Name: micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Vi er taknemmelige til tyske Research Foundation (DFG) for økonomisk støtte (støtte Nr. RO2414/5-1 til KR).

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Her kan vi diskutere kritisk trin i de teknikker, der beskrives i denne artikel, og hvordan de kan være optimeret til anvendelse i forskellige forsøgsbetingelser.
Mikroinjektion er en metode, der kan anvendes til at overvåge i celler de instant effekter fra at indføre eksogene proteiner, hæmmere eller narkotika. Det kan være særlig fordelagtig for bestemmelse af funktionerne af proteinerne i vanskelige at transfect celletyper eller i situationer, hvor langsigtede udtryk ikke er ønsket. Det skal bemærkes, at overlevelsen af visse celletyper varierer afhængigt af den ekstracellulære matrix de udsås på. Mest endotel, epithelial eller fibroblast-lignende celletyper, selv små lide fisk keratocytes (Se Dang et al. 21 og Anderson og Cross22) kan sprøjtes med succes. Men der er undtagelser, såsom B16-F1 celler seedede på laminin, der udgør en fremragende modelsystem af celle migration, men er uforenelig med indsprøjtning på denne type af undergrundens af ukendt årsag. For NIH3T3 fibroblastceller udføre vi rutinemæssigt injektioner på fibronektin undergrundens og yderligere photomanipulation teknikker såsom FRAP (selv med photoactivation, vist for B16-F1 celler her) kan udføres lige så godt i disse fibroblaster (jf. f.eks. Köstler et al. 3). det skal også overvejes, at forskellige proteiner, ifølge deres funktionelle egenskaber og eksperiment mål, kan tage forskellige mængder af tid til at forårsage ændringer, varierende fra sekunder til timer. En fordel ved teknikken er, at dosis/koncentration af udefrakommende agent kan styres mere præcist på det enkelte celle niveau end f.eks., når du bruger plasmid Transfektion. Derudover er fluorescerende tagging af et protein ikke en nødvendighed for at sikre sin tilstedeværelse i den celle, som kan øge fleksibiliteten, hvis simultan multi-kanal visualisering af andre fluorescently markeret proteiner er nødvendige. Mikroinjektion kan være særligt nyttigt for analyse instant effekter af specifikke proteiner eller protein blandinger på dynamiske ændringer i celle morfologi eller cytoskeleton (fx Dang et al. 21 for et eksempel på instant effekter på migration af Arp2/3 komplekse hæmmer Arpin). En ulempe ved teknikken er dens invasionsevne, som kan forårsage celleskader eller påvirke celle morfologi. Derfor en vigtig overvejelse, når du udfører microinjections overvågning celle levedygtighed. Metoden indført her er afhængig af manuelle manipulation. I betingelser, der er testet til at være kompatibel med vellykket injektioner, såsom fibroblaster vokser på fibronektin undergrundens, tillader manuel injektion protokollen beskrevet her en i nærheden af 100% succesrate; Dette er afgørende, når du kombinerer denne tilgang med avancerede og tidskrævende opfølgende forsøg herunder video mikroskopi eller FRAP, som er offentliggjort tidligere3. Dette udelukker ikke, at lejlighedsvis, individuelle celler måske lider af en mikroinjektion begivenhed, som sikkert kan genkendes af pludselige ændringer i kontrast af både kernen og cytoplasmaet, efterfulgt af celle kant retraktion. Disse sjældne eksperimentelle tilfælde er udelukket, og således ikke anses for yderligere analyser.
Men en halv-automatiske tilgang er også almindeligt anvendt, for eksempel ansættelse af hurtige (< 300 ms) maskine-kontrolleret nål sænke sammenfaldende med indsprøjtning pres stigning, således at nålen kun skal være placeret over hver celle før respektive injektion. Succesraten for halv-automatiske injektioner er pr. definition lavere end den manuelle metode beskrevet ovenfor, blot fordi det er optimeret til hastighed, efterfulgt af en analyse af flere celler, der med held at overlevet denne behandling; Det er således ikke afhængig vellykket injektion af en enkelt celle. Derfor, i stedet for enkelt celle analyse, halv-automatiske injektioner er bedre egnet til at analysere injektion effekter af flere hundrede celler, fx af video mikroskopi ved lav forstørrelse eller celle fiksering og farvning. Uanset den detaljerede temacenter mikroinjektion udgør ikke en end-point assay, men kan kombineres med en række teknikker, herunder FRAP eller photoactivation3.
