Name: efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures at JoVE.com

इस काम के हिस्से में वैज्ञानिक अनुसंधान के माध्यम से विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS) से धन द्वारा समर्थित किया गया था (सी) (JSPS KAKENHI अनुदान Number15K09385 और 18K08510) टीटी करने के लिए, और अनुदान में सहायता JSPS अनुसंधान अध्येताओं के लिए (JSPS KAKENHI अनुदान संख्या 17J07622) के लिए मुख़र्जी, और जापान एजेंसी चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए (एमएड) अपने अनुसंधान अनुदान के माध्यम से "कोर केंद्र आईपीएस सेल रिसर्च के लिए, पुनर्योजी चिकित्सा की प्राप्ति के लिए अनुसंधान केंद्र नेटवर्क" K.O. करने के लिए लेखकों ने पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ पीटर कर्गिआनस का शुक्रिया अदा की ।

एचपीएससीज का प्रयोग करते हुए चिकित्सा विभाग और ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन, क्योटो विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा प्रयोग अनुमोदित किए गए थे ।
1. सामग्रियों की तैयारी
न?...

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	<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li><li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro.">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC+technology-based+regenerative+therapy+for+diabetes.">iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes.</a> Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).</li><li>Millman, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stem+cell-derived+beta-cells+from+patients+with+type+1+diabetes.">Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes.</a> Nature Communications. 7, 11463 (2016).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery.">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li><li>Hosokawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-producing+cells+derived+from+'induced+pluripotent+stem+cells'+of+patients+with+fulminant+type+1+diabetes:+Vulnerability+to+cytokine+insults+and+increased+expression+of+apoptosis-related+genes.">Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes.</a> Journal of Diabetes Investigation. , (2017).</li><li>Jennings, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+pancreas+from+foregut+to+endocrine+commitment.">Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment.</a> Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).</li><li>Jorgensen, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+illustrated+review+of+early+pancreas+development+in+the+mouse.">An illustrated review of early pancreas development in the mouse.</a> Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).</li><li>Jensen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+factors+in+pancreatic+development.">Gene regulatory factors in pancreatic development.</a> Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).</li><li>Hald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+Ptf1a+antiserum+and+localization+of+Ptf1a+in+relation+to+Nkx6.1+and+Pdx1+during+the+earliest+stages+of+mouse+pancreas+development.">Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).</li><li>Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).</li><li>Serup, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeodomain+protein+IPF-1/STF-1+is+expressed+in+a+subset+of+islet+cells+and+promotes+rat+insulin+1+gene+expression+dependent+on+an+intact+E1+helix-loop-helix+factor+binding+site.">The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site.</a> Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).</li><li>Riedel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterisation+of+cells+co-producing+insulin+and+glucagon+in+the+developing+human+pancreas.">Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas.</a> Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).</li><li>Mae, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells.">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 4, 1367 (2013).</li><li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells.">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li><li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-Associated+Kinases+and+Non-muscle+Myosin+IIs+Inhibit+the+Differentiation+of+Human+iPSCs+to+Pancreatic+Endoderm.">Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).</li><li>Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell+culture:+considerations+for+maintenance,+expansion,+and+therapeutics.">Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories.">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Nguyen, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+reveals+cellular+heterogeneity+and+cell+state+transitions+between+subpopulations.">Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations.</a> Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).</li><li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edges+of+human+embryonic+stem+cell+colonies+display+distinct+mechanical+properties+and+differentiation+potential.">Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential.</a> Scientific Reports. 5, 14218 (2015).</li><li>Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+heterogeneity+in+pluripotent+stem+cells:+a+stochastic+advantage.">Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage.</a> Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).</li><li>Cahan, P., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+implications+of+pluripotent+stem+cell+variability+and+heterogeneity.">Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity.</a> Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).</li><li>Chetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+tool+to+improve+pluripotent+stem+cell+differentiation.">A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation.</a> Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).</li><li>Kimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+AT7867+proliferates+PDX1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).</li><li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Immunofluorescence+on+Frozen+Sections+of+Mouse+Mammary+Gland.">Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Kajiwara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-dependent+variations+in+hepatic+differentiation+from+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li><li>Suemori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+establishment+of+human+embryonic+stem+cell+lines+and+long-term+maintenance+with+stable+karyotype+by+enzymatic+bulk+passage.">Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).</li><li>Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+cell+seeding+density+influences+pancreatic+endocrine+development+during+in+vitro+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+NKX6-1++pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li><li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice.">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li><li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).</li><li>Hohwieler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+acinar/ductal+organoids+generate+human+pancreas+upon+orthotopic+transplantation+and+allow+disease+modelling.">Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling.</a> Gut. 66 (3), 473-486 (2017).</li><li>Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endodermal+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+insulin-producing+cells+in+3D+culture.">Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture.</a> Scientific Reports. 4, 4488 (2014).</li></ol>

