Name: micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Wij zijn dankbaar aan de Duitse Research Foundation (DFG) voor financiële steun (grant Nr. RO2414/5-1 te KR).

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier bespreken we kritische stappen in de technieken beschreven in dit artikel, en hoe ze kunnen worden geoptimaliseerd voor toepassing in verschillende experimentele omstandigheden.
Microinjection is een methode die kan worden toegepast om te controleren in de cellen van de onmiddellijke gevolgen van de invoering van exogene eiwitten, remmers, of drugs. Het kan vooral nuttig zijn voor het bepalen van de functies van eiwitten in moeilijk te transfect celtypes of in situaties wanneer op lange termijn expressie is niet gewenst. Opgemerkt moet worden dat voortbestaan van bepaalde celtypen afhankelijk is van de extracellulaire matrix, die ze worden overgeënt op. Meest endotheel, epitheliale of fibroblast-achtige celtypes, zelfs kleine graag vis keratocytes (Zie Dang et al. 21 en Anderson en Cross22) kunnen met succes worden geïnjecteerd. Er zijn echter uitzonderingen, zoals B16-F1 cellen ontpit op laminin, en die vormen een uitstekende modelsysteem voor cel migratie, maar zijn niet compatibel met injectie op dit soort substraat om onbekende reden. Voor NIH3T3 fibroblast cellen uitvoeren we routinematig injecties op fibronectine substraat en extra photomanipulation technieken zoals FRAP (zelfs met photoactivation; B16-F1 cellen hier getoond) even goed kan worden uitgevoerd in deze fibroblasten (Zie bijvoorbeeld, Köstler et al. 3). het moet ook worden overwogen dat verschillende eiwitten, volgens hun functionele eigenschappen en de doelstellingen van het experiment, verschillende hoeveelheden tijd tot veranderingen, variërend van seconden tot uren kunnen duren. Een voordeel van de techniek is dat de dosis/concentratie van exogene agent nauwkeuriger op het niveau van de eencellige dan bijvoorbeeld, kan worden gecontroleerd, bij het gebruik van plasmiden transfectie. Bovendien, is fluorescerende tagging van een eiwit niet een noodzaak om te garanderen van haar aanwezigheid in de cel, die flexibiliteit toenemen kan als gelijktijdige meerkanaals visualisatie van andere fluorescently-gelabelde proteïnen vereist is. Microinjection kunnen bijzonder nuttig zijn voor het analyseren van de onmiddellijke gevolgen van specifieke proteïnen of eiwit mengsels voor dynamische veranderingen in de morfologie van de cel of het cytoskelet (bijvoorbeeld Dang et al. 21 voor een voorbeeld van onmiddellijke effecten op de migratie door de complexe Arp2/3-remmer Arpin). Een nadeel van de techniek is de invasiviteit, die kan leiden tot celbeschadiging of invloed van cel morfologie. Daarom is een belangrijke overweging bij het uitvoeren van de microinjections toezicht op de levensvatbaarheid van de cellen. De methode die hier wordt ingevoerd, is afhankelijk van manuele manipulatie. In omstandigheden getest zodat deze compatibel is met succesvolle injecties, zoals fibroblasten groeien op fibronectine substraat, staat de handleiding injectie protocol hier beschreven een in de omgeving van 100% slagingspercentage; Dit is essentieel bij het combineren van deze aanpak met verfijnde en tijdrovende follow-up experimenten met videomicroscopie of FRAP, zoals gepubliceerd eerder3. Dit sluit niet uit dat soms, afzonderlijke cellen zou kunnen lijden aan een gebeurtenis van microinjection, die veilig kan worden herkend door de abrupte veranderingen van contrast van zowel de celkern en het cytoplasma, gevolgd door cel rand retractie. Dergelijke zeldzame experimentele gevallen zijn uitgesloten en daarom niet beschouwd voor verdere analyses.
Een half-automatische aanpak wordt echter ook vaak gebruikt, bijvoorbeeld met snelle (< 300 ms) machine-gecontroleerde naald verlagen samenvallen met de verhoging van de druk van de injectie, zodat de naald moet alleen worden gepositioneerd boven elke cel voorafgaand aan de respectieve injectie. Het slagingspercentage van half-automatische injecties is per definitie lager is dan de manuele aanpak die hierboven beschreven, gewoon omdat het is geoptimaliseerd voor snelheid, gevolgd door analyse van meerdere cellen die met succes deze behandeling overleefde; dus afhankelijk het niet is van succesvolle injectie van een afzonderlijke cel. Dus, in tegenstelling tot de eencellige analyse, half-automatische injecties zijn beter geschikt voor het analyseren van de gevolgen van de injectie van meerdere honderd cellen, bijvoorbeeld door videomicroscopie bij lage vergroting of op cel fixatie en kleuring. Los van de gedetailleerde benadering werkzaam, microinjection vormt geen een eindpunt assay, maar kan worden gecombineerd met een scala aan technieken, waaronder FRAP of photoactivation3.