Ved fastsættelsen af protein omsætning sats af FRAP, intensiteten af laser skal optimeres, afhængigt af mikroskop setup og billeddannelse (forstørrelse, mål, etc., samt celletype, struktur og fluorescerende proteiner for photobleaching). Bemærk, at på optimal laser power, effektiv blegning er kombineret med den mindst mulige solskader, for at undgå svind eller komplet retraktion af struktur under analyse (f.eks. lamellipodia eller filopodia) eller endda skader på cellulært niveau. Ideelt set bør mindst 70 – 80% af blegning effektivitet opnået, selv om komplet blegning kan blive hæmmet af ekstremt hurtig omsætning af protein, i hvilket tilfælde, noget over 50% kan også være acceptable. Optimal blegning magt for en given struktur og fluorescerende farvestof bør afprøves eksperimentelt, starter fra et lavt laser power efterfulgt af sin gradvis stigning. Naturligvis, enhver fluorescerende farvestof kan pr. definition være bleget med laserlys tæt på dens højdepunkt af excitation (488 nm til ofte anvendte grønne farvestoffer såsom FITC eller EGFP). Men lasere med kortere bølgelængder, som nær-UV-lasere, levere højere magter og kan dermed også bruges til effektiv blegning af almindeligt anvendte farvestoffer. Vi rutinemæssigt anvender en 405 nm diodelaser (120 mW) til blegning af både EGFP og røde fluorescerende farvestoffer (f.eks mCherry), omend med lidt lavere effektivitet i tilfælde af den sidstnævnte (data ikke vist). Som 405 nm-diode kan også bruges til photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis (se nedenfor), forlener det dette system med maksimal fleksibilitet.
405 nm-laser beføjelser mellem 65 – 100 mW blev anvendt for B16-F1 cellestrukturer og fluorescerende proteiner photobleached her. Når du analyserer en photobleached region, er det vigtigt at overveje, om den givne struktur er bevaret i sin oprindelige form over analysen tidsperiode. For eksempel, når du analyserer omsætning af proteiner i lamellipodia tips, bør sikres om krumning af lamellipodia er væsentligt ændret over tid, som ændringer i krumning kan føre til unøjagtige resultater, hvis region/contour analyseres ikke fuldt ud omfatte helhed i strukturen i hver målte ramme. Derudover skal det bemærkes, at bundter indlejret i lamellipodia, såsom microspikes, kan medføre afvigelser i fluorescens intensitet. Som illustreret i figur 2b (hvid pil i 9 s tidsramme), en microspike-lignende struktur er beliggende ved siden af den målte photobleached region, men forbliver uden for det i hele varigheden af måling, og dermed hidføre ikke hvilken som helst unøjagtighed. Vigtige overvejelser ved valg af placering og størrelse af analyserede regioner er for analyse af protein omsætning, at deres fluorescens over tid ikke bør blive betydeligt påvirket af ændringer i celle morfologi eller faktorer andet end hårdt at undgå Køb photobleaching. Eksempelvis bør strukturer yder betydelige kvantitative bidrag til de analyserede struktur ikke flytte ud af den målte region under analysen; Derudover bør uafhængige, fluorescerende enheder såsom vesikulære strukturer, som tiltrækker proteinet ikke indgå felt af interesse under analysen. For fastsættelsen af den lamellipodial actin polymerisering, bør sikres at analyseres ingen tilbagetrækningskraften eller ruffling (dvs. opad foldning) lamellipodia, som dette vil stærkt påvirker nøjagtigheden af resultaterne. Derudover retraktion af lamellipodial regioner vises måske som hurtige bageste translokation, potentielt fører til overvurdering af satserne for lamellipodial actin polymerisering. En ekstra overvejelse er afstanden af intracellulære normalisering regioner (taget som reference standpunkter til korrektion af erhvervelse photobleaching) fra den faktiske placering af photobleaching, som bør være stor nok til at undgå direkte indflydelse af photobleached området.
Når du opretter optimale betingelser for photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis-tagged konstruktioner, udvises forsigtighed bør undgå instant blegning under photoactivation. I vores arbejde, de bedste resultater blev opnået med laser beføjelser 5 - 10 gange lavere end normalt ansat til blegning af EGFP. For image erhvervelse af photoactivated molekyler, bør eksponeringstid og tidsintervallet mellem rammer optimeres ved at overveje størrelsen af regioner og strukturer til at være photoactivated og analyseret, samt den potentielle mobilitet af photoactivated proteiner til andre subcellulært placeringer. Som for alle typer af fluorescens imaging er vedligeholdelse af cellernes levedygtighed afgørende for at opnå fysiologisk relevante resultater.
I princippet, grøn til rød photoconversion af fluorescerende proteiner som mEos eller Dronpa varianter12 udgør en lige så kraftfuld metode til følgende dynamics og omsætning af subcellulært strukturer som lamellipodium (Se f.eks. Burnette et al. 23). fordelen, at den sidstnævnte metode i modsætning til PA-normal god landbrugspraksis ville være mulighed for at følge protein dynamics før og efter konvertering med to forskellige farver, uden at skulle Co udtrykke en ekstra røde fluorescerende proteiner. I vores foreløbige eksperimenter var kontrast ændring omfang og intensitet af fluorescerende signal opnået ved photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis dog større i forhold til photoconverted sonder, måske på grund af de overlegne spektrale beskrivere grønne versus rød fluorescerende sonder (data ikke vist). Under alle omstændigheder har detaljerede undersøgelser af actin glødetrådens omsætning i celle-kant fremspring såsom lamellipodia eller Vaccinia virus-induceret actin haler hidtil kun været udgivet ved hjælp af PA-normal god landbrugspraksis derivater5,6,24.
