Name: micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

אנחנו מודים ל קרן מחקר גרמני (DFG) תמיכה כספית (גרנט Nr. RO2414/5-1 ל- KR).

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פיקוח על הדינמיקה ייתכן של חלבונים ומולקולות אחרות בתאים חיים הפך להיות כלי חיוני בתחומים רבים של התא וביולוגיה מולקולרית. מתקדמת קרינה פלואורסצנטית טכניקות במיקרוסקופ כולל העברת האנרגיה של תהודה קרינה פלואורסצנטית (סריג) ואורך חיים סריג-זריחה הדמיה (סריג-FLIM), או לאפשר FRAP, אובדן זריחה photobleaching (היפוך), photoactivation, כמו גם רבים אחרים כדי להפוך את זמני המרחבי מעקב של אינטראקציות חלבון-חלבון, שינויים הסתגלותי, וכן לקבוע את קינטיקה של דיפוזיה ולוקליזציה של חלבונים שונים בתא1,2. טכניקות FRAP, photoactivation, בפרט, הינם חלים נרחב לבחינת הרגולטורים של אקטין שלד התא והתא ההעברה. שיטות אלה ניתן להחיל לבד או בשילוב עם טכניקות המיקרומניפולציה נוספים כגון microinjection3, ולערב הביטוי של חלבונים עם התווית fluorescently. הם מאפשרים את אומדן קינטיקה של התאחדות החלבון אקטין-עשיר מבנים מעורב נדידת תאים, כגון filopodia או lamellipodia, המחזור של חלבונים הדבקויות מוקד4, או בענף רשתות אקטין5. בנוסף, הם מאפשרים קביעת המחירים פלמור אקטין lamellipodial, ההערכה של הפיזור של אקטין monomeric בתוך ציטוזול, הקצב של טרנסלוקציה מונומר אקטין subcellular כדי polymerizing אקטין חוטים ב בולטות lamellipodia6, ופרמטרים אחרים.
FRAP היא שיטת להמחיש וכימות הניידות של חלבונים בתוך התא החי, פותח במקור בשנות ה-70 על ידי אקסלרוד7. אזור בעל עניין (ROI) בתוך תא, מאוכלס שכותרתו fluorescently חלבונים, transiently חשופים לייזר בעוצמה גבוהה, מספיק כדי לגרום את הלבנה של מולקולות fluorophore נוכח באזור זה במשך תקופה קצרה נתון של זמן. מולבן, fluorescently עם התווית חלבונים הממוקם מחוץ רועי במהלך הלבנה, מפוזר, לחדור לאזור מולבן בהתאם דינמיקה ייתכן שלהם, גורמת העקירה של מולקולות photobleached לאורך זמן. הקצב של קרינה פלואורסצנטית שחזור באזורים מולבן תלויה גורמים שונים, כולל את הגודל ואת קצב פעפוע של מולקולה נתונה, ומקושרת כמובן קצב תחלופת שלה בתוך בשם מבנה מולבן. לכן, חלבונים מסיסים לתווך את ההתאוששות של קרינה פלואורסצנטית בתוך רועי מולבן במהירות באמצעות דיפוזיה, בעוד חלבונים הקשורים בחוזקה עם מבנים, כגון הדבקויות מוקד, יהיו פעמים מחזור ארוך יותר, כמו להחלמתם קרינה פלואורסצנטית מותנה על פעפוע של השבר מסיסים של קינטיקה חלבון, דיסוציאציה-עמותה של השבר מבנה-הקשורים. קרינה פלואורסצנטית התאוששות בדרך כלל רכשה, לכמת עד הרמה הראשונית של אקונומיקה קדם עוצמת קרינה פלואורסצנטית. עם זאת, זו אינה מתרחשת אם חלק עוצמת קרינה פלואורסצנטית הראשונית שייך השבר משותק כביכול, אשר אינו מסוגל המיועדים לחידוש מלאי על ידי דיפוזיה או הוא חידוש בקצב מאוד איטי לעומת רוב מולקולות הכוללת הנייד שבר. כדי לקבוע את קצב תחלופת חלבון, עקומות FRAP נוצרים, המייצג את היקף פלורסצנטיות שחזור לאורך זמן. מפני עיקולים אלה השחזור, ניתן לחשב ממוצע חצי-פעמים של חלבון התאוששות. על-ידי יצירת העקומה מתאימה של נתונים FRAP הממוצע, וכן ניתוחים מתמטיים ולכן, זה גם אפשרי להסיק קצב תחלופת הממוצע של השבר הנייד מהווה שילוב של אוכלוסייה הומוגנית אחת של מולקולות, או הוא מורכב subpopulations שתיים או יותר של מולקולות מתהפך במחירים דיפרנציאלית. בנוסף להערכת חלבון מחזור המחירים על ידי גישות כמותית, מעקב ההתאוששות של אזורים photobleached lamellipodia יכול גם לאפשר על כימות מדויק של lamellipodial פרמטרים תנועתיות כגון זרימת רטרוגרדית, בליטה, המחירים פלמור אקטין. לפיכך, FRAP מהווה כלי רב-תכליתי שתחול עבור הערכת פרמטרים שונים בתוך מבנים של תאים חיים.