Bij het bepalen van de Verwerkingsfrequentie van de eiwitten door FRAP, de intensiteit van de laser moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de setup en imaging voorwaarden van Microscoop (vergroting, doelstellingen, enz., evenals het celtype, structuur en fluorescente proteïne voor photobleaching). Merk op dat op optimale laser kracht, efficiënt bleken wordt gecombineerd met de minste mogelijke photodamage, om krimp te voorkomen of tot intrekking van de structuur onder de analyse (bijvoorbeeld lamellipodia of filopodia) of zelfs schade op cellulair niveau te voltooien. In het ideale geval moet ten minste 70-80% van het bleken van efficiëntie worden bereikt, hoewel volledige bleken gehinderd zou kan worden door zeer snel omzet van het eiwit, in dat geval iets meer dan 50% ook acceptabel wellicht. Optimale bleken power voor een bepaalde structuur en fluorescente kleurstof moet experimenteel worden getest, vanaf een lage laser macht gevolgd door de geleidelijke verhoging. Natuurlijk, elke fluorescente kleurstof kan per definitie worden gebleekt met laserlicht dicht bij het hoogtepunt van excitatie (488 nm voor veelgebruikte groene kleurstoffen zoals FITC of EGFP). Echter lasers met kortere golflengtes, zoals in de buurt van-UV lasers, leveren hogere machten en kunnen dus ook worden gebruikt voor het efficiënt bleken van gebruikte kleurstoffen. Routinematig hanteren wij een 405 nm diodelaser (120 mW) voor het bleken van EGFP zowel rode fluorescente kleurstoffen (zoals mCherry), zij het met iets lagere efficiëntie in het geval van de laatste (gegevens niet worden weergegeven). Aangezien de 405 nm-diode kan ook worden gebruikt voor photoactivation van PA-GFP (zie hieronder), schenkt het dit systeem met maximale flexibiliteit.
Voor de B16-F1 cel structuren en fluorescente proteïnen photobleached hier, werden 405 nm-laser bevoegdheden tussen 65-100 mW toegepast. Wanneer het analyseren van een photobleached-regio, is het belangrijk om te overwegen of de gegeven structuur behouden in haar oorspronkelijke vorm over de analyse periode blijft. Bijvoorbeeld, bij het analyseren van omzet van eiwitten op lamellipodia tips, moet worden gewaakt of de kromming van de lamellipodia is ingrijpend veranderd na verloop van tijd, zoals veranderingen in kromming zou kunnen tot onnauwkeurige resultaten leiden als de regio/contour geanalyseerd niet volledig omvatten het geheel van de structuur in elk gemeten frame. Bovendien moet opgemerkt worden dat bundels ingebed in lamellipodia, zoals microspikes, afwijkingen in de intensiteit van de fluorescentie kunnen veroorzaken. Zoals geïllustreerd in Figuur 2b (witte pijl in 9 s tijdsbestek), een microspike-achtige structuur is gelegen naast de gemeten photobleached regio, maar blijft buiten het tijdens de gehele duur van de meting, en dus niet leidt tot een onnauwkeurigheid. Voor analyse van eiwit omzet zijn belangrijke overwegingen bij het selecteren van de locatie en grootte van regio's geanalyseerd dat hun fluorescentie na verloop van tijd moet niet worden aanzienlijk beïnvloed door veranderingen in de morfologie van de cel of factoren anders dan hard om te voorkomen dat overname photobleaching. Bijvoorbeeld, moeten structuren bieden belangrijke kwantitatieve bijdrage aan de geanalyseerde structuur niet verplaatsen uit de gemeten regio tijdens de analyse; Bovendien moeten ongerelateerde, fluorescerend entiteiten zoals vesiculaire structuren die het aantrekken van het eiwit niet invoeren van het veld van belang tijdens de analyse. Voor de bepaling van het tarief van lamellipodial actine polymerisatie, moet worden gezorgd dat geen oprollen benodigde of ruffling (dat wil zeggen, omhoog vouwen) lamellipodia worden geanalyseerd, aangezien dit de nauwkeurigheid van de resultaten sterk beïnvloedt. Daarnaast retractie van lamellipodial regio's kan worden weergegeven als snel naar achteren translocatie, potentieel leidt tot overschatting van de tarieven van lamellipodial actine polymerisatie. Een extra overweging is de afstand van intracellulaire normalisatie regio's (genomen als referentie posities voor de correctie van overname photobleaching) van de huidige positie van photobleaching, die moet groot genoeg zijn om directe beïnvloeden door het photobleached-gebied.
Bij het opzetten van optimale voorwaarden voor de photoactivation van PA-GFP-gelabeld constructies, moet worden gezorgd om te voorkomen dat onmiddellijke bleken tijdens photoactivation. In ons werk, de beste resultaten werden verkregen met laser bevoegdheden 5 - 10 keer lager dan normaal werknemer voor het bleken van EGFP. Voor image aquisition van photoactivated moleculen, moeten belichtingstijd tijdsinterval tussen frames worden geoptimaliseerd door gezien de omvang van de regio's en structuren als photoactivated en geanalyseerd, evenals de potentiële mobiliteit van photoactivated eiwitten naar andere subcellular locaties. Wat betreft alle soorten fluorescentie imaging is onderhoud van de levensvatbaarheid van de cellen cruciaal voor het verkrijgen van fysiologisch relevante resultaten.
In principe, groen-naar-rood photoconversion van fluorescente proteïnen zoals mEos of Dronpa varianten12 vormt een even krachtige methode van volgende dynamiek en omzet van subcellular structuren zoals de lamellipodium (Zie bijvoorbeeld Burnette et al. 23). het voordeel van de laatste methode in tegenstelling tot PA-GFP zou de mogelijkheid te volgen van eiwit dynamics vóór en na de conversie met twee verschillende kleuren, zonder de noodzaak om mede express een extra rode fluorescerende eiwit. Echter in onze voorbereidende experimenten was de mate van verandering van contrast en intensiteit van fluorescent signaal bereikt op de photoactivation van PA-GFP groter in vergelijking met photoconverted de sondes, misschien als gevolg van de superieure spectrale kenmerken van groen versus rood fluorescerende sondes (gegevens niet worden weergegeven). In ieder geval zijn gedetailleerde studies over het actine-filament omzet in cel-rand uitsteeksels zoals lamellipodia of Vaccinia virus-geïnduceerde actine staarten tot nu toe alleen gepubliceerd met behulp van de PA-GFP derivaten5,6,24.
