Name: micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

ونحن ممتنون لمؤسسة البحوث الألمانية (DFG) للدعم المالي (منحة رقم RO2414/5-1 إلى الخمير الحمر).

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

رصد ديناميات الزمانية المكانية للبروتينات والجزيئات الأخرى في الخلايا الحية قد أصبحت أداة أساسية في مجالات عديدة من الخلية والبيولوجيا الجزيئية. تقنيات الفحص المجهري بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار (الحنق) وعمر الحنق-الأسفار التصوير (الحنق-فليم) متقدمة الأسفار، أو السماح فراب وفقدان fluorescence في فوتوبليتشينج (الوجه) وفوتواكتيفيشن، فضلا عن العديد من الآخرين الزماني والمكاني تتبع لتفاعلات البروتين البروتين، التغييرات كونفورماشونال، فضلا عن تحديد الحركية نشر وتعريب مختلف البروتينات في الخلية1،2. تقنيات فراب وفوتواكتيفيشن، على وجه الخصوص، قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة المنظمين للهجرة سيتوسكيليتون وخلية أكتين. هذه التقنيات يمكن تطبيقها منفردة أو مجتمعة مع تقنيات ميكرومانيبوليشن إضافية مثل microinjection3، وتنطوي على التعبير عن البروتينات المسماة فلوريسسينتلي. أنها تسمح تقدير حركية رابطة البروتين الغنية أكتين الهياكل المعنية بالهجرة الخلية، مثل فيلوبوديا أو لاميليبوديا، دوران البروتينات في الالتصاقات البؤري4، أو تشعبت أكتين الشبكات5. وهي تمكن أيضا تحديد معدلات بلمرة الأكتين لاميليبوديال، تقييم تشتت أكتين أحادي داخل سيتوسول، معدل أكتين سوبسيلولار مونومر إزفاء إلى مبلمرة خيوط الأكتين في جاحظ لاميليبوديا6، وغيرها من المعالم.
فراب طريقة لتصور والتحديد الكمي لتنقل البروتينات داخل خلية حية، وضعت أصلاً في السبعينات اكسلرود7. منطقة الاهتمام (ROI) داخل خلية، يسكنها مع البروتينات المسماة فلوريسسينتلي، يتعرض عابر لليزر عالية الكثافة، كافية لتسبب تبيض من جزيئات فلوروفوري الموجودين في هذه المنطقة خلال فترة زمنية قصيرة معينة. غير مقصور، المسمى فلوريسسينتلي البروتينات الموجودة خارج العائد على الاستثمار خلال التبييض، سوف منتشر واختراق منطقة المبيضة اعتماداً على ديناميتها الزمانية المكانية، مما تسبب في تشريد الجزيئات فوتوبليتشيد على مر الزمن. معدل الاسترداد fluorescence في المناطق المبيضة تعتمد على عوامل مختلفة، بما في ذلك الحجم ومعدل انتشار جزيء معين، وطبعا المرتبطة معدل الدوران داخل المفترضة هيكل المبيض. وهكذا، سوف التوسط من أجل انتعاش الأسفار داخل دوروا المبيضة سريعاً من خلال نشرها، بينما البروتينات محكم المرتبطة بالهياكل مثل الالتصاقات التنسيق البروتينات القابلة للذوبان، سوف يكون وقت أطول للدوران، كما سيتم استردادها الأسفار تعتمد على نشر جزء صغير قابل للذوبان من حركية البروتين وتفكك رابطة الكسر المرتبطة بهيكل. عادة ما يكتسب الانتعاش الأسفار وكمياً حتى يتم التوصل إلى المستوى الأولى لكثافة ما قبل التبييض للأسفار. ومع ذلك، لا يحدث هذا إذا كان جزء من شدة الأسفار الأولى ينتمي إلى ما يسمى الكسر غير متحركة، وغير قادر على أن تتجدد بنشرها أو يتم تغذيته بمعدلات بطيئة جداً بالمقارنة مع معظم الجزيئات تتألف من الهاتف النقال كسر. لتحديد معدل دوران البروتين، يتم إنشاؤها المنحنيات فراب، تمثل مدى الانتعاش الأسفار على مر الزمن. من هذه المنحنيات الانتعاش، يمكن حساب نصف متوسط من البروتين الانتعاش. عن طريق إنشاء منحنى يناسب متوسط فراب البيانات والتحليلات الرياضية ومن ثم، من الممكن أيضا للاستدلال على ما إذا كان معدل دوران متوسط الكسر المحمول يشكل مركب سكان متجانسة واحدة من الجزيئات، أو ما إذا كان وهو يتألف من الفئات السكانية الفرعية اثنين أو أكثر من الجزيئات تقليب أسعار تفاضلية. بالإضافة إلى تقدير معدلات دوران البروتين بالنهج الكمي، تتبع انتعاش المناطق فوتوبليتشيد في لاميليبوديا يمكن أن تسمح أيضا لدقة التحديد الكمي لمعلمات حركية لاميليبوديال مثل تدفق إلى الوراء، وبروز، ومعدلات بلمرة الأكتين. وهكذا، يشكل فراب أداة متعددة الاستخدامات التي ينبغي تطبيقها لتقييم المعلمات المختلفة داخل هياكل الخلايا الحية.