Photoactivation היא שיטה המשמש למעקב אחר של דיפוזיה וניידות של חלבונים או מולקולות שמקורן במיקום סלולרי ייעודי. הטכניקה מעסיקה, למשל, וריאציה של פראי-סוג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), שפותחה לראשונה על ידי פטרסון, Lippincott-שוורץ8, אשר הוא מוטציה באופן המאפשר פלורסצנטיות שלה צריך להיות מוגברת מאוד בתגובה לחשיפה אולטרה סגול (UV) אור (כ- 400 ננומטר; כאן, 405 ננומטר). כפי שתואר על ידי פטרסון et al., פראי-סוג GFP בראשון קיימים אוכלוסייה מעורבת של פנולים נייטרלי, phenolates anionic, אשר מייצרים לשיא ספיגת הגדולות כ 397 nm ו סופה קטנה-475 nm, בהתאמה. על הקרנה של החלבון עם אור UV, האוכלוסייה עובר photoconversion, הנעה כלפי הצורה anionic. כשהוא מתרגש על ידי 488 ננומטר, החלבון photoconverted/photoactivated מציג עלייה 3-fold פלורסצנטיות, מספיקות בפועל הבחנה בין מופעל, שלא הופעל GFP עקב קרינה פלואורסצנטית רקע פנימי גבוה. עם זאת, ירידה בעוצמת רקע הושגה על ידי החדרת מוטציה בודדת חומצת אמינו לתוך הרצף GFP (החלפת היסטידין במיקום 203). וכתוצאה מכך T203H החשבונאי, ידוע גם בשם photoactivatable-GFP (PA-GFP) מאופיין על ידי ירידה משמעותית ספיגת השיא קטין, אשר על הקרנה עם אור UV הוא גדל כמעט 100-fold כשהוא מתרגש לאחר מכן על ידי אור 488 ננומטר. ומכאן, ביטוי של חלבונים הרשות הפלסטינית-GFP-מתויגים ' הוא בגישה בשימוש נרחב, המאפשר קביעת דיפוזיה, תנועתיות של מולקולות בתוך התאים. אנחנו החלת בעבר הרשות הפלסטינית-GFP-מתויגים ' אקטין כדי לקבוע את הקצב של פיזור של מונומרים של אקטין מן האזורים cytosolic, ומאפשר לא רק חקר ניידותו בתוך את ציטוזול, אלא גם שיעור התאגדות שלהם לתוך בולטות אקטין lamellipodial רשת6. ספרות עדכנית יותר מתאר גם חלבונים הרומן, צילום-להמרה באופן עקרוני ניתן להשתמש באופן מקביל, אך מסתירים את הפוטנציאל הגלום יהיה גלוי כבר לפני צילום-המרה. עבור קבוצה זו של חלבונים פלורסנט דוגמאות Dendra2 ו- mEos29,10,11,12.