Bij het overwegen welke cel regio te analyseren na photoactivation, verschillende factoren moeten rekening worden gehouden, die worden besproken met behulp van dit specifieke voorbeeld (opneming van actine monomeren aan de rand van de cel na activatie in het cytosol), maar zeker kunnen worden geëxtrapoleerd naar verschillende analoog wetenschappelijke problemen. Eerst meten wanneer het tarief van lamellipodial opneming van cytosolically photoactivated eiwitten, bijvoorbeeld in verschillende experimentele omstandigheden (zoals in Dimchev et al. 6), maten van cytosolische regio's en hun afstanden naar lamellipodial randen vergelijkbaar moeten zijn tussen experimentele groepen. Het is ook belangrijk om te overwegen dat wanneer photoactivating cytosolische regio's, de dikte van de cel groter in standpunten dichter aan de kern is. Activeren van dikkere cellulaire gebieden kan leiden tot hogere bedragen van geactiveerde eiwitten, gezien het feit dat de verdeling van de proteïne worden geactiveerd wordt homogeen verspreid in het cytosol. Ten slotte, uitdrukking niveaus van de proteïne worden geactiveerd kunnen ongetwijfeld zeer variabel in afzonderlijke cellen. Als gevolg van al deze overwegingen van variabiliteit is het van cruciaal belang om te vergelijken opneming niveaus van cytosolically geactiveerd eiwitten elders in de cel ten opzichte van de totale fluorescentie verkregen na activatie in de specifieke regio's.
Wij hebben beschreven hoe microinjection kan worden gebruikt als een hulpmiddel voor het onderzoeken van de effecten van eiwitten op cel morfologie en hebben dit geïllustreerd door aan te tonen de potente inductie van lamellipodial structuren in de cellen van de fibroblast microinjected met NIH3T3 de kleine GTPase Rac1. Wij hebben deze techniek te mengen met Arp2/3 functie in de cellen met het domein van de C-terminal WCA voor litteken/WAVE3microinjected eerder toegepast. Verschillende parameters in de microinjected cellen kunnen door andere testen, zoals FRAP of photoactivation worden geanalyseerd. Wij hebben beschreven hoe FRAP en photoactivation kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van de dynamiek van de subcellular en mobiliteit van actine monomeren. FRAP is gebruikt door onze fractie eerder5 te onderzoeken van de omzet van eiwitten aan lamellipodia, zoals VASP Abi, cortactin, cofilin, lokaliseren en eiwit aftopping, of voor het ophelderen van de omzet van componenten in focal verklevingen in de aanwezigheid en de afwezigheid van Rac signalering4. Bovendien meten van actine polymerisatie tarieven kan worden bereikt door photobleaching EGFP-gelabeld β-actine5, maar alternatieve methoden bestaan. Fluorescerende inhomogeneities bijhouden, zoals gezien door de levende cel imaging-compatibele sondes labeling van cellulaire actine-filamenten, zoals Lifeact25, ook kan werknemer6,26. Het voordeel hier is dat de overexpressie van β-actine worden, vermeden kan die in staat van toenemende cel rand uitsteeksel en migratie is en dus potentieel interfereert met de specifieke bepaling of experimentele vraag (Zie bijvoorbeeld Kage et al. 26; Peckham et al. 27). een duidelijke nadeel van de Lifeact sonde vormt echter de snelle aan/uit de kinetiek van de binding met door samensmelting van filamenten actine, zodat alleen op de omzet van de sonde, bleken van actine-filament structuren gelabeld door Lifeact in cellen informatie maar niet de omzet van de actine-filamenten, waarnaar het bindt25. Het volgen van fluorescentie inhomogeneities dienst eerder6,26 biedt een praktisch compromis, veel lijkt op het gebruikte volgen van fluorescentie spikkels opgenomen in draadvormige cytoskeletal structuren (Zie bijvoorbeeld zalm en Waterman28), maar kan niet zo ongecompliceerd om te gebruiken en zo exact FRAP van EGFP-gelabeld F-actine structuren. Photoactivation is voor het inschatten van de tarieven van monomeer actine opneming in uitstekende lamellipodia, evenals de mobiliteit in het cytosol, in het kader van experimenteel tuned cytosolische F-actine niveaus6door ons toegepast. De techniek is handig als behandeling van mobiliteit en distributie van eiwitten afkomstig van relatief grote gebieden, zoals cytosolische regio's. Behandeling van de verdeling van de eiwitten echter afgeleid van relatief kleine photoactivated structuren; bijvoorbeeld groei kegels misschien wel uitdagend vanwege de lage aantallen van fluorescerende moleculen geactiveerd, zwakke signalen, en dus gebrek aan gevoeligheid. Mogelijke alternatieve technieken om photoactivation of photoconversion voor fluorescentie (zie hierboven) kunnen omvatten inverse FRAP, die op photobleaching de gehele cel behalve de ROI steunt, gevolgd door het bijhouden van de mobiliteit van fluorescerende moleculen weg van deze regio. De techniek vereist geen overexpressing photoactivatable versies van eiwitten, maar altijd blootstelling aan een ongebruikelijk hoge dosis van laser macht, mogelijk veroorzaakt ongewenste bijwerkingen zoals photodamage zal betrekken.