PDX1+ कोशिकाओं की पीढ़ी के कई कदम शामिल है; इसलिए, यह उचित समय पर कोशिकाओं का इलाज करने के लिए महत्वपूर्ण है । कदम के अलावा, निश्चित अन्तः की प्रेरण दक्षता मुख्यतः अंतिम प्रेरण दक्षता को प्रभावित करता ह?...

अग्ंयाशय मुख्य रूप से बहिःस्त्रावी और अंत: स्रावी कोशिकाओं के होते हैं, और इसकी शिथिलता या अधिभार कई रोगों का कारण बनता है, ऐसे अग्नाशशोथ, मधुमेह और अग्नाशय के कैंसर के रूप में । pancreatopathy के रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए, यह अग्नाशय कोशिकाओं के विकास की प्रक्रिया और समारोह का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है । इसके अतिरिक्त, कोशिका/ऊतक पूरकता चिकित्सा स्थापित करने के लिए सुदृढ़ गुणवत्ता वाली एक स्थिर कोशिका आपूर्ति की आवश्यकता होती है । मानव pluripotent स्टेम सेल (hpsc)-व्युत्पन्न अग्नाशय कोशिकाओं इन प्रयोजनों के लिए एक होनहार सेल स्रोत हैं, और अग्नाशय कोशिकाओं की ओर भेदभाव प्रोटोकॉल गहन अध्ययन किया गया है1,2,3, 4. अग्नाशय के β कोशिकाओं की विट्रो पीढ़ी में हाल ही में अग्रिमों वयस्क मानव में β कोशिकाओं की पीढ़ी नकल, और इन कोशिकाओं मधुमेह मॉडल चूहों2,3में आरोपण पर चिकित्सकीय प्रभावकारिता दिखाने. इसके अलावा, β कोशिकाओं के विश्लेषण से उत्पंन प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) के स्वस्थ और प्रकार 1 मधुमेह रोगी दाताओं से पता चला कोई कार्यात्मक मतभेद सहित जब तनाव के तहत5। इसके अलावा, रोग phenotypes आंशिक रूप से प्रेरित अग्नाशय के कोशिकाओं के साथ रोगी प्राप्त ipscs या hpscs रोगियों6,7के रूप में एक ही साइट में आनुवंशिक उत्परिवर्तन शरण में reproduced किया गया है.
hpscs से अग्नाशय कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए, पदश: का निर्देशन किया है कि विकास प्रक्रियाओं recapitulates का इस्तेमाल होता अग्ंयाशय प्रारंभिक भ्रूण, जो सेक्स का निर्धारण क्षेत्र Y-बॉक्स 17 (SOX17) और forkhead बॉक्स A2 (FOXA2)8व्यक्त की अन्तः परत से व्युत्पंन है । माउस के अध्ययन के आधार पर, endodermal परत आदिम पेट ट्यूब रूपों, जो हेपेटोसाइट परमाणु कारक 1 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है-बीटा (Hnf1β) और hepatocyte परमाणु फैक्टर 4-अल्फा (Hnf4α). आदिम आंत ट्यूब elongates और श्वसन तंत्र, पाचन तंत्र, और अंगों में विकसित करता है । बढ़ाव के बाद, पश् चवर्ती अग्रगट क्षेत्र कल्पित अग्नाशई क्षेत्र बन जाता है, जैसा कि प्रतिकारी कारक अग्ंयाशय/ग्रहणी होमोबॉक्स प्रोटीन 1 (PDX1)8,9,10की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित । PDX1+ आंत ट्यूब के पृष्ठीय और अधर भागों अग्नाशय कलियों, जो अग्ंयाशय प्रतिलेखन कारक 1 सबयूनिट अल्फा (PTF1A) और NK6 homeobox 1 (nkx 6.1)8,11के सह अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे है के रूप में गाढ़ा । इस अभिव्यक्ति अग्नाशय के ऑर्गेनिजेनेसिस के रूपात्मक शुरू के निशान । अग्नाशय अन्तः कोशिकाओं, जो अग्नाशई कलियों के घटक हैं, उपकला संरचनाओं12 के एक बंटी ट्यूबलर नेटवर्क फार्म और अंततः बहिःस्त्रावी और अंत: स्रावी कोशिकाओं में अंतर, इंसुलिन स्रावी β कोशिकाओं सहित और glucagon-छिपाना α-कोशिकाओं । PDX1 की अभिव्यक्ति पहले प्रकल्पशील अग्नाशय क्षेत्र है, जो तो पूरे अग्नाशय के विकास में मनाया जाता है पर पाया जाता है, और β-और δ कोशिकाओं9,13,14को स्थानीयकरण से पता चलता है । हालांकि Pdx1+ कोशिका क्षेत्र है कि Ptf1a या Nkx 6.1 व्यक्त नहीं करता है गैस्ट्रिक विवर, ग्रहणी, extraयकृत पित्त नलिका और मध्य में कुछ आंतों की कोशिकाओं में फर्क9चूहों में विकास के देर चरण के लिए, Pdx1+ कोशिकाओं मनुष्यों में प्रारंभिक विकास के स्तर पर अग्ंयाशय के progenitors माना जाता है ।
यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करने के लिए PDX1 में hPSCs अंतर+ अग्नाशय वंश की पीढ़ी के लिए कोशिकाओं । प्रोटोकॉल को वियोजित एकल कोशिकाओं15,16,17बोने के द्वारा भेदभाव शुरू करता है । सामान्यतया, अविभेदित एचपीएससीज को कालोनियों अथवा कोशिका समुच्चय के रूप में निलंबन अथवा आसंजन में रखा जाता है । नतीजतन, अधिकांश प्रोटोकॉल passaging के बाद शीघ्र ही भेदभाव शुरू करते हैं । हालांकि, कालोनियों या समुच्चय के राज्य में, कोशिकाओं स्थानिक और transcriptional विषमताओं18,19,20,21,22, जो बाधा हो सकती करने के लिए प्रवण हैं निश्चित अन्तः PDX1+ कोशिकाओं के लिए अकुशल भेदभाव के बाद की ओर पहला भेदभाव कदम । वर्तमान प्रोटोकॉल आसान हैंडलिंग में सुधार करने के लिए और कुछ hPSC लाइनों कि पहले endodermal वंश और PDX1+ कोशिकाओं23के लिए निकम्मेपन अंतर पाया गया की भिंनता दक्षता को स्थिर करने की पेशकश कर सकते हैं, 24 , 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:617px;" width="616">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">3-Keto-N-aminoethyl-N&#8242;-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine</td>
			<td style="width:100px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">K171000</td>
			<td style="width:172px;">CYC</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">SC-203303</td>
			<td style="width:172px;">TTNPB</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339652</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y]</td>
			<td style="width:100px;">Abcam</td>