במאמר זה, נסביר את המתודולוגיה של תאים microinjecting עם חלבונים. בהמשך נסביר איך טכניקה זו יכול להיות משולב עם FRAP, מאת photobleaching החלבונים המעורבים אקטין שלד התא רגולציה, תנועתיות, ו כיצד ניתן לגזור FRAP ופיתולים בחצי משרה של התאוששות של שברים ניידים. בנוסף, אנו מספקים דוגמא של איך הטכניקה FRAP יכול לשמש כדי לקבוע שיעור פלמור אקטין של רשתות lamellipodial. אנו מספקים גם הנחיות וטיפים על איך לבצע ניסויים photoactivation, אשר יכול לשמש כדי לקבוע cytosolic הניידות של אקטין monomeric ואת המחירים של אקטין השתלבות lamellipodia. שיטות אלה, כמובן, אינם רק מוגבל של מעקב אחר רכיבי שלד התא אקטין, אבל עם פוטנציאל נדרש התאקלמות מתון או אופטימיזציה, יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי סוגי תאים אחרים או לחקור חלבונים שונים, מבנים, ו פרמטרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

בחינת הדינאמיקה ייתכן של חלבונים יכול לחשוף שלהם חשיבות תפקודית בהקשרים שונים. במאמר זה, זה דנו כיצד פלורסנט התאוששות לאחר photobleaching (FRAP) וטכניקות photoactivation יכול לשמש כדי ללמוד את הדינמיקה ייתכן של חלבונים במקומות subcellular. אנו גם מראים כמה טכניקות אלה מאפשרים קביעה ישירה של פרמטרים שונים מקושר תנועתיות תקנה ותא cytoskeletal אקטין. יתר על כן, microinjection של תאים בנוסף מתואר כטיפול חלופי (פוטנציאל הקודם או משלימים את הטכניקות הנ ל photomanipulation) על ההדק השלכות מיידי של חלבונים translocated על התא מורפולוגיה ותפקוד. חוץ-גופית כגון הזרקת חלבון או יישום מקומי של קרום פלזמה-חדיר סמים או מעכבי cytoskeletal יכול לשמש כלי רב עוצמה כדי לתעד את התוצאות מיידית של טיפול נתון על התנהגות תא התא הבודד, subcellular רמה. דוגמה לכך הוא כאן על ידי אינדוקציה מיידית של lamellipodial תא קצה בליטה על ידי ההזרקה של חלבון רקומביננטי Rac1, כפי שנקבעו לפני הרבעון-מאה שנה. בנוסף, אנו מספקים פרוטוקול לקביעת המחזור של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) משופרת-VASP, פולימראז נימה אקטין בצורה בולטת צבירת-טיפים lamellipodial של תאים B16-F1, העסקת FRAP, כולל נתונים משויכים ניתוח, פריסטלטיות. אנו מציגים גם הנחיות להערכת שיעור של lamellipodial אקטין רשת פלמור, כפי שהודגם על ידי תאים ביטוי מתויג EGFP β-אקטין. לבסוף, ניתנות הוראות כיצד לחקור את המחירים של אקטין מונומר ניידות בתוך הציטופלסמה תא, ואחריו התאגדות אקטין באתרים של פילמנט מהירה הרכבה, כגון קצות בולטות lamellipodia, באמצעות photoactivation גישות. אף אחד פרוטוקולים אלה מוגבל לשימוש ברכיבים או הרגולטורים של שלד התא אקטין, אך ניתן להרחיב בקלות לחקור מקביל אופנה הדינמיקות ייתכן והתפקוד של חלבונים במבנים שונים subcellular שונים או פונקציונלי הקשרים.

איור 1 g h עולה שלב תמונות חדות של תאי פיברובלסט NIH3T3 מוקדמת, microinjection אחרי 10 דקות של Rac1, אשר הוא GTPase רו משפחתי קטן מסוגל גרימת היווצרות lamellipodia דרך ביחסיו עם הגל מורכבים. התא הוא מדמיין קודם לפני microinjection (איור 1g), כדי לאשר את הכדאיות שלה, מורפולוגיה, למשל חוסר lamellipodia. ב microinjection אחרי 10 דקות, התא השתנה בבירור מורפולוגיה שלה, אשר צפוי מטיפול זה, ומציין זריקה מוצלחת (איור 1h).