Duidelijk, photoactivation en FRAP kan geen onderscheid maken of eiwitten als monomeren, dimeren of zelfs kleine oligomeren evolueren, en of ze bewegen in combinatie met extra bindende partners. Dergelijke informatie kan worden verkregen in plaats daarvan fluorescentie correlatie spectroscopie technieken29 of, subsidiair, FLIM-FRET30. FRAP en photoactivation vormen echter eenvoudig benaderingen om te beoordelen direct de dynamiek van de lokale en globale eiwitten in cellen, ongeacht de proteïne van belang, subcellular locatie of celtype studeerde.

Toezicht op de spatio dynamiek van eiwitten en andere moleculen in levende cellen is uitgegroeid tot een essentieel instrument in vele gebieden van cel- en moleculaire biologie. Geavanceerde fluorescentie microscopie technieken waaronder fluorescentie resonance energy transfer (FRET) en FRET-fluorescentie levensduur imaging (FRET-FLIM) of FRAP, fluorescentie verlies in photobleaching (FLIP) en photoactivation, evenals vele anderen toestaan voor de tijdelijke en ruimtelijke bijhouden eiwit-eiwitinteractie, conformationele veranderingen, evenals het bepalen van de kinetiek van diffusie en localisatie van verschillende proteïnen in de cel1,2. FRAP en photoactivation technieken, in het bijzonder zijn breed toepasbaar is voor de behandeling van de regelgevers van de actine cytoskelet en cel migratie. Deze technieken kunnen worden toegepast, alleen of in combinatie met extra micromanipulation technieken zoals microinjection3, en betrekken de expressie van fluorescently gelabelde proteïnen. Zij de schatting van de kinetiek van eiwit vereniging actine-rijke structuren die betrokken zijn bij cel migratie, zoals filopodia of lamellipodia, de omzet van eiwitten in de concentratiesectoren van verklevingen4, toestaan of vertakte actine netwerken5. Ze kunnen ook de bepaling van lamellipodial actine polymerisatie tarieven, de beoordeling van de spreiding van de monomere actine binnen het cytosol, het tarief van subcellular actine monomeer translocatie aan het actine-filamenten in uitstekende actinemonomeren lamellipodia6, en andere parameters.
FRAP is een methode voor het visualiseren en kwantificeren van de mobiliteit van eiwitten binnen een levende cel, oorspronkelijk ontwikkeld in de jaren 1970 door Axelrod7. Een gebied van belang (ROI) in een cel, gevuld met fluorescently gelabelde proteïnen, Transient blootgesteld aan een laser van hoge intensiteit, voldoende te veroorzaken bleken van de fluorophore moleculen aanwezig in dit gebied gedurende een bepaalde korte periode van tijd. De ongebleekt, fluorescently eiwitten gelegen buiten de ROI tijdens het bleken, het label zal diffuse en infiltreren de gebleekte regio afhankelijk van hun Spatio dynamiek, veroorzaakt door de verplaatsing van photobleached moleculen na verloop van tijd. Het percentage fluorescentie nuttige gebleekte regio is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder de grootte en de snelheid van diffusie van een bepaalde molecule, en natuurlijk het percentage van de omzet binnen de vermeende bijbehorende gebleekte structuur. Dus, oplosbare eiwitten zal het herstel van de fluorescentie binnen de gebleekte ROI snel door diffusie, terwijl eiwitten strak gekoppeld structuren, zoals focal verklevingen bemiddelen, zal hebben langere tijden van de omzet, net als hun fluorescentie-herstel hangen van beide op de verspreiding van de oplosbare fractie van de eiwitten en dissociatie-vereniging kinetiek van de structuur-geassocieerde breuk. Fluorescentie herstel is meestal verworven en gekwantificeerd tot het oorspronkelijke niveau van pre bleekmiddel intensiteit van de fluorescentie is bereikt. Dit treedt echter niet op als een onderdeel van de eerste fluorescentie intensiteit behoort tot de zogenaamde immobiel breuk, die niet kan worden aangevuld door diffusie of aanvullen is in een zeer traag tempo in vergelijking met de meeste moleculen bestaande uit de mobiele breuk. Om te bepalen van het percentage eiwit omzet, worden FRAP curven gegenereerd, die de mate van herstel van de fluorescentie na verloop van tijd. Uit deze herstel krommen, kunnen gemiddelde half-tijden van eiwit herstel worden berekend. Door het creëren van kromme vlagen van de gemiddelde FRAP-gegevens, en vandaar wiskundige analyses, is het ook mogelijk afleiden of het tarief van de gemiddelde omzet van de mobiele breuk vormt een vierkleurendruk van een homogene bevolking van moleculen, of dat het is samengesteld uit twee of meer subpopulaties van moleculen draaien op differentiële tarieven. Naast schatten eiwit omzet tarieven door kwantitatieve benaderingen, kan het bijhouden van het herstel van de photobleached regio's in lamellipodia ook zorgen voor een nauwkeurige kwantificering van lamellipodial motiliteit parameters zoals retrograde stroom, uitsteeksel, en actine polymerisatie tarieven. FRAP vormt dus, een veelzijdig hulpmiddel om te worden toegepast voor de beoordeling van de verschillende parameters binnen de structuren van levende cellen.