Når man overvejer hvilken celle region at analysere efter photoactivation, flere faktorer skal tages i betragtning, som er drøftet ved hjælp af det specifikke eksempel vist her (indarbejdelse af actin monomerer frontviden celle ved aktivering i cytosol), men kan helt sikkert ekstrapoleres til forskellige analoge videnskabelige problemer. Først, når måling sats lamellipodial indarbejdelse af cytosolically photoactivated proteiner, for eksempel, i forskellige eksperimentelle betingelser (som vist i Dimchev et al. 6), størrelser af cytosole regioner og deres afstande til lamellipodial kanter skal være sammenlignelige mellem eksperimentelle grupper. Det er også vigtigt at overveje, når photoactivating cytosole regioner, celle-tykkelsen er større i synspunkter tættere til kernen. Aktivering tykkere cellulære regioner kan resultere i større mængder af aktiverede proteiner, at fordelingen af protein skal aktiveres fordeles homogen måde i cytosol. Endelig kan udtrykket niveauer af protein skal aktiveres, helt sikkert være meget varierende i individuelle celler. Alle disse overvejelser af variation er det afgørende at sammenligne indarbejdelse niveauer af cytosolically aktiveret proteiner andetsteds i cellen i forhold til den samlede fluorescens opnået ved aktivering i specifikke regioner.
Vi har beskrevet hvordan mikroinjektion kan bruges som et redskab til at undersøge virkningerne af proteiner på celle morfologi og har illustreret dette ved at demonstrere den potente induktion af lamellipodial strukturer i NIH3T3 fibroblastceller microinjected med den små GTPase Rac1. Vi har tidligere anvendt denne teknik til at blande sig med Arp2/3 funktion i celler microinjected med C-terminale WCA domæne af Scar/bølge3. Forskellige parametre i microinjected celler kan analyseres af andre assays, såsom FRAP eller photoactivation. Vi har beskrevet, hvordan FRAP og photoactivation kan være ansat for at undersøge subcellulært dynamics og mobilitet af actin monomerer. FRAP er blevet brugt af vores gruppe tidligere5 at undersøge omsætning af proteiner lokalisering til lamellipodia, såsom VASP, Abi, cortactin, cofilin, og capping protein eller belyse omsætningen af komponenter i fokale sammenvoksninger i tilstedeværelsen og fravær af Rac signalering4. Desuden måler actin polymerisering satser kan ske ved photobleaching EGFP-tagged β-actin5, men findes alternative metoder. Sporing fluorescerende inhomogeneities som set af levende celle imaging-kompatible sonder mærkning cellular actin filamenter, såsom Lifeact25, kan også være ansat6,26. Fordelen her er at overekspression af β-actin kan undgås, som er i stand til at øge celle kant fremspring og migration, og dermed potentielt interfererer med den specifikke analyse eller eksperimenterende spørgsmål (Se fx Kage et al. 26; Peckham et al. 27). en klar ulempe for Lifeact sonde udgør imidlertid sin hurtig on/off kinetik af binding til actin filamenter, således at blegning af actin glødetrådens strukturer mærket af Lifeact i cellerne indeholder oplysninger kun på sonden omsætning, men ikke omsætning af actin filamenter, som binder den25. Sporing af fluorescens inhomogeneities ansat tidligere6,26 giver et praktisk kompromis, meget lig den udbredte sporing af fluorescens prikker indarbejdet i trådformede cytoskeletal strukturer (Se fx laks og Waterman28), men kan ikke være så ligetil at bruge og så præcis som FRAP af EGFP-mærkede F-actin strukturer. Photoactivation er blevet anvendt ved os til estimering satser af monomere actin indarbejdelse i fremspringende lamellipodia, såvel som dens mobilitet i hele cytosol, i forbindelse med eksperimentelt tuned cytosole F-actin niveauer6. Teknikken er nyttig, når undersøge mobilitet og fordeling af proteiner fremstillet af relativt store områder, såsom cytosole regioner. Imidlertid fremstillet undersøge fordelingen af proteiner af forholdsvis små photoactivated strukturer; fx vækst kegler kan være udfordrende på grund af lavt antal fluorescerende molekyler aktiveret, svage signaler og dermed manglende følsomhed. Mulige alternative teknikker til photoactivation eller photoconversion af fluorescens (se ovenfor) kan omfatte inverse FRAP, som bygger på photobleaching hele cellen undtagen ROI, efterfulgt af tracking mobilitet af fluorescerende molekyler væk fra denne region. Teknikken kræver ikke overekspression photoactivatable versioner af proteiner, men altid indebærer udsættelse for en usædvanlig høj dosis af laser power, potentielt forårsager uønskede bivirkninger såsom solskader.
Klart, photoactivation og FRAP ikke kan skelne om proteiner er på vej som monomerer, dimerer eller selv små oligomerer, og om de flytter i kombination med yderligere bindende partnere. Oplysninger af denne art kan fås i stedet fra fluorescens korrelations-spektroskopi teknikker29 eller, alternativt, FLIM-FRET30. Ikke desto mindre udgør FRAP og photoactivation ligetil tilgange for at vurdere direkte lokale og globale protein dynamics i celler, uanset protein af interesse, subcellulært placering eller celletype studerede.