על פשטות ובהירות, הבא אנו מספקים תוצאות למופת לניתוח FRAP ו photoactivation ב תאים, אשר יש לא היה בנוסף microinjected.
ניתוח של המחזור של מתויג EGFP VASP בקצה lamellipodium מוצג באיור 2-f. שימו לב כי VASP בנוסף מטרות המתהווה, מוקד הדבקויות, נקודות קטן ומוארך מתא פנים18,19. עוצמת קרינה פלואורסצנטית של אזור lamellipodial עם הצטברות VASP ברור בקצה מולבן, נמדדת לכל מסגרת זמן, בעקבות קו המתאר של רועי לפני, במהלך, ואחרי הלבנת כפי lamellipodium בולט לפנים. כמו חלבונים EGFP-VASP מולבן להיות ממוחזרים על ידי מולקולות שאינן קשה באתרים אלה, התאוששות הדרגתית של קרינה פלואורסצנטית הוא ציין (איור 2b). העקומה שחזור FRAP שהושג בצורה הזאת, מנורמל עוצמת אקונומיקה מראש (המבוטא 1) ניתן לראות באיור 2c. יעילות Photobleaching יכול להשתנות, היה כ- 20% של הערך לפני הלבנת בדוגמה זו, כפי שנקבע מן הערך t0 (המסגרת הראשונה לאחר photobleaching). העלייה של קרינה פלואורסצנטית מגיע מישור בדוגמה המוצגת ב בערך 80% זריחה לפני הלבנה. מבנה סטטי במהלך זמן הניסוי, כגון אדהזיה מוקד, ההבדל בין עוצמת אקונומיקה מראש על ידי קרינה פלואורסצנטית מישור הגיעה לאחר השחזור מוגדרת השבר משותק (אם, החץ האדום באיור 2 c, e), ואילו כמות קרינה פלואורסצנטית החלים בין הזמן של הלבנת ושחזור מלא מוגדרת בתור השבר ניידים (ירוק לחץ דו-ראשי, איור 2c, e). שימו לב כי במבנה בשומר כגון הטיפ lamellipodium ניתח כאן, היקף IF עשוי לייצג מולקולות משותק אלא נובעות גם ירידה של בליטה מהירות, כידוע עוצמת EGFP-VASP לסמוך על זה פרמטר18. כדי לחשב את החצי-זמן ההחלמה, עיקול בכושר נוצר על סיגמא התוויה (איור 2d). במקרה זה, הערך של הפרמטר "b" מופק בפתרון משוואה 2 שווה ל 0.0754, אשר חלה על הפונקציה לוגריתמי (משוואה 4) תוצאות חצי-בזמן משוער של התאוששות של 9.19 s (איור 2-d , לוח הימין), שזה יחסית מהיר בתא מסוים זה לעומת הממוצע שפורסם בעבר5. יש לציין כי חצי-זמני התאוששות עשויה לפעמים להשתנות באופן משמעותי מתא לתא בתוך מאותה אוכלוסייה. לכן, להשגת תוצאות נציג, אנו ממליצים בקביעת פרמטר זה כמו ממוצע מתאי לפחות 15-20. כדי להמחיש את מידת השונות, אריתמטיקה אמצעי השחזור EGFP-VASP בממוצע 15 תאים עבור כל נקודת זמן היו שנוצר (איור 2e), עקומת ממוצע מתאים שנוצרו ומוצג בצורה מקבילה (איור 2 f).