Photoactivation is een methode die wordt gebruikt voor het bijhouden van de verspreiding en de mobiliteit van proteïnen of moleculen die afkomstig zijn van een aangewezen cellulaire locatie. De techniek maakt gebruik van, bijvoorbeeld, een variant van wild-type groen fluorescente proteïne (GFP), oorspronkelijk is ontwikkeld door Patterson en Lippincott-Schwartz8, die is gemuteerd in een manier waarmee de fluorescentie wordt sterk verhoogd bij blootstelling aan ultraviolet (UV)-licht (ongeveer 400 nm; hier, 405 nm). Zoals beschreven door Patterson et al.., wild-type GFP chromophores bestaan als een gemengde bevolking van neutrale fenolen en anionogene phenolates, die een grote extinctie piek op circa 397 produceren nm en een kleine een op 475 nm, respectievelijk. Na bestraling van het eiwit met UV-licht ondergaat de bevolking photoconversion, verschuift naar de anionische vorm. Als opgewonden door 488 nm, het eiwit photoconverted/photoactivated vertoont een stijging van 3-voudig in fluorescentie, onvoldoende in de praktijk voor onderscheid te maken tussen geactiveerd en niet-GFP als gevolg van de hoge intrinsieke achtergrond fluorescentie geactiveerde. Echter, een afname van de achtergrond intensiteit is bereikt door de invoering van een één aminozuur-mutatie in het GFP-reeks (histidine substitutie op positie 203). De resulterende T203H mutant, ook bekend als photoactivatable-GFP (PA-GFP) wordt gekenmerkt door een aanzienlijke vermindering in de absorptie van de kleine piek, die na bestraling met UV-licht bijna 100-fold wordt verhoogd wanneer vervolgens opgewonden door licht van 488 nm. Vandaar, overexpressie van PA-GFP-gelabelde proteïnen is een veel gebruikte aanpak, waarmee de bepaling van de verspreiding en beweeglijkheid van moleculen binnen de cellen. Wij hebben eerder toegepast actine PA-GFP-gelabeld om te bepalen van het tempo van de dispersie van actine monomeren uit de buurt van cytosolische regio's, waardoor niet alleen de exploratie van hun mobiliteit binnen het cytosol, maar ook hun bijmengingsgehalte in de uitstekende lamellipodial actine netwerk6. Meer recente literatuur beschrijft ook roman, foto-cabriolet eiwitten die kunnen in principe worden gebruikt op een soortgelijke manier, maar het potentiële voordeel te zichtbaar al vóór de foto-conversie herbergen. Voorbeelden voor deze groep van fluorescente proteïnen zijn Dendra2 en mEos29,10,11,12.
In dit artikel leggen we uit de methodologie van microinjecting cellen met eiwitten. Verder leggen wij uit hoe deze techniek kan worden gecombineerd met FRAP, door photobleaching eiwitten die betrokken zijn in de actine cytoskelet verordening en motiliteit, en hoe FRAP krommen en halftijds van terugwinning van mobiele breuken kunnen worden afgeleid. Daarnaast bieden wij een voorbeeld van hoe de FRAP-techniek kan worden gebruikt om te bepalen van actine polymerisatie tarieven van lamellipodial netwerken. We bieden ook instructies en tips over hoe om uit te voeren van de experimenten van de photoactivation, die kunnen worden gebruikt om te bepalen van cytosolische mobiliteit van monomeer actine en tarieven van actine opneming in lamellipodia. Deze technieken, natuurlijk, zijn niet alleen beperkt tot het bijhouden van actine cytoskelet onderdelen, maar op potentieel vereist gematigde aanpassing of optimalisatie, het kunnen worden alom toegepast op andere celtypes of te onderzoeken van verschillende eiwitten, structuren, en parameters.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

Behandeling van de spatio dynamiek van eiwitten kan onthullen hun functionele belang in verschillende contexten. In dit artikel is het besproken hoe fluorescerende herstel na photobleaching (FRAP) en photoactivation technieken kan worden gebruikt voor het bestuderen van de spatio dynamiek van eiwitten in subcellular locaties. Ook laten we zien hoe deze technieken in staat stellen eenvoudige bepaling van verschillende parameters die zijn gekoppeld aan cytoskeletal regelgeving en cel beweeglijkheid van actine. Bovendien, de protocollen van cellen wordt bovendien beschreven als een alternatieve behandeling (potentieel voorafgaand aan of als aanvulling op de bovengenoemde photomanipulation technieken) trigger momentane effecten van translocated eiwitten op cel morfologie en functie. Micromanipulation zoals eiwit injectie of lokale toepassing van plasmamembraan-permeabele drugs of cytoskeletal-remmers kan dienen als krachtige tool om de onmiddellijke gevolgen van een bepaalde behandeling op cel gedrag op de eencellige en subcellular opnemen niveau. Dit wordt geïllustreerd hier door onmiddellijke inductie van lamellipodial cel rand uitsteeksel door de injectie van recombinante Rac1 eiwit, zoals een kwart eeuw geleden opgericht. Daarnaast bieden we een protocol voor het bepalen van de omzet van verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP)-VASP, een actine-filament polymerase prominent accumuleren op lamellipodial toppen van B16-F1 cellen, dienst FRAP en inclusief gekoppelde gegevens analyse en curve-fitting. Wij presenteren ook richtlijnen voor het inschatten van de tarieven van lamellipodial actine netwerk polymerisatie, zoals wordt geïllustreerd door cellen uiten van EGFP-gelabeld β-actine. Ten slotte, instructies worden gegeven voor het onderzoeken van de tarieven van actine monomeer mobiliteit binnen het cytoplasma van de cel, gevolgd door opneming van de actine op sites van snelle gloeidraad vergadering, zoals de toppen van de uitstekende lamellipodia, met behulp van photoactivation benaderingen. Geen van deze protocollen is beperkt tot onderdelen of toezichthouders van het cytoskelet actine, maar kan gemakkelijk worden uitgebreid om te verkennen in analoge mode de spatio dynamiek en functie van eiwitten in diverse verschillende subcellular structuren of functionele contexten.

