקרה מרוצף אבן. בשלב זה, רוב התאים להפסיק להביע SOX2, שהוא סמן עבור תאים מופקים, ובמקום לבטא סמן endoderm סופי, SOX17, על יותר מ 90%רוב התאים SOX17 חיובי לבטא FOXA2.ואז התאים מתחילים לבטא את סמני goptupe פרימיטיבי, HNF1-בטא ו HNF4-אלפא, ובסופו של דבר להביע סמן הלבלב הלבלב החוץ רחמי, PDX1, ב יותר מ 90%TDX1 חיובי אינדוקציה התא הוא רבייה בקו hIPSE אחר, 1231A3, ו קו hESE, KhES-3. תוצאות QRTPCR של ביטוי MRNA של סמני שלב עולים בקנה אחד עם immunostaining ואת ביטוי MRNA של PDX1 ניכר בשלב שלוש ועליות משמעותיות לאחר מכן. מאז תאי ESIPS מו מווסתים גדלים כמושבות, תאים בודדים נמצאים באופן מקומי במצב שונה.פרוטוקול זה מספק דרך לעורר תאים באופן שווה עבור ההתברמות שנבחרה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...