Name: efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSP) a través de Scientific Research (C) (JSP KAKENHI Grant Number15K09385 y 18 K 08510) T.T. y subvenciones para investigadores de JSP (JSP KAKENHI número 17J07622) A.K., y la Agencia de Japón para la investigación médica y desarrollo (AMED) a través de su investigación conceder "Centro base para iPS red de centro de investigación para la realización de la medicina regenerativa, investigación con células" a K.O. Los autores agradecen a Dr. Peter Karagiannis por leer el manuscrito.

Experimentos con hPSCs fueron aprobados por el Comité de ética del Departamento de medicina y postgrado Facultad de medicina, Universidad de Kyoto.
1. preparación de materiales
Nota: Preparar todos los medios y reactivos para cultivo celular en un ambiente estéril. Calentamiento de base medios de cultivo a temperatura ambiente (RT) antes de su uso. Medio para la diferenciación se utiliza dentro de 6 h a RT. información de los re...

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La generación de PDX1+ células se compone de varios pasos; por lo tanto, es fundamental para el tratamiento de las células en el momento adecuado. Entre las medidas, la eficacia de la inducción del endodermo definitivo afecta en gran medida la eficacia de la inducción final, posiblemente por interferencia de otras células contaminantes linaje (es decir, mesodermo y ectodermo), que pueden proliferar o secretar factores interrumpir la diferenciación específica. Si la proporción de SOX17+ las ...