Overvågning spatiotemporelle dynamikken i proteiner og andre molekyler i levende celler er blevet et vigtigt værktøj i mange områder af celle- og molekylærbiologi. Avanceret Fluorescens mikroskopi-teknikker herunder fluorescens resonans energioverførsel (FRET) og FRET-fluorescens levetid imaging (FRET-FLIM), eller FRAP, fluorescens tab i photobleaching (FLIP) og photoactivation samt mange andre tillader for den tidsmæssige og rumlige sporing af protein-protein interaktioner, konformationelle ændringer, samt bestemmelse af kinetik af diffusion og lokalisering af forskellige proteiner i cellen1,2. FRAP og photoactivation teknikker, navnlig er alment gældende for behandlingen af regulatorer af actin cytoskelettet og celle migration. Disse teknikker kan anvendes alene eller i kombination med yderligere micromanipulation teknikker såsom mikroinjektion3og inddrage udtryk af fluorescently mærket proteiner. De tillade vurdering af kinetik af protein association til aktin-rige strukturer involveret i celle migration, såsom filopodia eller lamellipodia, af proteiner i fokale sammenvoksninger4, omsætning eller forgrenet actin netværk5. De gør det også muligt bestemmelse af lamellipodial actin polymerisering priser, vurdering af spredningen af monomere actin i cytosol, sats af subcellulært actin monomer translokation til polymeriserende actin filamenter i fremspringende lamellipodia6, og andre parametre.
FRAP er en metode til at visualisere og kvantificering af proteiner i en levende celle, oprindelig udviklet i 1970 ' erne af Axelrod7mobilitet. En region af interesse (ROI) i en celle, befolket med fluorescently mærket proteiner, er forbigående udsat for en laser af høj intensitet, tilstrækkeligt til at forårsage blegning af fluorophore molekyler findes i denne region i en given kort periode. De ublegede, fluorescently mærket proteiner beliggende uden for ROI under blegning, vil diffuse og infiltrere den bleget region alt efter deres spatiotemporelle dynamics, forårsager forskydning af photobleached molekyler over tid. Af fluorescens dækningsgraden i bleget regioner er afhængige af forskellige faktorer, herunder størrelse og satsen for udbredelse af en given molekyle, og naturligvis dets omsætning sats inden for den formodede forbundet bleget struktur. Således opløselige proteiner vil mægle inddrivelse af fluorescens i bleget ROI hurtigt gennem diffusion, mens proteiner tæt forbundet med strukturer, som focal sammenvoksninger, vil have længere omsætning gange, som deres fluorescens recovery vil afhænger af både på udbredelsen af de opløselige brøkdel af den struktur-associerede fraktion protein og dissociation-foreningen kinetik. Fluorescens recovery er normalt erhvervet og kvantificeret indtil den første præ blegemiddel intensiteten af fluorescens nået. Dette forekommer dog ikke hvis en del af den oprindelige fluorescens intensitet tilhører den såkaldte immobile fraktion, som ikke skal genopfyldes ved diffusion eller er efterfyldning på meget langsomme satser i forhold til fleste af molekyler bestående af mobilen brøk. Bestem satsen af protein omsætning genereres FRAP kurver, der repræsenterer omfanget af fluorescens opsving over tid. Fra disse opsving kurver, kan halv-gennemsnitstider protein opsving beregnes. Ved at oprette kurven passer i den gennemsnitlige FRAP data, og dermed matematiske analyser, er det også muligt at udlede, hvorvidt den gennemsnitlige omsætning sats i den mobile brøk er sammensat af en homogen population af molekyler, eller om det er sammensat af to eller flere delpopulationer af molekyler drejning over til differentierede priser. Ud over estimering protein omsætning satser af kvantitative tilgange, kan tracking genopretning af photobleached områder i lamellipodia også tillade for nøjagtig kvantificering af lamellipodial motilitet parametre såsom retrograd flow, fremspring, og aktin polymerisering priser. FRAP udgør et alsidigt værktøj til at blive anvendt til at vurdere forskellige parametre inden for strukturer af levende celler.