			<td style="width:123px;">Ab76541</td>
			<td style="width:172px;">Anti-CDX2, &#215; 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">B-27 Supplement (50 &#215;)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">17504-044</td>
			<td style="width:172px;">Serum-free supplement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">BD FACSAria II Cell Sorter</td>
			<td style="width:100px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Biomedical freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U538</td>
			<td>For -30 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450011</td>
			<td style="width:172px;">Counting slide glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR</td>
			<td style="width:100px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">657165</td>
			<td style="width:172px;">For differentiation culture/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">AX-310</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">MX-305</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:100px;">Axon Medchem</td>
			<td style="width:123px;">Axon 1386</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CLEAN BENCH</td>
			<td style="width:100px;">SHOWA KAGAKU&#160;</td>
			<td style="width:123px;">S-1601PRV</td>
			<td style="width:172px;">Clean bench</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Corning CellBIND 6-well plate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3335</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td style="width:172px;">Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Corning Synthemax II-SC Substrate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3535</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cryostat</td>
			<td style="width:100px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">Leica CM1510 S</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm Kit</td>
			<td style="width:100px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">554714</td>
			<td style="width:172px;">Perm/Wash buffer is&#160; Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Dako pen</td>
			<td style="width:100px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S2002</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">dNTP mix (10 mM)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18427-088</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A11055</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10036</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10040</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:100px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:123px;">S30</td>
			<td style="width:172px;">Donkey serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-PBS(-) without Ca or Mg</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">14249-95</td>
			<td style="width:172px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Essential 8 Medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A1517001</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">352235</td>
			<td style="width:172px;">5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 1000 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-1000S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P20S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 200 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P200S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Keyence</td>
			<td style="width:123px;">BZ-X700</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Forma Steri-Cycle CO2 incubator</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">370A</td>
			<td style="width:172px;">Incubator</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-1&#946; Antibody (C-20)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-7411</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF1&#946;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-4&#945; Antibody (H-171)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-8987</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF4&#945;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">H3570</td>
			<td style="width:172px;">For nucleus staining, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Human Pancreas Total RNA</td>
			<td style="width:100px;">Ambion</td>
			<td style="width:123px;">AM7954</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human PDX-1/IPF1 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF2419</td>
			<td style="width:172px;">Anti-PDX1, goat IgG, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human SOX17 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF1924</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX17, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Improved MEM Zinc Option medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">10373-017</td>