El páncreas principalmente consiste en las células exocrinas y endocrinas, y su disfunción o sobrecarga causa varias enfermedades, como la pancreatitis, diabetes y cáncer de páncreas. Para aclarar la patogenia de la pancreatopathy, es necesario analizar el proceso de desarrollo y la función de las células pancreáticas. Además, una fuente estable de la célula con sólida calidad es necesaria para establecer la terapia de suplementación de tejido de la célula. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para estos fines, y el protocolo de diferenciación hacia células pancreáticas ha sido intensamente estudiado1,2,3, 4. Los recientes avances en la generación in vitro de las células β pancreáticas mímico la generación de las células β en adultos humanos y estas células Mostrar eficacia terapéutica sobre implante en modelo diabético ratones2,3. Además, el análisis de las células β generados a partir de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) saludable los donantes paciente de diabetes tipo 1 no reveló ninguna diferencia funcional incluyendo cuando está bajo estrés5. Por otra parte, fenotipos de la enfermedad han sido parcialmente reproducidos en células pancreáticas inducidas con iPSCs derivados del paciente o hPSCs que las mutaciones genéticas en el mismo sitio que los pacientes6,7.
Para generar células pancreáticas de hPSCs, se utiliza la diferenciación dirigida paso a paso que recapitula los procesos de desarrollo. El páncreas se deriva de la capa del endodermo del embrión temprano, que expresa el sexo determina la región Y-caja 17 (SOX17) y forkhead cuadro A2 (FOXA2)8. Basado en los estudios con ratones, la capa endodermal forma el tubo intestino primitivo, que se caracteriza por la expresión de hepatocitos factor nuclear 1-beta (Hnf1β) y el factor nuclear de hepatocito 4-alfa (Hnf4α). El tubo intestino primitivo se alarga y se convierte en el aparato respiratorio, tracto digestivo y órganos. Después de la elongación, el área posterior del foregut se convierte la presunta región pancreática, y marcada por la expresión de la proteína del factor transcripcional páncreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. Las partes dorsales y ventrales de la PDX1+ tubo intestinal espesar a brotes pancreáticos forma, que se caracterizan por la coexpresión de páncreas transcripción factor 1 subunidad alfa (PTF1A) y NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Esta expresión marca el comienzo morfológico de la organogénesis pancreática. Las células del páncreas endodermo, que son componentes de las yemas pancreáticas, forman una red tubular ramificada de estructuras epiteliales12 y finalmente se diferencian en células exocrinas y endocrinas, incluyendo β-células secretoras de insulina y α-células secretoras de glucagón. Expresión de PDX1 se detecta primero en la región pancreática presuntiva, que luego se observa a lo largo de todo el desarrollo pancreático y muestra localización de las células β y δ9,13,14. Aunque el Pdx1+ área de células que no expresan Ptf1a o Nkx6.1 distingue en el antro gástrico, duodeno, vía biliar extrahepática y algunas células intestinales en el centro a la última etapa de desarrollo en ratones9, PDX1+ las células son consideradas los progenitores del páncreas en la primera etapa del desarrollo en seres humanos.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ de las células para la generación de linajes pancreáticos. El protocolo inicia la diferenciación por la siembra disocia las células15,16,17. En general, hPSCs indiferenciadas se mantienen como colonias o agregados de células en suspensión o en la adhesión. Como resultado, la mayoría de protocolos inician la diferenciación poco después pases. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades espaciales y transcripcional18,19,20,21,22, que podrían dificultar la primer paso de diferenciación hacia endodermo definitivo seguido por ineficiente diferenciación PDX1+ las células. El presente Protocolo puede ofrecer un manejo fácil para mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados para distinguir ineficazmente a linajes endodérmicos y PDX1+ células23, 24 , 25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:617px;" width="616">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">3-Keto-N-aminoethyl-N&#8242;-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine</td>
			<td style="width:100px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">K171000</td>
			<td style="width:172px;">CYC</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">SC-203303</td>
			<td style="width:172px;">TTNPB</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">339652</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y]</td>
			<td style="width:100px;">Abcam</td>
			<td style="width:123px;">Ab76541</td>
			<td style="width:172px;">Anti-CDX2, &#215; 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">B-27 Supplement (50 &#215;)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">17504-044</td>
			<td style="width:172px;">Serum-free supplement</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">BD FACSAria II Cell Sorter</td>
			<td style="width:100px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Biomedical freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U538</td>
			<td>For -30 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450011</td>
			<td style="width:172px;">Counting slide glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR</td>
			<td style="width:100px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:123px;">657165</td>
			<td style="width:172px;">For differentiation culture/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">AX-310</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:100px;">TOMY</td>
			<td style="width:123px;">MX-305</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:100px;">Axon Medchem</td>
			<td style="width:123px;">Axon 1386</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CLEAN BENCH</td>
			<td style="width:100px;">SHOWA KAGAKU&#160;</td>
			<td style="width:123px;">S-1601PRV</td>
			<td style="width:172px;">Clean bench</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Corning CellBIND 6-well plate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3335</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">354230</td>
			<td style="width:172px;">Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Corning Synthemax II-SC Substrate</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">3535</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Cryostat</td>
			<td style="width:100px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">Leica CM1510 S</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm Kit</td>
			<td style="width:100px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">554714</td>
			<td style="width:172px;">Perm/Wash buffer is&#160; Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Dako pen</td>
			<td style="width:100px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S2002</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">dNTP mix (10 mM)</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18427-088</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A11055</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10036</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A10040</td>
			<td style="width:172px;">Secondary antibody, &#215; 1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:100px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:123px;">S30</td>
			<td style="width:172px;">Donkey serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">D-PBS(-) without Ca or Mg</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">14249-95</td>
