Name: efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures at JoVE.com

이 작품은 일본 사회에서 대는 승진의 과학 (JSP) Scientific Research (C) (JSP KAKENHI 그랜트 Number15K09385와 18 K 08510)를 통해 고작, 및 특정에 대 한 자금 JSP 연구 휄 로우 (JSP KAKENHI 부여 번호에 의해 부분적으로 지원 17J07622)를 ko로 "ips 세포 연구, 재생 의료의 실현을 위한 연구 센터 네트워크 코어 센터" ak로, 그리고 의료 연구 및 개발 (아메드)의 연구를 통해 일본 기관에 부여 저자는 원고를 읽고 박사 피터 Karagiannis 감사 합니다.

HPSCs를 사용 하 여 실험 의학의 학과 대학원의 대학, 교토대학의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 자료의 준비
참고: 메 마른 환경에서 세포 배양에 대 한 모든 미디어와 시 약을 준비 합니다. 사용 하기 전에 실내 온도 (RT) 기본 문화 미디어 워밍업. 매체는 차별화는 6 h는 시 약의 실시간 정보에 내에서 사용 되는 재?...

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PDX1 세대+ 세포의 여러 단계; 구성 따라서, 그것은 적절 한 시점에 세포를 치료 하는 중요 한입니다. 단계, 중 최종 endoderm의 유도 효율 크게 최종 유도 효율에 영향을, 가능성이 다른 오염 혈통 (즉, mesoderm, ectoderm)는 세포 증식 및 분 비 수 있습니다에서 간섭에 의해 그 요인 특정 차별화를 중단. 경우 SOX17의 비율+ 세포는 하루에 4 (단계 1B), 수 PDX1 효율적인 유도 80% 보다 낮은+...