فوتواكتيفيشن أسلوب يستخدم لتعقب نشر والتنقل من البروتينات أو جزيئات مصدرها موقع خلوي معين. التقنية تستخدم، على سبيل المثال، متغير بروتين البرية من نوع فلورسنت الأخضر (التجارة والنقل)، وضعت في البداية باترسون ويبينكوت شوارتز8، والذي هو تحور بطريقة تسمح الأسفار الغاية تزداد عند التعرض الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) (حوالي 400 نانومتر؛ وهنا، 405 nm). كما وصفها باترسون et al.، صباغات التجارة والنقل البرية من نوع الوجود كعدد سكان مختلطة الفينولات محايدة وانيوني فينولاتيس، التي تنتج ذروة امتصاص رئيسية في حوالي 397 نانومتر وواحدة ثانوية في 475 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي. عند تشعيع البروتين مع الأشعة فوق البنفسجية، يخضع السكان فوتوكونفيرسيون، التحول نحو النموذج أنيونى. عندما ولع 488 نانومتر، يسلك البروتين فوتوكونفيرتيد/فوتواكتيفاتيد بزيادة 3-fold في الأسفار، غير كافية في ممارسة للتمييز بين المنشط وغير-تنشيط التجارة والنقل بسبب الأسفار الخلفية الجوهرية عالية. ومع ذلك، تحقق انخفاض في كثافة الخلفية بإدخال طفرة واحدة من الأحماض الأمينية ضمن تسلسل التجارة والنقل (استبدال الحامض الأميني في موقف 203). متحولة T203H الناجمة عن ذلك، المعروفة أيضا باسم فوتواكتيفاتابل-التجارة والنقل (السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل) ويتسم بانخفاض كبير في امتصاص ذروة البسيطة، التي تزداد تقريبا معززات عندما متحمس في وقت لاحق من 488 نانومتر الضوء عند التشعيع مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ومن ثم، overexpression بروتينات السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-معلم هو نهج مستخدمة على نطاق واسع، مما يسمح بتحديد نشر وحركية الجزيئات داخل الخلايا. قد طبقنا سابقا أكتين السلطة الفلسطينية-التجارة والنقل-معلم لتحديد معدل تشتت مونومرات أكتين بعيداً عن مناطق سيتوسوليك، السماح بالتنقيب ليس فقط من حركتها داخل في سيتوسول، ولكن أيضا معدل التأسيس إلى بروز شبكة أكتين لاميليبوديال6. كما يصف الأدب أكثر حداثة الرواية، وصور قابلة للتحويل من البروتينات التي يمكن من حيث المبدأ بطريقة مماثلة، ولكن إيواء ميزة يحتمل أن تكون مرئية مسبقاً قبل تحويل الصور. وتشمل أمثلة لهذه المجموعة من البروتينات الفلورية Dendra2 و mEos29،10،،من1112.
في هذه المقالة، نحن شرح منهجية الخلايا ميكروينجيكتينج مع البروتينات. كذلك نشرح كيف يمكن دمج هذه التقنية مع فراب، بالبروتينات فوتوبليتشينج المشاركة في التنظيم cytoskeleton أكتين وحركية، وكيف يمكن اشتقاق منحنيات فراب ونصف الوقت لتعافي كسور المتنقلة. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم مثالاً على كيف يمكن استخدام الأسلوب فراب لتحديد معدلات بلمرة الأكتين لشبكات لاميليبوديال. كما أننا نقدم توجيهات ونصائح بشأن كيفية إجراء التجارب فوتواكتيفيشن، والتي يمكن استخدامها لتحديد معدلات لإدماج أكتين لاميليبوديا والتنقل سيتوسوليك من أكتين أحادي. هذه التقنيات، بالطبع، ليست فقط محدودة لتتبع مكونات cytoskeleton أكتين، ولكن يحتمل أن تكون مطلوبة وتكييف معتدلة أو التحسين، يمكن تطبيقها على نطاق واسع لأنواع الخلايا الأخرى أو للتحقيق في البروتينات المختلفة، والهياكل، و معلمات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