Photoactivation er en metode til at spore diffusion og mobilitet af proteiner eller molekyler med oprindelse fra en udpeget cellular placering. Teknikken beskæftiger, for eksempel, en variant af grøn fluorescerende vildtypeprotein (NGL), oprindeligt udviklet af Patterson og Lippincott-Schwartz8, der er muteret på en måde, der tillader dens fluorescens øges stærkt ved udsættelse for ultraviolet (UV) lys (ca. 400 nm; her, 405 nm). Som beskrevet af Patterson mfl., wild-type normal god landbrugspraksis lysopfangende eksisterer som en blandet population af neutrale phenoler og anioniske phenolates, der producerer et større absorbans højdepunkt på ca 397 nm og en lille en på 475 nm, henholdsvis. Ved bestråling af proteinet med UV-lys gennemgår befolkningen photoconversion, skiftende retning af anioniske form. Når ophidset af 488 nm, photoconverted/photoactivated protein udstiller en 3-fold stigning i fluorescens, utilstrækkelig i praksis for at skelne mellem aktiveret og ikke-aktiveret normal god landbrugspraksis på grund af høj iboende baggrund fluorescens. Dog er der sket et fald i baggrunden intensitet ved at indføre en enkelt aminosyre mutation i normal god landbrugspraksis sekvens (histidin substitution på position 203). Den resulterende T203H mutant, også kendt som photoactivatable-normal god landbrugspraksis (PA-NGL) er karakteriseret ved en betydelig reduktion i absorbansen af den mindre peak, som ved bestråling med UV-lys er steget næsten 100 når efterfølgende ophidset af 488 nm lys. Overekspression af PA-normal god landbrugspraksis-tagged proteiner er derfor en udbredte tilgang, som giver mulighed for bestemmelse af diffusion og motilitet af molekyler i celler. Vi har tidligere anvendt PA-normal god landbrugspraksis-tagged actin Bestem satsen for spredning af actin monomerer fra cytosole regioner, giver ikke kun udforskning af deres mobilitet inden for cytosol, men også deres iblanding i den fremspringende lamellipodial actin netværk6. Nyere litteratur beskriver også roman, foto-cabriolet proteiner, som i princippet kan bruges på en tilsvarende måde, men husly den potentielle fordel for at være synlige allerede før foto-konvertering. For denne gruppe af fluorescerende proteiner eksempler Dendra2 og mEos29,10,11,12.
I denne artikel vil forklare vi metode af microinjecting celler med proteiner. Vi forklare yderligere, hvordan denne teknik kan kombineres med FRAP, af photobleaching proteiner involveret i actin cytoskeleton forordning og motilitet, og hvordan FRAP kurver og halv-time inddrivelse af mobile fraktioner kan udledes. Derudover giver vi et eksempel på hvordan FRAP teknik kan bruges til at bestemme actin polymerisering satser af lamellipodial netværk. Vi leverer også vejledning og tips om hvordan man udfører photoactivation eksperimenter, som kan bruges til at bestemme cytosole mobilitet af monomere actin og priser af actin indarbejdelse i lamellipodia. Disse teknikker er naturligvis ikke kun begrænset til sporing af actin cytoskeleton komponenter, men potentielt kræves moderat tilpasning eller optimering, kan i vid udstrækning anvendes til andre celletyper eller at undersøge forskellige proteiner, strukturer, og parametre.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

Undersøge den spatiotemporelle dynamics af proteiner kan afsløre deres funktionelle betydning i forskellige sammenhænge. I denne artikel er det diskuterede hvordan fluorescerende opsving efter photobleaching (FRAP) og photoactivation teknikker kan bruges til at studere proteiner subcellulært steder spatiotemporelle dynamik. Vi viser også, hvordan disse teknikker giver enkel bestemmelse af forskellige parametre knyttet til aktin cytoskeletal forordning og celle motilitet. Derudover er mikroinjektion af celler desuden beskrevet som en alternativ behandling (potentielt forud for eller supplerer de førnævnte photomanipulation teknikker) udløser øjeblikkelige virkninger af omplantede proteiner på celle morfologi og funktion. Micromanipulation såsom protein injektion eller lokale anvendelse af plasma membran-gennemtrængelige narkotika eller cytoskeletal hæmmere kan tjene som kraftfuldt værktøj til at registrere umiddelbare konsekvenser af en given behandling på celle adfærd på en enkelt celle og subcellulært niveau. Dette eksemplificeres her ved umiddelbar induktion af lamellipodial celle kant fremspring ved injektion af rekombinant protein, Rac1, som etablerede et kvart århundrede siden. Derudover giver vi en protokol til bestemmelse af omsætningen af forbedrede grøn fluorescerende proteiner (EGFP)-VASP, en actin glødetrådens polymerase fremtrædende akkumulere på lamellipodial tips B16-F1 celler, beskæftiger FRAP og herunder tilknyttede data analyse og kurve montering. Vi præsenterer også retningslinjer for beregning af satserne for lamellipodial actin netværk polymerisering, som eksemplificeret af celler, der udtrykker EGFP-tagged β-actin. Endelig er instruktioner givet for at undersøge priser af actin monomer mobilitet i cellen cytoplasma, efterfulgt af actin indarbejdelse på websteder af hurtige glødetrådens forsamling, som tips af fremspringende lamellipodia, ved hjælp af photoactivation tilgange. Ingen af disse protokoller er begrænset til komponenter og regulatorer af actin cytoskeleton, men kan nemt udvides til at udforske i analog mode spatiotemporelle dynamik og funktion af proteiner i forskellige forskellige subcellulært strukturer eller funktionelle sammenhænge.