췌 장 외 분 비 및 내 분 비 세포, 주로 구성 하 고 그것의 역 기능 또는 오버 로드 하면 여러 가지 질병, 췌 장 염, 당뇨병, 췌장암 등. Pancreatopathy의 pathogeny, 명료 하 발달 과정 및 췌 장 세포의 기능을 분석할 필요가 있다. 또한, 강력한 품질 안정적인 셀 공급 세포/조직 보충 치료를 설정할 필요 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-파생 된 췌 장 세포는 이러한 목적에 대 한 유망한 셀 소스 그리고 췌 장 세포로 분화 프로토콜 집중적으로 공부1,2,3,되었습니다 4. 췌 장 β 세포의 생체 외에서 생성의 최근 발전 인간, 성인과 당뇨병 모델 마우스2,3에 이식 시 이러한 셀 표시 치료 효능에 β 세포의 생성을 모방. 또한, β 세포 건강의 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 및 타입-1 당뇨병 환자 기증자에서 생성 된 분석 스트레스5때 포함 하는 기능 차이가 나타났다. 또한, 질병 고기 환자 파생 Ipsc 또는 hPSCs 유전자 변이 환자6,7와 같은 사이트에 은닉 유도 된 췌 장 세포에 부분적으로 재현 되어 있다.
HPSCs에서 췌 장 세포를 생성, stepwise 감독된 차별화 개발 프로세스를이 사용 됩니다. 췌 지역 Y-상자 17 (SOX17)를 결정 하는 섹스를 표현 하 고 초기 배아의 endoderm 계층에서 파생 되 고 forkhead 상자 A2 (FOXA2)8. 마우스 연구를 바탕으로, endodermal 레이어 hepatocyte 핵 요인 1-베타 (Hnf1β)와 hepatocyte 핵 요인 4 알파 (Hnf4α)의 식에 의해 표시 된다 원시 창 자 관을 형성 한다. 기본 창 자 튜브 elongates 및 호흡 장치, 소화 관, 및 기관으로 개발 합니다. 신장, 후 후부 foregut 지역 된다 추정 췌 장 지역 1 (PDX1)8,,910transcriptional 인자 췌 장/십이지 homeobox 단백질의 식으로 표시. 등 쪽과 복 부 부분의 PDX1+ 직감 튜브 1 (NKX6.1)8,11췌 녹음 방송 요인 1 소 단위 알파 (PTF1A)와 NK6 homeobox의 공동 식에 의해 표시 된 양식 췌 장 새싹을 진하게. 이 식은 췌 장 organogenesis의 형태학 시작을 표시합니다. 췌 장 새싹의 구성 요소 췌 endoderm 세포 상피 구조12 의 분기 관 네트워크를 형성 하 고 결국 외 분 비 및 내 분 비 세포, 인슐린 분 비 β-세포 등으로 분화 하 고 글 루카 곤 분 비 α-셀입니다. 표현의 PDX1 전체 췌 장 개발을 통해 관찰 하 고 지역화 β와 δ 세포9,,1314를 보여줍니다 추정 췌 장 영역에서 먼저 검색 됩니다. 비록 있는 Pdx1+ Ptf1a 또는 Nkx6.1을 표현 하지 않는 셀 영역 위 동굴, 십이지 장, extrahepatic 담 즙 덕트 및 마우스9, PDX1 개발의 단계를 중간에 몇몇 장 세포로 분화+ 셀 인간의 초기 발달 단계에서 췌의 창시자 이라고 여겨진다.
여기, 선물이 PDX1에 hPSCs를 차별화 하는 상세한 프로토콜+ 세포 췌 장의 계보의 세대에 대 한. 시드 여 프로토콜 초기화 차별화 단일 셀15,,1617해리 했다. 일반적으로, undifferentiated hPSCs 식민지 또는 셀 집계 정지 또는 접착으로 유지 됩니다. 그 결과, 대부분 프로토콜 뿌리고 직후 차별화를 시작합니다. 그러나, 식민지 또는 집계의 상태에서 세포는 공간과 transcriptional heterogeneities18,19,20,,2122, 방해 수 있는 경향이 있는 첫 번째 차별화 단계로 최종 endoderm PDX1 비효율적인 차별화 뒤+ 세포. 현재 프로토콜 개선 및 차별화 효율성 안정화 쉽게 처리를 제공할 수 있습니다 이전 발견 된 일부 hPSC 라인의 endodermal 계보 및 PDX1 비효율적으로 차별화 하는+ 세포23, 24 , 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:617px;" width="616">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">3-Keto-N-aminoethyl-N&#8242;-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine</td>
			<td style="width:100px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">K171000</td>
			<td style="width:172px;">CYC</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">SC-203303</td>
			<td style="width:172px;">TTNPB</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339652</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y]</td>
			<td style="width:100px;">Abcam</td>
			<td style="width:123px;">Ab76541</td>
			<td style="width:172px;">Anti-CDX2, &#215; 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">B-27 Supplement (50 &#215;)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">17504-044</td>
			<td style="width:172px;">Serum-free supplement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">BD FACSAria II Cell Sorter</td>
			<td style="width:100px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Biomedical freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U538</td>
			<td>For -30 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450011</td>
			<td style="width:172px;">Counting slide glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR</td>
			<td style="width:100px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">657165</td>
			<td style="width:172px;">For differentiation culture/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">AX-310</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">MX-305</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:100px;">Axon Medchem</td>
			<td style="width:123px;">Axon 1386</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CLEAN BENCH</td>
			<td style="width:100px;">SHOWA KAGAKU&#160;</td>
			<td style="width:123px;">S-1601PRV</td>
			<td style="width:172px;">Clean bench</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Corning CellBIND 6-well plate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3335</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td style="width:172px;">Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Corning Synthemax II-SC Substrate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3535</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cryostat</td>
			<td style="width:100px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">Leica CM1510 S</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm Kit</td>
			<td style="width:100px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">554714</td>
			<td style="width:172px;">Perm/Wash buffer is&#160; Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Dako pen</td>
			<td style="width:100px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S2002</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">dNTP mix (10 mM)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18427-088</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A11055</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10036</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10040</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:100px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:123px;">S30</td>
			<td style="width:172px;">Donkey serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-PBS(-) without Ca or Mg</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">14249-95</td>
			<td style="width:172px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Essential 8 Medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A1517001</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">352235</td>
			<td style="width:172px;">5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 1000 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-1000S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P20S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 200 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P200S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Keyence</td>