يمكن أن تكشف دراسة ديناميات الزمانية المكانية للبروتينات أهميتها الوظيفية في سياقات مختلفة. في هذه المقالة، أنها ناقشت الانتعاش الفلورسنت كيف بعد فوتوبليتشينج (فراب)، وتقنيات فوتواكتيفيشن يمكن استخدامها لدراسة ديناميات الزمانية المكانية للبروتينات في مواقع سوبسيلولار. نعرض أيضا كيفية تمكين هذه التقنيات مباشرة تحديد معلمات مختلفة مرتبطة بحركية التنظيم وخلية cytoskeletal أكتين. وعلاوة على ذلك، microinjection الخلايا هو بالإضافة إلى ذلك وصف كعلاج بديل (يحتمل أن تكون السابقة أو مكملة لتقنيات photomanipulation السالفة الذكر) الآثار الزناد لحظية لذوبانها البروتينات في الخلية مورفولوجيا والدالة. ميكرومانيبوليشن مثل حقن بروتين أو التطبيق المحلي للمخدرات نفاذية غشاء البلازما أو مثبطات سيتوسكيليتال يمكن أن تخدم كأداة قوية لتسجيل النتائج الفورية لعلاج معين على سلوك الخلايا في خلية واحدة وسوبسيلولار المستوى. وهذا يتمثل هنا الفوري التعريفي لبروز حافة الخلية لاميليبوديال بحقن المؤتلف Rac1 البروتين، كما أنشئت منذ ربع قرن. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم على بروتوكول لتحديد معدل دوران للبروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)-بسب، بوليميراز خيوط أكتين تراكم مكاناً بارزا في نصائح لاميليبوديال الخلايا B16-F1، وتوظيف فراب ومنها المرتبطة البيانات تحليل وتركيب المنحنى. ونقدم أيضا مبادئ توجيهية لتقدير معدلات لاميليبوديال أكتين شبكة البلمرة، المتمثلة في الخلايا معربا عن معلم اجفب β-أكتين. وأخيراً، هناك تعليمات لكيفية التحقيق في معدلات أكتين مونومر التنقل داخل السيتوبلازم الخلية، متبوعاً بإدماج أكتين في مواقع الجمعية خيوط السريع، مثل النصائح من جاحظ لاميليبوديا، باستخدام فوتواكتيفيشن النهج. أي من هذه البروتوكولات مقيد إلى مكونات أو المنظمين من cytoskeleton أكتين، ولكن يمكن أن تمتد بسهولة إلى استكشاف في أزياء مماثلة ديناميات الزمانية المكانية ووظيفة البروتينات في مختلف هياكل سوبسيلولار مختلفة أو الوظيفية سياقات.

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

ونحن تصف كيفية تمكين التقنيات المتناهية الصغر و photomanipulation مثل فراب وفوتواكتيفيشن تحديد بارامترات حركية وديناميات الزمانية المكانية للبروتينات داخل ترحيل الخلايا. قراءات تجريبية تشمل ديناميات سوبسيلولار ودوران المنظمين حركية أو cytoskeleton أكتين الكامنة.

تقنيات ميكرومانيبوليشن يسمح تحليل الديناميات Morphogenetic ودوران للمنظمين سيتوسكيليتال

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis والمجهرية للتصوير الإسفار Intravital للدوران الأوعية الدقيقة

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

تتبع التشويهات الأنسجة التخلق في جنين الفرخ المبكر

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

تحليل Phosphopeptide من القوارض بربخي المني

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‹Å“Touch DNAÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢ Evidence

تحليل الوراثية المحسنة من واحدة Bioparticles الإنسان المستردة من قبل المجهرية المبسطة من الطب الشرعي الأدلة &quot;تاتش DNA&quot;

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

إدارة بسيطة وفعالة والتصور من المجهرية الدقيقة في الدورة الدموية للأسماك الصغيرة باستخدام الحقن الكلي

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

تطبيقات رسم الخرائط الزمانية وتقنيات تحليل الجسيمات للتحديد الكمي لداخل الخلية Ca2 + إشارات في الموقع

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...