שיעור פלמור אקטין lamellipodial הרשת כוללת הסכום של חדירת רשת קדימה וזרימה רטרוגרדית. ניתן להחיל FRAP למדידת קצב פלמור אקטין על ידי תאים transfecting (במקרה זה B16-F1) ועם מתויג EGFP β-אקטין photobleaching אזור lamellipodial בולטות (איור 2g). לניתוח של lamellipodial אקטין רשת פלמור, התאוששות זריחה על הלבנה של מתויג EGFP β-אקטין שקובעת לאורך זמן. כמו פלמור של התקדמות מונומרים של אקטין בקצות טקסוס חוטים אקטין lamellipodial (אשר כל הצבע לקראת קבלה20), הרשת היא rearwards translocated כל הזמן והוא מתקדם בעל-פה, המחירים אשר יכול להיות בקלות לקבל באמצעות שחזור מקוטב של זריחה על photobleaching. קרינה פלואורסצנטית שחזור של lamellipodium השלמת ברגע לאזור מולבן הגיעה לאזור המעבר בין החלק האחורי של lamellipodium lamella, אשר מאופיין על ידי צפיפות נמוכה של צרורות מסודרים אופקית נימה יותר בעיטה הרבה יותר לאט מאשר מה הוא ציין את lamellipodium. כמופיע ב איור 2g, קרינה פלואורסצנטית השחזור ניתן לאבחן כקו אופקי הקצה, זורם אחורנית לכיוון lamella, המאפשר מדידת המרחקים של בליטה וזרימה רטרוגרדי (מיוצג באופן אינדיבידואלי שבלוח הימני של איור 2g כחצים כתום ואדום דו-ראשי, בהתאמה).
לנו יש להחיל גם photoactivation בתאים B16-F1 transfected עם הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין כדי לעקוב אחר הניידות של מונומרים של אקטין בתוך ציטוזול הקצב של שלהם לצאר בולטות lamellipodia. כמופיע באיור 3א, ב, אזור cytosolic היה photoactivated על ידי חשיפה 405 ננומטר לייזר, בעוד תמונות נרכשו ב- GFP ערוץ כל 1.5 s המדגימה את ההפצה של אקטין photoactivated מסומנות GFP. ניתן לראות Photoactivated GFP-אקטין לשדר מהאזור cytosolic איור 3ב'. הקצב של הקטנת עוצמת קרינה פלואורסצנטית באזור cytosolic photoactivated מיוצג כאחוז של עוצמת הראשונית-t0 (תחילה מסגרת לאחר photoactivation; איור 3 ג). Photoactivated אקטין גם משתלב בקצות lamellipodia, איפה חדש מונומרים של אקטין מתווספים בקצוות טקסוס הגוברת של מתארך אקטין חוטים במהלך ההחלמה. כדי להעריך את קצב התאגדות lamellipodial, מדדנו את עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן של קו מתאר/אזור דו-ממדי של 5 µm רוחב ו 1 מיקרומטר בגובה; האזור היה כל הזמן מחדש ממוקם בקצה lamellipodium כפי וצווארי. אקטין התיעוש היה מיוצג האחוז של קרינה פלואורסצנטית בעוצמה של האזור cytosolic photoactivated-t0 (איור 3ד'). כפי התארכות של אקטין חוטים התקדמה חדש מונומרים של אקטין שולבו בחזית lamellipodial. שבריר של אלה מונומרים של אקטין stochastically נגזר מן הבריכה cytosolic איפה מונומרים היו photoactivated. התוצאה היא העלייה המהירה של זריחה ב- lamellipodia ב- 20 הראשון s לאחר photoactivation. כמו מונומרים חדשות מתווספות לפנים lamellipodial, זרימה מונומרים אקטין בעבר incorporated זיריהם לכיוון lamella על ידי זרימת רטרוגרדית. לאורך זמן, רועי מתמלא לחלוטין מונומרים פלורסנט, מישור ב פלורסצנטיות נגיש (איור 3ד'). ירידה הדרגתית פלורסצנטיות ואז נוצרת כאשר, בעקבות דיפוזיית photoactivated מונומרים ברחבי התא, מונומרים של אקטין הלא-photoactivated יותר ויותר מחדש מתווספות לחזית lamellipodial. זו ירידה בקרינה פלואורסצנטית תוכלו למצוא מישור חדש, אשר ניתן להגיע ברגע איזון התא כולו בין מונומרים photoactivated ו- photoactivated שאינו נגיש (נתונים לא מוצג).