			<td style="width:123px;">BZ-X700</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Forma Steri-Cycle CO2 incubator</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">370A</td>
			<td style="width:172px;">Incubator</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-1&#946; Antibody (C-20)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-7411</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF1&#946;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-4&#945; Antibody (H-171)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-8987</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF4&#945;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">H3570</td>
			<td style="width:172px;">For nucleus staining, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Human Pancreas Total RNA</td>
			<td style="width:100px;">Ambion</td>
			<td style="width:123px;">AM7954</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human PDX-1/IPF1 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF2419</td>
			<td style="width:172px;">Anti-PDX1, goat IgG, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human SOX17 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF1924</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX17, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Improved MEM Zinc Option medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">10373-017</td>
			<td style="width:172px;">iMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Incubation chamber</td>
			<td style="width:100px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:123px;">10DO</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Latex Examination Gloves</td>
			<td style="width:100px;">Adachi</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MAS coated slide glass</td>
			<td style="width:100px;">Matsunami Glass</td>
			<td>83-1881</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:123px;">CKX41N-31PHP</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microtube</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">131-515CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Monoclonal Anti-&#945;-Fetoprotein</td>
			<td style="width:100px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A8452</td>
			<td style="width:172px;">Anti-AFP, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Nanodeop 8000</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Oligo dT</td>
			<td style="width:100px;">FASMAC</td>
			<td style="width:123px;">Custom made Oligo&#160;</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR of sequence is &#34;TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde, powder</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">26126-54</td>
			<td style="width:172px;">PFA, fixative, diluted in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Pharmaceutical refrigerator</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MPR-514</td>
			<td>For 4 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">PIPETMAN P&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GILSON</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">Pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human KGF/FGF-7</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">251-KG</td>
			<td style="width:172px;">KGF</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Recombinant Human Noggin</td>
			<td style="width:100px;">PeproTech</td>
			<td style="width:123px;">120-10C</td>
			<td style="width:172px;">NOGGIN</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">338-AC</td>
			<td style="width:172px;">Activin A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">ReverTra Ace (100 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:100px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:123px;">TRT-101</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rnase-Free Dnase Set (50)</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">79254</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">74104</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640 with L-Gln</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">30264-85</td>
			<td style="width:172px;">RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sealing Film for Real Time</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td style="width:123px;">NJ500</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 10 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 25 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 5 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4487</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td>
			<td style="width:100px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:123px;">3579S</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX2, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">StepOnePlus</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sucrose</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td>30406-25</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">TB Green 
			Premix Ex Taq II&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td>RR820B</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450101J1</td>
			<td style="width:172px;">Automatic cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek OCT compound 4583&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">35501-15</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450021</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Ultracold freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U33V</td>
			<td>For -80 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15575-038</td>
			<td style="width:172px;">Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Y-27632</td>
			<td style="width:100px;">Wako</td>
			<td style="width:123px;">251-00514</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures

인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-파생 된 췌 장 세포는 재생 의학 및 인간 발달 과정을 공부 하는 플랫폼에 대 한 유망한 셀 소스. 개발 프로세스를이 분화 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 를 포함 한 췌 장 세포를 생성 하는 주요 방법 중 하나입니다 감독 stepwise (PDX1+) 췌 장의 조상 세포. 기존의 프로토콜 통과 직후 작은 식민지와 차별화를 시작합니다. 그러나, 식민지 또는 집계의 상태에서 세포 하는 경향이 수 PDX1 분화를 방해 수 있습니다 heterogeneities+ 세포. 여기, 선물이 PDX1에 hPSCs를 차별화 하는 상세한 프로토콜+ 세포. 프로토콜의 4 단계 구성 하 고 시드 해리 단일 세포로 분화를 시작. SOX17의 유도+ 최종 endoderm 셀 두 개의 기본 창 자 튜브 마커, HNF1β 및 HNF4α, 및 최종 분화 식 PDX1에 선행 되었다+ 세포. 현재 프로토콜 쉬운 처리를 제공 합니다 개선 및 안정화 endodermal 계보 또는 PDX1 비효율적으로 차별화 하는 이전 발견 된 일부 hPSC 라인의 분화 효율 수 있습니다+ 세포.