Figur 1 g h Vis fase kontrast billeder af en NIH3T3 fibroblast celle forudgående og 10 min efter mikroinjektion af Rac1, som er en lille Rho-familien GTPase i stand til at inducere lamellipodia dannelse gennem dens samspil med den komplekse bølge. Cellen er først visualiseret før mikroinjektion (figur 1g), for at bekræfte sin levedygtighed og morfologi, fx manglende lamellipodia. På 10 min efter mikroinjektion, har cellen klart ændret dets morfologi, som forventes fra denne behandling, og angiver en vellykket injektion (figur 1h).
For enkelhed og klarhed giver vi næste eksemplarisk resultater for FRAP og photoactivation analyse i celler, der ikke har været desuden microinjected.
Analyse af omsætningen af EGFP-mærkede VASP på lamellipodium spids er vist i figur 2a-f. Bemærk at VASP desuden mål til spirende og fokale sammenvoksninger, små og forlængede prikker i celle indvendige18,19. Fluorescens-intensiteten af en lamellipodial region med en klar VASP ophobning på spidsen var bleget og måles i hvert tidsinterval, ved at følge konturen af ROI, før, under og efter blegning som lamellipodium stikker fremad. Da bleget EGFP-VASP proteiner genbruges af ikke-bleget molekyler på disse steder, er gradvis genopretning af fluorescens observeret (figur 2b). FRAP opsving kurve fremstillet på denne måde og normaliserede pre blegemiddel intensiteten (udtrykt i 1) kan ses i figur 2c. Photobleaching effektivitet kan variere og var ca. 20% af værdien inden blegning i dette eksempel, som bestemmes ud fra værdien på t0 (den første ramme efter photobleaching). Forhøjelsen af fluorescens når et plateau i eksemplet vist på omkring 80% af fluorescens før blegning. I en statisk struktur i tid løbet af eksperimentet, såsom en fokal vedhæftning, forskellen mellem pre blegemiddel intensitet og plateau fluorescens nået efter inddrivelse er defineret som den immobile fraktion (IF, rød pil i figur 2 c, e), der henviser til, at mængden af fluorescens genoprettet mellem tidspunktet for blegning og fuld recovery er defineret som den mobile fraktion (grøn dobbelthovedet pil i figur 2c, e). Bemærk, at i en dynamisk skiftende struktur som den lamellipodium spids analyseres her, omfanget af, hvis kan ikke kun repræsenterer immobile molekyler, men også stammer fra en reduktion af fremspring hastighed, som EGFP-VASP intensitet er kendt for at afhænge af dette parameter18. For at beregne halvleg af recovery, blev en fit kurve lavet på Sigma plot (figur 2d). I dette tilfælde skal værdien af parameteren "b" udvundet fra at løse ligningen 2 svarer til 0.0754, som når anvendes til logaritmisk funktion (ligning 4) resulterer i en anslået halvleg af inddrivelse af 9.19 s (figur 2d , langt højre panel), som er relativt hurtigt i denne særlige celle i forhold til gennemsnitlige offentliggjort tidligere5. Det skal bemærkes, at inddrivelse halv-gange kan undertiden variere betydeligt fra celle til celle inden for samme population. For at opnå repræsentative resultater, anbefaler vi derfor, bestemmelse af denne parameter som gennemsnit fra mindst 15-20 celler. Til at illustrere grad af varians, aritmetiske EGFP-VASP opsving i gennemsnit fra 15 celler for hvert tidspunkt blev genereret (figur 2e), og gennemsnitlig kurve passer oprettet og vises i en analog mode (figur 2 f).
Polymerisering satsen for lamellipodial actin netværk udgøres af summen af fremad netværk fremspring og retrograd flow. FRAP kan anvendes til at måle actin polymerisering satsen af transfecting celler (i dette tilfælde B16-F1) med EGFP-tagged β-actin og photobleaching en fremspringende lamellipodial region (fig. 2g). Analyse af lamellipodial actin netværk polymerisering, er fluorescens opsving efter blegning af EGFP-mærkede β-actin vurderet over tid. Som polymerisering af actin monomerer skrider frem i pigtråd enderne af lamellipodial actin filamenter (som alle peger i retning af den forreste20), er netværket konstant omplantede bagud og skrider fremad, priser der kan være let opnået gennem polariseret inddrivelse af fluorescens efter photobleaching. Fluorescens inddrivelsen af lamellipodium er afsluttet, så snart det blegede område har nået overgangszone mellem den bageste del af lamellipodium og lamel, som er karakteriseret ved en lavere massefylde på mere vandret arrangeret glødetrådens bundter drejning over meget langsommere end hvad er observeret i lamellipodium. Som illustreret i figur 2g, kan fluorescens recovery visualiseres som en linje vandret til kanten og flyde baglæns mod lameller, som giver mulighed for måling af afstande fremspring og retrograd flow (individuelt repræsenteret i panelet længst til højre i figur 2g som orange og røde dobbelthovedet pil, henholdsvis).