הניידות של מונומרים של אקטין ברחבי ציטוזול נגזר על ידי מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית אזורים בגודל זהה ממוקם רחוק מאזור photoactivated (דוגמה על איור 3 לפי אזורים צבע מקודד עם תוויות R1-R5). כמופיע ב איור 3e, עוצמת קרינה פלואורסצנטית בכל אחד מאזורים אלה ופוחת ממנו cytosolically באזור photoactivated, כמו השבר של מונומרים של אקטין photoactivated הופך להיות יותר ויותר מדולל עם שלא הופעל מונומרים (קרי, ללא-פלורסנט). יתר על כן, הפסגה של קרינה פלואורסצנטית הגיע מאוחר יותר: ככול שרחוקים יותר נמדד האזור נמצא מאזור photoactivated, ככל הזמן הנדרשת עבור מונומרים של אקטין להתפשט לאזורים אלה. ערך נציג לתואר של אקטין מונומר חדירה לתוך כל אזור ניתן לגזור על ידי לכימות חצי שעת להגיע רמת קרינה פלואורסצנטית. ככול שרחוקים יותר באזור, ככל שלוקח את אקטין photoactivated לנטרל את זה, ובכך יותר זמן נדרש עבור הרמה פלורסנט להגיע, בסופו של דבר שמוביל ערך1/2 t גבוה יותר (איור 3e).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> איור 1 : הדמיה קאמרית בהליך ההרכבה, microinjection. רכיבי קאמרית () הדמיה. (b) סיליקון גריז מרוח בזהירות סביב הפתח של סילר לאיטום פלסטיק. (ג) coverslip ממוקם עם הצד-התא פונה כלפי מעלה אל מרכז החדר הדמיה פתיחה. (ד) מאובטחת חותם נוסדה על ידי מיצוב חותם פלסטיק מעל coverslip על ידי הידוק את התפסים בצד. (e) מיקרוסקופיה בינוני הוא pipetted לתוך החריץ קאמרית. (f) לחדר ההדמיה ממוקם על הבמה מיקרוסקופ, גלאי חום ואלקטרודות מקושרות אל יחידת חימום טרום מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס, תאים מותר להסתגל במשך לפחות 30 דקות לפני מיקרוסקופ מאותחלת. בדוגמה זו, הבמה מיקרוסקופ הוא מצויד גם עם micromanipulator לביצוע microinjections, המחט microinjection מוכנס לתוך האמצעי המכסים את שכבת תאים במחסנית הדמיה. תאי פיברובלסט (g) NIH3T3 הוא מדמיין לפני microinjection על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות. הצלב האדום בתוך התא perinuclear מציין את מיקומו של microinjection בעתיד, התואם לאזור cytoplasmic גבוהה מהקרבה קרוב לגרעין מגושם. (h) 10 דקות אחרי microinjection עם Rac1, התא מגיב על ידי היווצרות הבולטים של lamellipodia ברחבי הפריפריה התא כולו (המסומנים על ידי חצים ירוקים). <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> איור 2: FRAP מאפשר קביעת המחירים של חלבון פלמור אקטין מחזור או lamellipodial. () נציג דוגמה תא B16-F1 לבטא EGFP-VASP לפני photobleaching של אזור lamellipodial כמצוין. קווי המתאר בצבעים שונים/צורות מסומנות כדי לציין באילו אזורים נחשבו למדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן. הערה קווי המתאר אדום מסומן עם סימן קריאה, אשר מתייג אזור cytosolic ממוקם באזור המכיל מרובים שלפוחית, קפלים פני שטח התא. אזורים דינמי כזה יש להימנע לבחירת מחוזות הפניה פלורסצנטיות, כפי הם מאופיינים חזק לטווח קצר תנודות של זריחה, ובכך לגרום תוצאות לא מדויקות. (b) Lamellipodial אזור של EGFP-VASP התא לביטוי לפני ואחרי photobleaching. ההתאוששות של ניאון האות לאחר photobleaching בתוך האזור. בצבע סגול הוא מדמיין לאורך זמן. החץ מצביע על קצה microspike, מועשרים לתעשיית VASP ככל הנראה עקב צפיפות גבוהה של אקטין חוטים שם polymerizing19. (ג) דוגמה