전파 hiPSCs (585A129,30) 집 광 하 고 차별화에 적합 (그림 1B) 동종 단층을 형성 한다. Undifferentiated hiPSCs (단계 0) 해리 그리고 다시 낮은 세포 밀도 (1-1.5 x 105 셀/cm2)에서 단일 셀으로 시드. 1 시간 이내 셀 접시에 연결 하 고 돌출 표시를 시작 합니다. 하루에 1, 셀 확산 하 고 잘 배포 표면적의 80-90%를 커버 하는. 단계 1B, 동...

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Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

여기, 우리 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 로 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 차별화 하는 상세한 프로토콜을 제시 (PDX1+) 췌 장 계보의 세대에 대 한 셀의 비 식민지 유형 단층 성장에 따라 단일 세포를 해리 했다. 이 메서드는 생산 하는 동종 hPSC 파생 된 세포, 유전자 조작 및 심사에 적합 합니다.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

이 기술의 주요 장점은 자극 전에 세포가 균등하게 분산된 다음 탠덤 세포 접착에서 균등하게 자극된다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실대학원생 인 기무라 아즈마(Azuma Kimura)가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 RPMI 1640의 6 밀리리터를 얼음에서 섭씨 4도까지 냉각된 튜브로 옮긴다.냉각된 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 지하 멤브레인 매트릭스 2밀리그램을 추가합니다. 밀리리터당 0.33 밀리그램의 농도를 가진 지하 막 매트릭스로 만들기 위해 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞으세요. 다음으로, 파이펫을 사용하여 희석된 지하 멤브레인 매트릭스의 2밀리리터를 6웰 세포 배양 판의 각 웰로 옮킨다.60~90분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 이 후, 사용할 준비가 될 때까지 최대 3 시간 동안 실온에서 접시를 유지합니다. 첫째, 사용된 매체를 흡습하고 파이펫을 사용하여 각 웰에 0.5 밀리미터 EDTA의 2밀리리터를 추가하여 6웰 플레이트에서 배양된 hPCS를 세척한다.그런 다음 우물에서 EDTA를 흡입하고 각각 의 2 밀리리터를 각각 의 0.5 밀리롤라 EDTA에 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 이 후, 각 우물에서 EDTA를 흡인.실온에서 hPSC 유지 보수 매체 1밀리리터를 추가하여 각 웰에 10 개의 마이크로 몰러 Y27632로 보충하십시오. 파이펫은 부드럽고 빠르게 플레이트에 부착 된 세포를 날려 단일 세포로 응집 된 세포를 해리합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 셀 서스펜션을 전달하여 4밀리리터의 hPSC 유지 보수 매체를 함유하고 있으며, 10마이크로몰러 Y27632로 보충하고 파이펫팅으로 혼합한다.다음으로, 튜브에 15 마이크로리터의 셀 서스펜션을 15 마이크로리터와 혼합합니다. 10 마이크로리터 파이펫을 사용하여 희석된 셀 서스펜션의 10 마이크로리터를 셀 카운팅 슬라이드로 중복으로 전송합니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 수를 계산하고 셀 서스펜션의 세포 밀도를 계산합니다.셀 현탁액을 50 밀리리터 튜브에 할당하여 각 웰에 대해 1~100만 개의 세포밀도로 배분한다. 원심 분리는 200 배 G와 실온에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 그 후, 파이펫을 사용하여 수퍼내를 흡인하고 1A 단계 배지의 1밀리리터를 사용하여 세포를 다시 일시 중단한다.셀 서스펜션을 부드럽게 피펫한 다음 1A 단계 중간크기의 1밀리리터를 더 잘 넣습니다. 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여, 이전에 준비된 세포 배양판의 우물에서 희석된 지하 막 매트릭스를 흡인한다. 즉시 튜브의 서스펜션을 부드럽게 피펫하고 두 밀리리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 옮기습니다.알루미늄 호일로 접시를 덮고 빛으로부터 보호하고 10~15분 동안 실온에서 깨끗한 벤치에 접시를 놓습니다. 그 후, 플레이트를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 가습된 대기로 24시간 동안 조심스럽게 배양식에 옮기는 다. 먼저 플레이트를 부드럽게 흔들고 파이펫을 사용하여 사용된 매체를 흡인시합니다.그런 다음 각 웰에 DPBS 2 밀리리터를 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 사용 된 DPBS를 흡인합니다. 37°C까지 미리 데워진 스테이지 1B 배지 4밀리리터를 각 웰에 추가합니다.플레이트를 섭씨 37도에서 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 이산화탄소 5%와 가습된 분위기를 48시간 동안 배양시합니다. 그 후, 접시를 부드럽게 흔들고 사용된 매체를 흡인시합니다. 각 웰에 DPBS의 2 밀리리터를 추가합니다.이 포부를 반복하고 DPBS를 한 번 더 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들고 사용된 DPBS를 흡인시합니다. 37°C까지 미리 데워진 스테이지 1B 배지 4밀리리터를 각 웰에 추가합니다.플레이트를 37도의 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고, 이산화탄소는 5%, 가습된 대기를 24시간 동안 배양합니다. 첫째, 접시를 부드럽게 흔들고 사용된 매체를 흡인시합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 DPBS 2밀리리터를 추가합니다.그런 다음 접시를 부드럽게 흔들고 사용된 DPBS를 흡인시합니다. 37°C까지 미리 따뜻하게 된 스테이지 2 배지의 밀리리터 4밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 가습된 대기로 4일 동안 배양하도록 조심스럽게 옮기습니다.접시를 부드럽게 흔들고 사용된 매체를 흡인시합니다. 각 웰에 DPBS의 2 밀리리터를 추가합니다. 민국당을 한 번 더 평가하고 추가하는 과정을 반복한다.그 후, 부드럽게 접시를 흔들고 사용 된 DPBS를 흡인. 3단계 3밀리리터를 37°C로 미리 데워서 각 웰에 넣습니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 이산화탄소 5%와 가습된 대기를 3일 동안 배양합니다.이 연구에서는 hIPSEs를 전파하는 것이 응축되고 분화에 적합한 균질 한 단층을 형성합니다. 미분화 hIPSEs는 낮은 세포 밀도에서 단일 세포로 해리되고 재시드됩니다. 1 시간 이내에 세포가 접시에 부착되어 돌출을 보이기 시작합니다.첫날, 세포는 증식되고 표면적의 80~90%를 커버하기 위하여 잘 분포됩니다. 3일과 4일에, 세포는 조약돌 모양으로 설명할 수 있는 균질한 단층 시트를 형성한다. 이 시점에서, 대부분의 세포는 미분화 된 세포에 대한 마커인 SOX2를 발현하는 것을 중단하고, 대신 90% 이상에서 SOX17-양성 세포가 FOXA2를 발현하는 최종 엔도름 마커인 SOX17을 발현한다.그런 다음 세포는 원시 고프투페 마커, HNF1 베타 및 HNF4-알파를 발현하기 시작하고, 결국 90% 이상에서 췌장 선조 마커PDX1을 발현하고, PDX1양성 세포 유도는 다른 hIPSE 라인, 1231A3, HES 라인, 1231A3 및 HES 라인에서 재현할 수 있다. 단계 마커의 MRNA 발현의 QRTPCR 결과는 면역스테인링과 일치하며 PDX1의 MRNA 발현은 3단계에서 분명하고 그 이후에 실질적으로 증가한다. 미분화 된 ESIPS 세포는 식민지로 재배되기 때문에 개별 세포는 다른 상태로 국각적입니다.이 프로토콜은 선출된 분화를 위해 세포를 균등하게 자극하는 방법을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

연구

발생학

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...