Figuur 1 g h Toon fase contrast beelden van een NIH3T3 fibroblast cel voorafgaande en 10 min na microinjection van Rac1, die een kleine Rho-familie GTPase staat inducerende lamellipodia vorming door zijn interactie met de golf complex. De cel is het eerste gevisualiseerd voordat de microinjection (Figuur 1g), om de levensvatbaarheid en de morfologie, bijvoorbeeld, het ontbreken van lamellipodia te bevestigen. Op 10 min na microinjection, heeft de cel zijn morfologie, die wordt verwacht van deze behandeling, en een succesvolle injectie (Figuur 1h) geeft duidelijk veranderd.
Voor eenvoud en duidelijkheid voorzien we volgende voorbeeldige resultaten FRAP en photoactivation analyse in cellen, die hebben niet verder microinjected.
Analyse van de omzet van EGFP-gelabeld VASP aan het uiteinde van de lamellipodium wordt weergegeven in Figuur 2a-f. Merk op dat VASP Daarnaast richt zich naar de ontluikende en focale verklevingen, kleine en langwerpig stippen in de cel interieur18,19. De intensiteit van de fluorescentie van een lamellipodial-regio met een duidelijk VASP accumulatie op het puntje was gebleekt en gemeten voor elke termijn, door het volgen van de contour van de ROI vóór, tijdens en na het ontkleuren aangebracht zoals de lamellipodium vooruit steekt. Zoals gebleekte EGFP-VASP eiwitten worden gerecycled door niet-gebleekt moleculen op deze sites, wordt geleidelijk herstel van de fluorescentie waargenomen (Figuur 2b). De FRAP herstel curve verkregen op deze manier en op de intensiteit van de pre bleekmiddel (uitgedrukt in 1) genormaliseerd kan worden gezien in Figuur 2c. Photobleaching efficiëntie kan variëren en was ongeveer 20% van de waarde vóór het bleken in dit voorbeeld, zoals bepaald door de waarde bij t0 (het eerste frame na photobleaching). De verhoging van fluorescentie bereikt een plateau in het voorbeeld op ongeveer 80% van de fluorescentie voordat bleken. In een statische-structuurdiagram in de tijdsverloop van het experiment, zoals een focale adhesie, het verschil tussen de intensiteit van de pre bleekmiddel en de fluorescentie plateau bereikt nadat herstel is gedefinieerd als het immobiel breuk (IF, rode pijl in Figuur 2 c, e), terwijl de hoeveelheid fluorescentie teruggevonden tussen het moment van bleken en volledige herstel wordt gedefinieerd als de mobiele breuk (groene pijl in Figuur 2c, e). Merk op dat in een dynamisch veranderende structuur zoals de lamellipodium tip hier geanalyseerd, de omvang van de IF misschien niet alleen immobiel moleculen vertegenwoordigen, maar ook worden afgeleid uit een vermindering van de snelheid van het uitsteeksel, genoemd EGFP-VASP intensiteit is afhankelijk van dit met de parameter18. Voor het berekenen van de helft van de tijd van herstel, ontstond een fit curve op Sigma perceel (Figuur 2d). In dit geval de waarde van de parameter van de "b" is onttrokken oplossen van vergelijking 2 is gelijk aan 0.0754, welke wanneer toegepast op de logaritmische functie (vergelijking 4) resultaten in een geschatte halftijds van terugwinning van 9.19 s (Figuur 2d , uiterst rechts paneel), die is relatief snel in deze bepaalde cel ten opzichte van het gemiddelde gepubliceerd eerder5. Opgemerkt moet worden dat half-hersteltijden soms aanzienlijk van cel naar cel binnen dezelfde populatie verschillen kunnen. Daarom, voor het verkrijgen van representatieve resultaten, raadzaam deze parameter bepalen door een gemiddelde te nemen van ten minste 15-20 cellen. Ter illustratie van de mate van variantie, rekenkundig middelen van EGFP-VASP herstel gemiddeld uit 15 cellen voor elk tijdstip werden gegenereerd (Figuur 2e), en gemiddelde curve past gemaakt en weergegeven in een analoog mode (Figuur 2 f).
Het tarief van de polymerisatie van het lamellipodial actine netwerk bestaat uit de som van voorwaartse netwerk uitsteeksel en retrograde stroom. FRAP kan worden toegepast voor het meten van de snelheid van de polymerisatie actine door transfecting cellen (in dit geval B16-F1) met β-actine EGFP-gelabeld en photobleaching een vooruitstekende lamellipodial regio (Figuur 2g). Voor analyse van lamellipodial actine netwerk polymerisatie, wordt het herstel van de fluorescentie bij het bleken van EGFP-gelabeld β-actine beoordeeld na verloop van tijd. Als de polymerisatie van actine monomeren vordert op de prikkeldraad uiteinden van lamellipodial actine-filamenten (die alle verwijzen naar de voorste20), is het netwerk voortdurend translocated naar achteren en naar voren, vordert de tarieven die gemakkelijk kunnen worden verkregen via gepolariseerde herstel van fluorescentie op photobleaching. Fluorescentie herstel van de lamellipodium is voltooid zodra de gebleekte zone heeft bereikt de overgangszone tussen het achterste deel van de lamellipodium en de lamel, die wordt gekenmerkt door een lagere dichtheid van meer horizontaal gerangschikt gloeidraad bundels veel langzamer dan wat is waargenomen in de lamellipodium draaien. Zoals geïllustreerd in Figuur 2g, kan fluorescentie herstel worden gevisualiseerd als een lijn die horizontaal ten opzichte van de rand en stroomt terug naar de lamel, die het mogelijk het meten van de afstanden van uitsteeksel en retrograde stroom maakt (individueel vertegenwoordigd in het rechtse paneel van Figuur 2g als oranje en rode tweepuntige pijlen, respectievelijk).