			<td style="width:172px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Essential 8 Medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A1517001</td>
			<td style="width:172px;">For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:100px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">352235</td>
			<td style="width:172px;">5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 1000 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-1000S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P20S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Filter Tip, 200 &#181;L</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">124-P200S</td>
			<td style="width:172px;">Use together with pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Keyence</td>
			<td style="width:123px;">BZ-X700</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Forma Steri-Cycle CO2 incubator</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">370A</td>
			<td style="width:172px;">Incubator</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-1&#946; Antibody (C-20)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-7411</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF1&#946;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">HNF-4&#945; Antibody (H-171)</td>
			<td style="width:100px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:123px;">sc-8987</td>
			<td style="width:172px;">Anti-HNF4&#945;, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">H3570</td>
			<td style="width:172px;">For nucleus staining, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Human Pancreas Total RNA</td>
			<td style="width:100px;">Ambion</td>
			<td style="width:123px;">AM7954</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human PDX-1/IPF1 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF2419</td>
			<td style="width:172px;">Anti-PDX1, goat IgG, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human SOX17 Antibody</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">AF1924</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX17, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Improved MEM Zinc Option medium</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">10373-017</td>
			<td style="width:172px;">iMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Incubation chamber</td>
			<td style="width:100px;">Cosmo Bio</td>
			<td style="width:123px;">10DO</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Latex Examination Gloves</td>
			<td style="width:100px;">Adachi</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">MAS coated slide glass</td>
			<td style="width:100px;">Matsunami Glass</td>
			<td>83-1881</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microscope</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:123px;">CKX41N-31PHP</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Microtube</td>
			<td style="width:100px;">Watoson</td>
			<td style="width:123px;">131-515CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Monoclonal Anti-&#945;-Fetoprotein</td>
			<td style="width:100px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A8452</td>
			<td style="width:172px;">Anti-AFP, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Nanodeop 8000</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Oligo dT</td>
			<td style="width:100px;">FASMAC</td>
			<td style="width:123px;">Custom made Oligo&#160;</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR of sequence is &#34;TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Paraformaldehyde, powder</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">26126-54</td>
			<td style="width:172px;">PFA, fixative, diluted in DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Pharmaceutical refrigerator</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MPR-514</td>
			<td>For 4 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">PIPETMAN P&#160;</td>
			<td style="width:100px;">GILSON</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">Pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human KGF/FGF-7</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">251-KG</td>
			<td style="width:172px;">KGF</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Recombinant Human Noggin</td>
			<td style="width:100px;">PeproTech</td>
			<td style="width:123px;">120-10C</td>
			<td style="width:172px;">NOGGIN</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A</td>
			<td style="width:100px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:123px;">338-AC</td>
			<td style="width:172px;">Activin A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">ReverTra Ace (100 U/&#956;L)</td>
			<td style="width:100px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:123px;">TRT-101</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rnase-Free Dnase Set (50)</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">79254</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td style="width:100px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">74104</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640 with L-Gln</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">30264-85</td>
			<td style="width:172px;">RPMI 1640</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sealing Film for Real Time</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td style="width:123px;">NJ500</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 10 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 25 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td>4489</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Serological pipettes 5 mL</td>
			<td style="width:100px;">Costar/Corning</td>
			<td style="width:123px;">4487</td>
			<td style="width:172px;">For cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td>
			<td style="width:100px;">Cell signaling</td>
			<td style="width:123px;">3579S</td>
			<td style="width:172px;">Anti-SOX2, &#215; 1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">StepOnePlus</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Sucrose</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td>30406-25</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">TB Green 
			Premix Ex Taq II&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Takara</td>
			<td>RR820B</td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450101J1</td>
			<td style="width:172px;">Automatic cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek OCT compound 4583&#160;</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters</td>
			<td style="width:100px;">Sakura Finetechnical</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:172px;">For immunostaining of aggregates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:100px;">Nacalai tesque</td>
			<td style="width:123px;">35501-15</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:100px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">1450021</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Ultracold freezer</td>
			<td style="width:100px;">SANYO</td>
			<td style="width:123px;">MDF-U33V</td>
			<td>For -80 &#176;C storing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:100px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15575-038</td>
			<td style="width:172px;">Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:223px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:100px;">Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:172px;">For RT-qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:223px;">Y-27632</td>
			<td style="width:100px;">Wako</td>
			<td style="width:123px;">251-00514</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation of pancreas/duodenum homeobox protein 1+ posterior foregut/pancreatic progenitors from hpscs in adhesion cultures

Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para la medicina regenerativa y una plataforma para el estudio de procesos de desarrollo humanos. Paso a paso dirigido a la diferenciación que recapitula los procesos de desarrollo es una de las principales formas de generar células pancreáticas incluyendo proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionales inician la diferenciación con pequeñas colonias poco después del paso. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades, que podrían dificultar la diferenciación a PDX1+ las células. Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ las células. El protocolo consta de cuatro pasos e inicia la diferenciación de células disociadas siembra. La inducción de SOX17+ las células del endodermo definitivo fue seguida por la expresión de marcadores de tubo de intestino primitivo dos, HNF1β y HNF4α y eventual diferenciación en PDX1+ las células. El presente Protocolo proporciona fácil manejo y puede mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados ineficazmente diferenciarse en linajes endodérmicos o PDX1+ las células.

Propagación hiPSCs (585A129,30) se condensan y forman una monocapa homogénea (figura 1B) que es conveniente para la diferenciación. HiPSCs indiferenciados (etapa 0) son disociados y volver a sembrar como células individuales en densidades bajas de la célula (1-1.5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, las células se unen a la placa y comiencen a mostrar protrusión. El día 1, las células proliferan y bien ...

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Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) en la proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) las células para la generación de linajes pancreáticos basan en el crecimiento de monocapa tipo de Colonia no de disociar las células. Este método es adecuado para producir células derivadas del hPSC homogéneas, manipulación genética y selección.

Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

La principal ventaja de esta técnica es que antes de la estimulación, las células se dispersan uniformemente y luego se estimulan uniformemente en la adhesión celular en tándem. Demostrando el procedimiento estará Azuma Kimura, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, transfiera seis mililitros de RPMI 1640 a un tubo enfriado a cuatro grados Celsius sobre hielo.Usando puntas de pipeta de un mililitro enfriada, agregue dos miligramos de matriz de membrana del sótano. Mezclar bien por pipeteo suave para que sea una matriz de membrana sótano con una concentración de 0.33 miligramos por mililitro. A continuación, utilice una pipeta para transferir dos mililitros de la matriz de membrana del sótano diluido a cada pozo de una placa de cultivo celular de seis pozos.Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 60 a 90 minutos. Después de esto, mantenga la placa a temperatura ambiente durante un máximo de tres horas, hasta que esté lista para usar. En primer lugar, aspirar el medio utilizado y utilizar una pipeta para añadir dos mililitros de EDTA de 0,5 milimolares a cada pozo para lavar los hPCS cultivados en la placa de seis pozos.A continuación, aspirar el EDTA de los pozos y añadir dos mililitros de EDTA fresco de 0,5 milimolar a cada pozo. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de esto, aspirar el EDTA de cada pozo.Añadir un mililitro de medio de mantenimiento hPSC a temperatura ambiente, complementado con 10 micromolares Y27632 a cada pocólimo. Pipetear suavemente pero rápidamente para soplar las células adheridas en la placa y para disociar las células agrupadas en células individuales. Transfiera la suspensión celular en un tubo centrífugo de 50 mililitros que contenga cuatro mililitros de medio de mantenimiento hPSC complementado con 10 micromolares Y27632 por pozo y mezcle por pipeteo.A continuación, mezclar 15 microlitros de suspensión celular con 15 microlitros de color azul tripano en el tubo. Utilice una pipeta de 10 microlitros para transferir 10 microlitros de la suspensión celular diluida a las diapositivas de conteo celular por duplicado. Usando un contador de celda automatizado, cuente el número de celda y calcule la densidad de celdas en la suspensión celular.Asigne la suspensión celular en un tubo de 50 mililitros a una densidad de uno a un millón y medio de células para cada pozo que se va a utilizar. Centrifugar el tubo a 200 veces G y a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de esto, utilice una pipeta para aspirar el sobrenadante y re-suspender las células usando un mililitro de media de etapa 1A por pozo.Pipetear suavemente la suspensión celular y luego añadir otro mililitro de la etapa 1A medio por pozo. Usando una pipeta de 1000 microlitros, aspirar la matriz de membrana del sótano diluido de los pozos de la placa de cultivo celular previamente preparada. Pipetee inmediatamente la suspensión en el tubo suavemente y transfiera dos mililitros a cada pozo de una placa de seis pozos.Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz y coloque la placa en un banco limpio a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Después de esto, transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada durante 24 horas. En primer lugar, agitar suavemente la placa y utilizar una pipeta para aspirar el medio utilizado.A continuación, agregue dos mililitros de DPBS a cada pozo. Agitar suavemente la placa de nuevo y aspirar el DPBS utilizado. Añadir cuatro mililitros de la etapa 1B medio, precalegado a 37 grados Celsius, a cada pozo.Transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada al cultivo durante 48 horas. Después de esto, agitar suavemente la placa y aspirar el medio utilizado. Agregue dos mililitros de DPBS a cada pozo.Repita esta aspiración y adición de DPBS una vez adicional. Agitar suavemente la placa y aspirar el DPBS usado. Añadir cuatro mililitros de la etapa 1B medio, precalegado a 37 grados Celsius, a cada pozo.Transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora, a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada al cultivo durante 24 horas. En primer lugar, agitar suavemente la placa y aspirar el medio utilizado. Agregue dos mililitros de DPBS a cada pozo de la placa de seis pozos.A continuación, agitar suavemente la placa y aspirar el DPBS usado. Añadir cuatro mililitros de la etapa dos mediana, precale calentado a 37 grados Celsius, a cada pozo. Transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada al cultivo durante cuatro días.Agitar suavemente la placa y aspirar el medio utilizado. Agregue dos mililitros de DPBS a cada pozo. Repita este proceso de aspirar y agregar DPPS una vez más.Después de esto, agitar suavemente la placa y aspirar el DPBS usado. Añadir cuatro mililitros de la tercera etapa medio, precalegado a 37 grados Celsius, a cada pozo. Transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y una atmósfera humidificada al cultivo durante tres días.En este estudio, los hIPSEs de propagación se condensan y forman una monocapa homogénea que es adecuada para la diferenciación. Los hIPSEs indiferenciados se disoccian y se vuelven a sembrar como células individuales a densidades celulares bajas. Dentro de una hora, las células se unen a la placa y comienzan a mostrar protuberancia.En el primer día, las células son proliferadas y bien distribuidas para cubrir entre el 80 y el 90% de la superficie. En los días tres y cuatro, las células forman una lámina monocapa homogénea que se puede describir como una apariencia de adoquines. En este punto, la mayoría de las células dejan de expresar SOX2, que es un marcador para las células indiferenciadas, y en su lugar expresan un marcador de endodermo definitivo, SOX17, en más del 90%La mayoría de las células SOX17 positivas expresan FOXA2.Luego las células comienzan a expresar los marcadores de goptupe primitivos, HNF1-beta y HNF4-alpha, y finalmente expresan un marcador progenitor pancreático posterior, PDX1, a más del 90%La inducción de células PDX1 positivas es reproducible en otra línea hIPSE, 1231A3, y una línea hESE, KhES-3. Los resultados QRTPCR de la expresión DE MRNA de los marcadores de etapa son consistentes con la inmunostaining y la expresión MRNA de PDX1 es evidente en la etapa tres y aumenta sustancialmente después. Dado que las células ESIPS indiferenciadas se cultivan como colonias, las células individuales se encuentran localmente en un estado diferente.Este protocolo proporciona una manera de estimular las células uniformemente para la diferenciación elegida.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Aislamiento, cultivo y diferenciación de células estromales de médula ósea y progenitores de los osteoclastos de los ratones

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...