FRAP שחזור עקומה כמו נגזר לכימות עוצמת lamellipodium photobleached (מתאר סגול) ב' אדום פלואורסצנטי ולציין הקו הירוק מימין, בהתאמה, שברים משותק, ניידים. (ד) A מתאים של העקומה שחזור FRAP ג' (החלונית הימנית), דוגמה לשיטת חישוב להפיק את זמן ההחלמה חצי (לוח נכון). (e) דוגמה של החלמה FRAP עיקול נגזר בממוצע את עקומות שחזור זריחה של תאים 15, עם ברים SEM המציינת את מידת ההשתנות בתוך האוכלוסייה המדגם. התאמה (f) עיקול נגזר בממוצע את השחזור FRAP עקומת מתאים של תאים 15 (החלונית הימנית), דוגמה לשיטת חישוב להפיק את זמן ההחלמה חצי (לוח נכון). (g) לוחות בצילום מואץ של בולטות lamellipodium של תא B16-F1 ביטוי מתויג EGFP β-אקטין לפני ואחרי ניקוי הפנים של אזור lamellipodial כמצוין, ואחריו השחזור של זריחה lamellipodium לאורך זמן. בלוח הימני, הערכים שנמדדו עבור חדירת ומסופקים מרחקים רטרוגרדי (כתום ואדום, בהתאמה). חישובים תחת הלוחות התמונה חושפים כיצד הסכום של בליטה ומרחקים רטרוגרדית משמשים להפיק קצב פלמור של הרשת אקטין lamellipodial. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> איור 3: Photoactivation של הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין עבור מונומר מעקב ברחבי התא. () א נציג דוגמה תא B16-F1 לבטא הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין לפני מפעילה photoactivation באזור cytosolic, כפי שמציין את עיגול אדום (PA). קווי המתאר בצבעים שונים מסומנות כדי לציין באילו אזורים נחשבו למדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן. photoactivation (b) איור של ההתפלגות הטמפורלי של הרשות הפלסטינית-GFP-אקטין הבאים. הערה ההפחתה ההדרגתית של זריחה ב- photoactivated, אזור cytosolic (עיגול אדום), כמו אקטין photoactivated מפזרת ממנו. בשל דיפוזיה שלהם בחזית, הרכבה לרשת, מונומרים של אקטין photoactivated בהדרגה משופרים lamellipodia (אזור ציאן) וברחבי את ציטוזול (אזורים בצבעים שונים) מרחק ותלוי זמן אופנה. (ג) נציג, זמני שקיעת פלורסצנטיות בתוך אזור cytosolic photoactivated (אדום מתאר ב'). (ד) הטמפורלית שינויים בעוצמת זריחה באזור lamellipodial (ציאן מתאר ב'). (e) נציג של השינויים זמני זריחה בעוצמה של אזורים cytosolic (מקודדים ב- b) עקב מיקום במרחקים משתנה מאזור photoactivation ' עקומות '. שימו לב איך חצי-פעמים להגיע על ידי קרינה פלואורסצנטית מישור (שמצוין באגדה מצד הימין) הגדל עם המרחק של נתון האזור לאזור של photoactivation, סביר להניח לקשר עם מוגברת פעמים הדרושה ביזור של מונומרים של אקטין לתוך אזור בהתאמה. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

מעקב אחר דפורמציות המוךפו&quot;גנטי שהולך רקמות בעובר צ&#39;יק מוקדם

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

ניתוח Phosphopeptide של מכרסמים epididymal תאים-זרע

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‹Å“Touch DNAÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢ Evidence

ניתוח גנטי משופר של Bioparticles האדם יחיד ששוחזרו על ידי פשוטה מיקרומניפולציה מהראיות משפטית &quot;Touch DNA&quot;

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

יישומים של מיפוי-עתיים, טכניקות ניתוח חלקיקים לכמת Ca תאיים2 + איתות בחיי עיר

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...