Wij hebben ook photoactivation in B16-F1 cellen transfected met PA-GFP-actine om bij te houden van de mobiliteit van actine monomeren binnen het cytosol en het tempo van hun integratie binnen het uitstekende lamellipodia toegepast. Zoals geïllustreerd in Figuur 3, ondera, b, een cytosolische regio was photoactivated door blootstelling aan een 405 nm laser, terwijl beelden werden verworven op de GFP kanaal elke 1.5 s voor het visualiseren van de verdeling van GFP-gelabeld, photoactivated actine. Photoactivated GFP-actine kan worden gezien uit de cytosolische regio in Figuur 3bverspreiden. Het tempo van de daling van de intensiteit van de fluorescentie photoactivated cytosolische regio wordt vertegenwoordigd als het percentage van de oorspronkelijke intensiteit op t0 (eerste frame na photoactivation; Figuur 3 c). Photoactivated actine integreert ook op de toppen van de lamellipodia, waar nieuwe actine monomeren worden toegevoegd aan de groeiende prikkeldraad uiteinden van het grondvlak van de actine-filamenten tijdens uitsteeksel. Om een schatting van de mate van integratie van de lamellipodial, we de intensiteit van de fluorescentie gemeten na verloop van tijd een tweedimensionale contour/regio ongeveer 5 µm in breedte en 1 µm in hoogte; de regio was voortdurend opnieuw gepositioneerd op het puntje van de lamellipodium als het staken. Actin opneming was vertegenwoordigd als het percentage van de intensiteit van de fluorescentie van de regio photoactivated cytosolische op t0 (Figuur 3d). Zoals rek van actine-filamenten vorderde, werden nieuwe actine monomeren opgenomen lamellipodial vooraan. Een fractie van deze actine monomeren was stochastically afgeleid van het cytosolische zwembad waar monomeren photoactivated waren. Dit resulteert in de snelle verhoging van fluorescentie in lamellipodia in de eerste 20 s na photoactivation. Als nieuwe monomeren worden toegevoegd aan de voorkant van de lamellipodial, eerder opgenomen actine monomeren stroom met een door samensmelting van filamenten richting de lamel door retrograde stroom. Na verloop van tijd de ROI is volledig gevuld met fluorescerende monomeren en een plateau in fluorescentie (Figuur 3d) is bereikt. Een geleidelijke daling van de fluorescentie wordt vervolgens waargenomen wanneer, na verspreiding van photoactivated monomeren in de cel, worden niet-photoactivated actine monomeren steeds opnieuw toegevoegd aan de voorkant van de lamellipodial. Deze afname van de fluorescentie vindt een nieuwe plateau, die zal worden bereikt, zodra een evenwicht in de gehele cel tussen photoactivated en niet-photoactivated monomeren is bereikt (gegevens niet worden weergegeven).
De mobiliteit van actine monomeren in het cytosol werd afgeleid door het meten van de intensiteit van de fluorescentie in regio's van gelijke grootte geplaatst, distally van de photoactivated-regio (wordt geïllustreerd op afbeelding 3een kleurcode regio's met het label R1-R5). Zoals geïllustreerd in Figuur 3e, fluorescentie intensiteit in elk van deze gebieden geleidelijk afneemt weg van de cytosolically photoactivated de regio, als het deel van photoactivated actine monomeren wordt steeds meer verdund met niet-geactiveerde (dat wil zeggen, niet-belichting fluorescerende) monomeren. Bovendien, het hoogtepunt van de fluorescentie later is bereikt: de meer afgelegen de gemeten regio ligt uit de photoactivated regio, des te langer de tijd die nodig is voor actine monomeren te verspreiden in deze gebieden. Een representatieve waarde voor de mate van actine monomeer infiltratie in elke regio kan worden afgeleid door de helft van de tijd voor het bereiken van het plateau van de fluorescentie te kwantificeren. De meer afgelegen regio, des te langer het duurt voor de photoactivated actine te verspreiden in het, en dus meer tijd nodig is voor het fluorescerende plateau te bereiken, wat uiteindelijk leidt tot een hogere waarde van de t1/2 (Figuur 3e).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> Figuur 1 : Imaging kamer vergadering en microinjection procedure. (een) Imaging kamer onderdelen. (b) siliconen vet is zorgvuldig gesmeerd rond de opening van een kunststof sealer. (c) het dekglaasje aan is geplaatst met de cel-zijde naar boven in het midden van de beeldvorming kamer openen. (d) een veilige zegel wordt vastgesteld door de positionering van de kunststof sealer bovenop het dekglaasje aan en door aanscherping van de kant klemmen. (e) microscopie medium is afgepipetteerde in de sleuf van de kamer. (f) de imaging kamer is gepositioneerd in het werkgebied van de Microscoop, warmte detector en elektroden zijn gekoppeld aan een eenheid van de verwarming vooraf ingesteld op 37 ° C en cellen aan te passen voor minstens 30 min voordat microscopie wordt gestart zijn toegestaan. In dit voorbeeld de Microscoop fase is ook uitgerust met een micromanipulator voor het uitvoeren van microinjections en de microinjection naald wordt ondergedompeld in het medium die betrekking hebben op de cellaag in de beeldvorming zaal. (g) een NIH3T3 fibroblast cel is vóór microinjection gevisualiseerd door fase contrast microscopie. Het Rode Kruis in het compartiment van de perinuclear geeft de locatie van het toekomstige microinjection, hetgeen overeenkomt met een hoge cytoplasmatische regio als gevolg van de nabijheid van de omvangrijke kern. (h) 10 min na