Vi har også anvendt photoactivation i B16-F1 celler transfekteret med PA-normal god landbrugspraksis-actin at spore actin monomerer inden for cytosol mobilitet og sats deres vedtægter i fremspringende lamellipodia. Som illustreret i figur 3a, b, en cytosole region var photoactivated ved udsættelse for en 405 nm laser, mens billeder blev erhvervet på normal god landbrugspraksis kanal hver 1,5 s til at visualisere fordelingen af normal god landbrugspraksis-mærket, photoactivated aktin. Photoactivated normal god landbrugspraksis-actin kan ses spreder det cytosole området i figur 3b. Sats af fluorescens intensitet nedgang i regionen photoactivated cytosole er repræsenteret som procentdelen af den oprindelige intensitet på t0 (første ramme efter photoactivation; Figur 3 c). Photoactivated actin også integrerer på spidsen af lamellipodia, hvor nye actin monomerer er føjet til de voksende pigtråd enderne af forlængede actin filamenter i fremspring. For at beregne rente lamellipodial vedtægter, målte vi fluorescens-intensiteten over tid af et to-dimensionelle kontur/område cirka 5 µm i bredde og 1 µm i højden; regionen var konstant re placeret på spidsen af lamellipodium som det stak. Aktin inkorporeringen var repræsenteret som procentdelen af fluorescens intensitet i regionen photoactivated cytosole på t0 (figur 3d). Som forlængelse af actin filamenter skred frem, blev nye actin monomerer indarbejdet lamellipodial foran. En brøkdel af disse actin monomerer stammer stochastically fra det cytosole pool hvor monomerer var photoactivated. Dette resulterer i den hurtige stigning af fluorescens i lamellipodia i de første 20 s efter photoactivation. Som ny monomerer bliver tilføjet til lamellipodial front, tidligere indarbejdet actin monomerer flow med filamenter mod lamel af retrograd flow. Over tid, ROI er helt fyldt med fluorescerende monomerer og et plateau i Fluorescens er nået (figur 3d). En gradvis nedgang i Fluorescens er derefter observeret når efter udbredelsen af photoactivated monomerer i hele cellen, er ikke-photoactivated actin monomerer i stigende grad bliver igen tilføjet lamellipodial foran. Dette fald i fluorescens vil finde en ny plateau, som vil blive nået, så snart en balance i hele cellen mellem photoactivated og ikke-photoactivated monomerer er nået (data ikke vist).
Mobilitet af actin monomerer i hele cytosol blev afledt ved at måle fluorescens intensiteter i regioner af samme størrelse placeret distalt fra photoactivated-regionen (illustreret på figur 3en af farvekodede regioner mærket R1-R5). Som illustreret i figur 3e, fluorescens intensitet i hver af disse regioner er gradvist faldende væk fra den cytosolically photoactivated region, som brøkdel af photoactivated actin monomerer bliver i stigende grad fortyndes med ingen-aktiveret (dvs. ikke-fluorescerende) monomerer. Derudover toppen af Fluorescens er nået senere: de fjernere målte regionen er beliggende, fra photoactivated-regionen, jo længere tid, der kræves til aktin monomerer til diffus i disse regioner. En repræsentativ værdi for graden af actin monomer perkolatnedsivning i hver region kan være afledt af kvantificere halv tid for at nå fluorescens plateau. Jo mere fjerntliggende regionen, jo længere det tager for photoactivated actin til diffuse ind i det, og dermed mere tid er nødvendig for den fluorescerende plateau nås, i sidste ende fører til en højere t1/2 værdi (figur 3e).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> Figur 1 : Imaging kammer forsamling og mikroinjektion procedure. (en) Imaging kammer komponenter. (b) silikone fedt er omhyggeligt smurte rundt om åbningen af en plastik sealer. (c) coverslip er placeret med den celle-side opad ind i midten af den billeddiagnostiske afdeling åbning. (d) en sikker tætning er etableret af positionering af plastik sealer på toppen af coverslip og ved at stramme side klemmer. (e) mikroskopi medium er pipetted ind i kammeret slot. (f) den billeddiagnostiske afdeling er placeret på stadiet mikroskop, varme detektor og elektroder er knyttet til en opvarmning enhed pre-sæt til 37 ° C, og celler er tilladt at tilpasse i mindst 30 min før mikroskopi er indledt. I dette eksempel stadiet mikroskop er også udstyret med en micromanipulator til at udføre microinjections og mikroinjektion nålen er dyppet i det medium, der dækker cellelag i den billeddiagnostiske afdeling. (g) et NIH3T3 fibroblast celle er visualiseret før mikroinjektion af fasekonstrastmikroskopi. Røde Kors i perinuclear rum angiver placeringen af den fremtidige mikroinjektion, hvilket svarer til en høj cytoplasmatisk region på grund af nærhed til den voluminøse kernen. (h) 10 min efter mikroinjektion med Rac1, cellen reagerer af fremtrædende dannelsen af lamellipodia omkring hele cellen periferien (angivet af grønne pile). <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> Figur 2: FRAP tillader fastsættelse af satserne for protein omsætning eller lamellipodial actin polymerisering. (en) repræsentative eksempel på B16-F1 celle udtrykker EGFP-VASP før photobleaching af en lamellipodial region, som angivet. Forskelligt farvede konturer/figurer er mærket for at angive, hvilke regioner blev anset for fluorescens intensitet målinger over tid. Bemærk den røde kontur markeret med et