			<td style="width:172px;">iMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Incubation chamber</td>
			<td style="width:100px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:123px;">10DO</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Latex Examination Gloves</td>
			<td style="width:100px;">Adachi</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MAS coated slide glass</td>
			<td style="width:100px;">Matsunami Glass</td>
			<td>83-1881</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:123px;">CKX41N-31PHP</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microtube</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">131-515CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Monoclonal Anti-&#945;-Fetoprotein</td>
			<td style="width:100px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A8452</td>
			<td style="width:172px;">Anti-AFP, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Nanodeop 8000</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Oligo dT</td>
			<td style="width:100px;">FASMAC</td>
			<td style="width:123px;">Custom made Oligo&#160;</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR of sequence is &#34;TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde, powder</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">26126-54</td>
			<td style="width:172px;">PFA, fixative, diluted in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Pharmaceutical refrigerator</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MPR-514</td>
			<td>For 4 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">PIPETMAN P&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GILSON</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">Pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human KGF/FGF-7</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">251-KG</td>
			<td style="width:172px;">KGF</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Recombinant Human Noggin</td>
			<td style="width:100px;">PeproTech</td>
			<td style="width:123px;">120-10C</td>
			<td style="width:172px;">NOGGIN</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">338-AC</td>
			<td style="width:172px;">Activin A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">ReverTra Ace (100 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:100px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:123px;">TRT-101</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rnase-Free Dnase Set (50)</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">79254</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">74104</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640 with L-Gln</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">30264-85</td>
			<td style="width:172px;">RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sealing Film for Real Time</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td style="width:123px;">NJ500</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 10 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 25 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 5 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4487</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td>
			<td style="width:100px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:123px;">3579S</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX2, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">StepOnePlus</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sucrose</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td>30406-25</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">TB Green 
			Premix Ex Taq II&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td>RR820B</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450101J1</td>
			<td style="width:172px;">Automatic cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek OCT compound 4583&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">35501-15</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450021</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Ultracold freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U33V</td>
			<td>For -80 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15575-038</td>
			<td style="width:172px;">Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Y-27632</td>
			<td style="width:100px;">Wako</td>
			<td style="width:123px;">251-00514</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures

मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC)-प्राप्त अग्नाशय कोशिकाओं पुनर्योजी दवा के लिए एक होनहार सेल स्रोत और मानव विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मंच है । Stepwise का निर्देश दिया भिंनता है कि पुनर्पूंजीकरण विकासात्मक प्रक्रियाओं के प्रमुख तरीके अग्ंयाशय/ग्रहणी homeobox प्रोटीन 1+ (PDX1+) अग्नाशय के जनक कोशिकाओं सहित अग्नाशय की कोशिकाओं को उत्पंन करने में से एक है । पारंपरिक प्रोटोकॉल छोटी कालोनियों के साथ भेदभाव शीघ्र ही पारित होने के बाद शुरू करते हैं । हालांकि, कालोनियों या समुच्चय के राज्य में, कोशिकाओं विषमताओं के लिए प्रवण हैं, जो PDX1+ कोशिकाओं के लिए भेदभाव बाधा हो सकता है । यहां, हम PDX1+ कोशिकाओं में hPSCs अंतर करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल चार चरणों के होते है और वियोजित एकल कोशिकाओं बोने के द्वारा भेदभाव शुरू करता है । SOX17 के प्रेरण+ निश्चित अन्तः कोशिकाओं दो आदिम आंत ट्यूब मार्करों, HNF1β और HNF4α की अभिव्यक्ति के बाद किया गया था, और PDX1+ कोशिकाओं में अंतिम भेदभाव । वर्तमान प्रोटोकॉल आसान हैंडलिंग प्रदान करता है और सुधार और कुछ hPSC लाइनों कि पहले endodermal वंश या PDX1+ कोशिकाओं में निकम्मेपन अंतर पाया गया की भिंनता दक्षता को स्थिर कर सकते हैं ।