microinjection met Rac1, de cel reageert door prominente vorming van lamellipodia langs de rand van de gehele cel (aangeduid door groene pijlen). <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> Figuur 2: FRAP kunt bepalen van de tarieven van eiwit omzet of lamellipodial actine polymerisatie. (een) representatief voorbeeld van B16-F1 cel EGFP-VASP uiten voordat photobleaching een lamellipodial regio zoals aangegeven. Verschillend gekleurde contouren/vormen worden aangeduid om aan te geven welke regio werden geacht voor fluorescentie intensiteit metingen na verloop van tijd. Opmerking de rode omtrek gemarkeerd met een uitroepteken, waarmee een cytosolische regio geplaatst in een omgeving met meerdere blaasjes en cel oppervlakte ruches labels. Dynamische gebieden zoals dit moeten worden vermeden voor het selecteren van de regio's van de fluorescentie verwijzing, zoals ze worden gekenmerkt door sterke kortetermijnfluctuaties van fluorescentie, mogelijk veroorzaakt door onnauwkeurige resultaten. (b) Lamellipodial regio van de EGFP-VASP waarin cel vóór en na photobleaching. Het herstel van fluorescent signaal nadat photobleaching binnen de regio gemarkeerd in paars is gevisualiseerd na verloop van tijd. Pijl geeft aan dat het puntje van een microspike, verrijkt voor VASP waarschijnlijk te wijten aan de hoge dichtheid van actine-filamenten actinemonomeren er19. (c) een voorbeeld van een FRAP herstel curve als afgeleid van het kwantificeren van de fluorescerende intensiteit van de photobleached lamellipodium (paarse contour) in b. rode en groene regels aan de rechterkant geven aan, respectievelijk, immobiel en mobiele breuken. (d) een passen van de FRAP herstel curve in c (linkerdeel) en een voorbeeld van de berekeningsmethode gebruikt voor het afleiden van de hersteltijd voor de helft (rechtervenster). (e) een voorbeeld van een FRAP-herstel kromme afgeleid van de fluorescentie herstel curven van 15 cellen, gemiddeld met SEM balken geven de mate van variabiliteit in de steekproef bevolking. (f) een bocht pasvorm afgeleid van gemiddeld de FRAP herstel kromme vlagen van 15 cellen (linkerdeel) en een voorbeeld van de berekeningsmethode gebruikt voor het afleiden van de hersteltijd voor de helft (rechtervenster). (g) Time-lapse panelen van het uitstekende lamellipodium van een cel van de B16-F1 uiting van EGFP-gelabeld β-actine vóór en na het bleken van een regio van de lamellipodial zoals aangegeven, gevolgd door fluorescentie herstel in de lamellipodium na verloop van tijd. Op het rechtse paneel, gemeten waarden voor uitsteeksel en retrograde afstanden worden geleverd (in oranje en rood, respectievelijk). Berekeningen onder de afbeelding panelen onthullen hoe de som van het uitsteeksel en retrograde afstanden worden gebruikt voor het afleiden van de polymerisatie tarief van het actine-netwerk van lamellipodial. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> Figuur 3: Photoactivation van PA-GFP-actine voor monomeer bijhouden in de cel. (een) A representatief voorbeeld van een cel van de B16-F1 PA-GFP-actine uiten voordat triggering van photoactivation in een cytosolische regio zoals aangegeven door de rode cirkel (PA). Verschillend gekleurde contouren worden aangeduid om aan te geven welke regio werden geacht voor fluorescentie intensiteit metingen na verloop van tijd. (b) een illustratie van de Tijdsdistributie van PA-GFP-actine volgende photoactivation. Neem nota van de geleidelijke vermindering van de fluorescentie in de photoactivated, cytosolische regio (rode cirkel), aangezien de photoactivated actine away from it diffundeert. Als gevolg van hun verspreiding aan de voorzijde en de vergadering in het netwerk, zijn de photoactivated actine monomeren geleidelijk verbeterd in lamellipodia (cyaan regio) en de rest het cytosol (verschillende gekleurde gebieden) op een afstand - en tijd-afhankelijke manier. (c) vertegenwoordiger, tijdelijke daling van de fluorescentie binnen de photoactivated cytosolische regio (rode contour in b). (d) temporale veranderingen in de intensiteit van de fluorescentie in de lamellipodial regio (cyaan contour in b). (e) bochten vertegenwoordiger van de temporele veranderingen in intensiteit van de fluorescentie van cytosolische regio's (vergelijkende in b) vanwege positionering in variabele afstanden uit het gebied van photoactivation. Merk op hoe de helft-tijden van het bereiken van de fluorescentie plateau (aangegeven in de legenda op het recht) toenemen met de afstand van gegeven regio op het gebied van photoactivation, waarschijnlijk correleren met de verhoogde keer die nodig zijn voor de verspreiding van actine monomeren in de respectieve regio. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis en Micromanipulatie voor intravitale Fluorescentie Imaging van de microcirculatie

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Tracking Morfogenetische Tissue vervormingen in de vroege Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Fosfopeptide Analyse van knaagdieren Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‹Å“Touch DNAÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢ Evidence

Verbeterde Genetische analyse van Single Human Bioparticles Hersteld door vereenvoudigd Micromanipulatie uit Forensisch &#39;Touch-DNA&#39; Evidence

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...