udråbstegn, som etiketter en cytosole region placeret i et område, der indeholder flere vesikler og celle overflade flæser. Dynamiske områder som dette bør undgås for at vælge regioner af fluorescens reference, da de er kendetegnet ved stærkt kortvarige udsving af fluorescens, potentielt forårsager upræcise resultater. (b) Lamellipodial region EGFP-VASP udtrykker cellens før og efter photobleaching. Inddrivelse af fluorescerende signal efter photobleaching inden for området markeret i lilla er visualiseret over tid. Pilen angiver spidsen af en microspike, beriget til VASP sandsynligvis på grund af den høje koncentration af actin filamenter polymerizing der19. (c) et eksempel på en FRAP opsving kurve som afledt af kvantificere fluorescerende intensiteten af photobleached lamellipodium (lilla omrids) i b. røde og grønne linjer til højre angiver henholdsvis immobile og mobile fraktioner. (d) A passer FRAP opsving kurve i c (venstre panel) og et eksempel på den beregningsmetode, der anvendes til at udlede halv restitutionstid (højre panel). (e) et eksempel på en FRAP opsving kurve afledt af gennemsnit fluorescens opsving kurver af 15 celler, med SEM barer angiver graden af variation inden for den stikprøve befolkning. (f) en curve fit afledt af gennemsnit FRAP opsving kurven passer til 15 celler (venstre panel) og et eksempel på den beregningsmetode, der anvendes til at udlede halv restitutionstid (højre panel). (g) Time-lapse paneler af fremspringende lamellipodium af en B16-F1 celle udtrykker EGFP-tagged β-actin før og efter blegning af en lamellipodial region som angivet, efterfulgt af fluorescens opsving i lamellipodium over tid. På den yderste højre panel, værdier målt for fremspring og retrograd afstande leveres (i orange og rød, henholdsvis). Beregninger under panelerne billedet afslører, hvordan summen af fremspring og retrograd afstande bruges til at udlede polymerisering hastighed af lamellipodial actin netværk. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> Figur 3: Photoactivation af PA-normal god landbrugspraksis-actin for monomer sporing i hele cellen. (en) A repræsentativt eksempel på en B16-F1 celle udtrykker PA-normal god landbrugspraksis-actin før udløser photoactivation i et cytosole region, som er angivet med den røde cirkel (PA). Forskelligt farvede konturer er mærket for at angive, hvilke regioner blev anset for fluorescens intensitet målinger over tid. (b) en illustration af den tidsmæssige fordeling af PA-normal god landbrugspraksis-actin følgende photoactivation. Bemærk den gradvise reduktion af fluorescens i photoactivated, cytosole region (rød cirkel), som photoactivated actin diffunderer fra det. På grund af deres diffusion front og montage i netværket, er photoactivated actin monomerer gradvist udvidet i lamellipodia (cyan region) og hele cytosol (forskellige farvekodede regioner) i et afhængig af afstand og tid mode. (c) repræsentative, tidsmæssige tilbagegang af fluorescens i photoactivated cytosole region (rød kontur i b). (d) tidsmæssige ændringer i fluorescens intensitet i regionen lamellipodial (cyan kontur i b). (e) kurver repræsentant af de tidsmæssige ændringer i fluorescens intensiteten af cytosole regioner (farvekodede i b) på grund af positionering i variabel afstand fra området af photoactivation. Bemærk hvordan halv-gange for at nå fluorescens plateau (angivet i forklaringen til højre) stige med afstanden i betragtning region til området af photoactivation, sandsynligvis korrelerede med den øgede gange nødvendigt for udbredelse af actin monomerer i den respektive region. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Vi beskriver hvordan mikro- og photomanipulation teknikker såsom FRAP og photoactivation aktiverer bestemmelse af motilitet parametre og spatiotemporelle dynamikken i proteiner inden for overflytning celler. Eksperimentelle udlæsninger omfatter subcellulært dynamics og omsætning af motilitet tilsynsmyndigheder eller de underliggende actin cytoskeleton.

Micromanipulation teknikker giver mulighed for analyse af morfogenetiske Dynamics og omsætning af Cytoskeletal regulatorer

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Phosphopeptid Analyse af gnaver epididymale Spermatozoer

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening at identificere Ubiquitin og ubiquitinlignende System Regulators Biologisk Pathways i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker til analyse af ekstracellulær Vesikler anvendelse af flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‹Å“Touch DNAÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢ Evidence

Forbedret Genetisk analyse af enkelte Menneske biopartikler Gendannede af forenklet Mikromanipulation fra Forensic &#39;Touch-DNA&#39; Evidence

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høj opløsning Imaging og analyse af de enkelte Astral mikrotubulusdynamik i Spirende Gær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel og effektiv Administration og visualisering af mikropartikler i kredsløbet af små fisk ved hjælp af nyre injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Anvendelser af Spatio-temporale kortlægning og partikel analyseteknikker til at kvantificere intracellulære Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...