हिपसीज का प्रचार करना (585a129,30) सघन हैं और एक समरूप मोनोलेयर (चित्र 1b) के रूप में है जो विभेद के लिए उपयुक्त है । अविभेदित hiPSCs (स्टेज 0) को कम सेल घनत्व (1-1.5 x 105 कोशिकाओं/सेमी2</su...

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Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करने के लिए मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) में अग्ंयाशय/ग्रहणी homeobox प्रोटीन 1+ (PDX1+) कोशिकाओं को अग्नाशय के वंश के उत्पादन के लिए गैर कॉलोनी प्रकार monolayer वृद्धि के आधार पर वियोजित एकल कोशिकाएँ. यह विधि समरूप hPSC-व्युत्पन्न कोशिकाओं, आनुवंशिक हेरफेर और स्क्रीनिंग के उत्पादन के लिए उपयुक्त है ।

अग्ंयाशय के कुशल पीढ़ी/ग्रहणी Homeobox प्रोटीन 1+ पश् चवर्ती अग्रगुट/अग्ंयाशय आसंजन संस्कृतियों में hPSCs से Progenitors

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि उत्तेजना से पहले, कोशिकाओं को समान रूप से फैलाया जाता है और फिर मिलकर कोशिका आसंजन में समान रूप से उत्तेजित किया जाता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन अज़ुमा किमुरा, हमारी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, आरपीएमआई 1640 के छह मिलीलीटर को बर्फ पर चार डिग्री सेल्सियस तक ठंडा ट्यूब में स्थानांतरित करें।ठंडा एक मिलीलीटर पिपेट युक्तियों का उपयोग करके, बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के दो मिलीग्राम जोड़ें। इसे 0.33 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता के साथ एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बनाने के लिए कोमल पिपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। इसके बाद, पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के दो मिलीलीटर को छह-अच्छी सेल संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।थाली को 60 से 90 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, प्लेट को कमरे के तापमान पर तीन घंटे तक रखें, जब तक कि उपयोग के लिए तैयार न हो जाए। सबसे पहले, इस्तेमाल किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें और छह-अच्छी प्लेट में सुसंस्कृत एचपीसीएसएस को धोने के लिए प्रत्येक कुएं में 0.5 मिलीमोलर ईडीटीए के दो मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।फिर, कुओं से ईडीटीए को एस्पिरेट करें और प्रत्येक कुएं में ताजा 0.5 मिलीमोलर ईडीटीए के दो मिलीलीटर जोड़ें। पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट। इसके बाद, प्रत्येक कुएं से ईडीटीए को एस्पिरेट करें।कमरे के तापमान पर एचपीएससी रखरखाव माध्यम का एक मिलीलीटर जोड़ें, प्रत्येक कुएं में 10 माइक्रोमोलर Y27632 के साथ पूरक। पिपेट धीरे-धीरे लेकिन जल्दी से प्लेट पर संलग्न कोशिकाओं को उड़ाने के लिए और किसी भी झुरमुट कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में अलग करने के लिए। 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में सेल सस्पेंशन को स्थानांतरित करें जिसमें चार मिलीलीटर एचपीएससी रखरखाव माध्यम 10 माइक्रोमॉलर Y27632 प्रति कुएं के साथ पूरक है और पाइपिंग द्वारा मिलाएं।इसके बाद, ट्यूब में ट्राइपैन ब्लू के 15 माइक्रोलीटर के साथ सेल सस्पेंशन के 15 माइक्रोलीटर मिलाएं। डुप्लिकेट में सेल काउंटिंग स्लाइड्स में पतला सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोलीटर ट्रांसफर करने के लिए 10 माइक्रोलिटर पिपेट का इस्तेमाल करें । एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करना, सेल संख्या की गणना करें और सेल निलंबन में सेल घनत्व की गणना करें।प्रत्येक अच्छी तरह से उपयोग किए जाने के लिए एक से डेढ़ लाख कोशिकाओं के घनत्व पर 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन आवंटित करें। 200 बार जी पर और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। इसके बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और चरण 1A माध्यम के एक मिलीलीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।धीरे से सेल निलंबन पिपेट और फिर अच्छी तरह से प्रति चरण 1A माध्यम के एक और एक मिलीलीटर जोड़ें । 1000 माइक्रोलिटर पिपेट का उपयोग करके, पहले से तैयार सेल कल्चर प्लेट के कुओं से पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को एस्पिरेट करें। तुरंत ट्यूब में निलंबन धीरे-धीरे पिपेट करें और छह-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में दो मिलीलीटर स्थानांतरित करें।इसे प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर करें और प्लेट को 10 से 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक साफ बेंच पर रखें। इसके बाद, ध्यान से 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 24 घंटे के लिए एक आर्द्र वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के लिए थाली हस्तांतरण। सबसे पहले, धीरे से थाली हिला और एक पिपेट का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया माध्यम आकांक्षी ।फिर, प्रत्येक कुएं में डीपीबीएस के दो मिलीलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे प्लेट को फिर से हिलाएं और उपयोग किए गए डीपीबीएस को एस्पिर करें। प्रत्येक कुएं में स्टेज 1बी माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें, पूर्व-गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक।ध्यान से 5% कार्बन डाइऑक्साइड और ४८ घंटे के लिए संस्कृति के लिए एक आर्द्र वातावरण के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के लिए थाली हस्तांतरण । इसके बाद धीरे-धीरे प्लेट को हिलाएं और इस्तेमाल किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें। प्रत्येक कुएं में डीपीबीएस के दो मिलीलीटर जोड़ें।इस आकांक्षा और डीपीबीएस के अलावा एक अतिरिक्त समय दोहराएं। धीरे-धीरे प्लेट को हिलाएं और उपयोग किए गए डीपीबीएस को एस्पिरेट करें। प्रत्येक कुएं में स्टेज 1बी माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें, पूर्व-गर्म 37 डिग्री सेल्सियस तक।ध्यान से एक इनक्यूबेटर के लिए थाली हस्तांतरण, 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 24 घंटे के लिए संस्कृति के लिए एक आर्द्र वातावरण के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर । सबसे पहले, धीरे से थाली हिला और इस्तेमाल माध्यम आकांक्षी । छह अच्छी थाली के प्रत्येक कुएं में डीपीबीएस के दो मिलीलीटर जोड़ें ।फिर, धीरे-धीरे प्लेट को हिलाएं और उपयोग किए गए डीपीबीएस को एस्पिरेट करें। प्रत्येक कुएं में स्टेज दो माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें, पूर्व-गर्म ३७ डिग्री सेल्सियस तक । ध्यान से 5% कार्बन डाइऑक्साइड और चार दिनों के लिए संस्कृति के लिए एक आर्द्र वातावरण के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के लिए थाली हस्तांतरण ।धीरे-धीरे प्लेट को हिलाएं और उपयोग किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें। प्रत्येक कुएं में डीपीबीएस के दो मिलीलीटर जोड़ें। एस्पिरेशन की इस प्रक्रिया को दोहराएं और एक बार फिर डीपीपीएस को जोड़ें।इसके बाद, धीरे-धीरे प्लेट को हिलाएं और उपयोग किए गए डीपीबीएस को एस्पिरेट करें। चरण तीन माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें, पूर्व गर्म ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से । ध्यान से 5% कार्बन डाइऑक्साइड और तीन दिनों के लिए संस्कृति के लिए एक आर्द्र वातावरण के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के लिए थाली हस्तांतरण ।इस अध्ययन में, प्रचार hIPSEs गाढ़ा कर रहे हैं और एक समरूप मोनोलेयर है कि भेदभाव के लिए उपयुक्त है फार्म। अविभेदित एचआईपीएसई को कम सेल घनत्व पर एकल कोशिकाओं के रूप में अलग और पुनः प्राप्त किया जाता है। एक घंटे के भीतर, कोशिकाओं को प्लेट से जुड़ा हुआ है और फलाव दिखाने के लिए शुरू करते हैं।एक दिन, कोशिकाओं को बढ़ाया जाता है और सतह क्षेत्र के 80 से 90% को कवर करने के लिए अच्छी तरह से वितरित किया जाता है। तीन और चार दिन, कोशिकाएं एक समरूप मोनोलेयर शीट बनाती हैं जिसे कोबलस्टोन उपस्थिति के रूप में वर्णित किया जा सकता है। इस बिंदु पर, अधिकांश कोशिकाएं SOX2 को व्यक्त करना बंद कर देती हैं, जो अविभेदित कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है, और इसके बजाय 90% से अधिक अधिकांश SOX17-सकारात्मक कोशिकाओं पर एक निश्चित एंडोडर्म मार्कर, SOX17 व्यक्त करती है।फिर कोशिकाएं आदिम गोपटूप मार्कर, एचएनएफ 1-बीटा और एचएनएफ 4-अल्फा को व्यक्त करना शुरू करती हैं, और अंततः 90% से अधिक पीडीएक्स1-पॉजिटिव सेल प्रेरण एक और एचआईपीई लाइन, 1231A3 और एक एचईएस लाइन, KHES-3 में पीछे की ओर अग्नाशय के जनक मार्कर, पीडीएक्स1 को व्यक्त करती हैं। स्टेज मार्कर की एमआरएना अभिव्यक्ति के क्यूआरटीपीसीआर परिणाम इम्यूनोस्टेपिंग के अनुरूप हैं और पीडीएक्स1 की एमआरएना अभिव्यक्ति चरण तीन पर स्पष्ट है और बाद में काफी बढ़ जाती है। चूंकि अविभेदित ईएसआईपीएस कोशिकाओं को उपनिवेशों के रूप में उगाया जाता है, इसलिए व्यक्तिगत कोशिकाएं स्थानीय रूप से एक अलग राज्य में होती हैं।यह प्रोटोकॉल निर्वाचित भेदभाव के लिए समान रूप से कोशिकाओं को उत्तेजित करने का एक तरीका प्रदान करता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

स्टेम सेल से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के कुशल व्युत्पत्ति

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

छत संस्कृतियों में परिपक्व एडिपोसाईट की Dedifferentiation के माध्यम से मानव वसा स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

निष्प्राण मानव डर्मिस का प्रयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित Organotypic त्वचा संस्कृतियों की पीढ़ी

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent के कुशल भेदभाव स्टेम कोशिकाओं को NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; अग्नाशय प्रोजेनिटर्स

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

अलगाव, संस्कृति, और चूहों से अस्थि मज्जा Stromal कोशिकाओं और अस्थिशोषक Progenitors के भेदभाव

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

पाड़-मुक्त, तीन आयामी इंसुलिन व्यक्त Pancreatoids से माउस अग्नाशय Progenitors इन विट्रो में की पीढ़ी

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

हृदय Progenitors और वेंट्रिकुलर की तरह पहले दिल क्षेत्र की पीढ़ी-मानव Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से Cardiomyocytes की तरह

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से तंत्रिका जनक और न्यूरॉन्स का भेदभाव और लक्षण वर्णन

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...