Name: micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00
Duration: 12 min 52 s
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हम वित्तीय सहायता (ग्रांट Nr. RO2414/5-1 से केआर) के लिए जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) के आभारी हैं ।

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन और अंय अणुओं की spatiotemporal गतिशीलता की निगरानी सेल और आणविक जीवविज्ञान के कई क्षेत्रों में एक अनिवार्य उपकरण बन गया है । उंनत प्रतिदीप्ति प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) और झल्लाहट-प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग (झल्लाहट-FLIM), या frap है, प्रतिदीप्ति में photobleaching नुकसान (फ्लिप) और photoactivation के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई दूसरों की अनुमति सहित माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए अस्थाई और स्थानिक प्रोटीन की ट्रैकिंग-प्रोटीन बातचीत, गठन परिवर्तन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रसार और सेल1में विभिंन प्रोटीन के स्थानीयकरण के कैनेटीक्स का निर्धारण,2। frap है और photoactivation तकनीक, विशेष रूप से, actin cytoskeleton और सेल माइग्रेशन के नियामकों की जांच के लिए व्यापक रूप से लागू होते हैं । इन तकनीकों को अकेले या अतिरिक्त micromanipulation तकनीकों के साथ संयोजन में ऐसे microinjection3के रूप में लागू किया जा सकता है, और फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति शामिल है । वे कोशिका प्रवास में शामिल actin-रिच संरचनाओं के लिए प्रोटीन एसोसिएशन के कैनेटीक्स के आकलन की अनुमति देते हैं, जैसे filopodia या lamellipodia, फोकल आसंजन में प्रोटीन का कारोबार4, या बंटी actin नेटवर्क्स5. वे lamellipodial actin बहुलकीकरण दरों के निर्धारण को भी सक्षम करते हैं, actin के भीतर monomeric cytosol के फैलाव का आकलन, उपसेलुलर actin मोनोमर की दर translocation में polymerizing actin रेशा फैलाने में lamellipodia6, और अंय पैरामीटर्स ।
frap है एक जीवित कोशिका के भीतर प्रोटीन की गतिशीलता को visualizing और बढ़ाता है, मूल रूप से 1970 के दशक में Axelrod द्वारा विकसित के लिए एक विधि है 7 । एक कोशिका के भीतर ब्याज का एक क्षेत्र (रॉय), फ्लोरोसेंट लेबल वाले प्रोटीन के साथ आबादी, क्षणिक उच्च तीव्रता के एक लेजर के संपर्क में है, समय की एक दी छोटी अवधि के दौरान इस क्षेत्र में मौजूद fluorophore अणुओं के ब्लीचिंग का कारण पर्याप्त है । ब्लीचिंग, फ्लोरोसेंट के दौरान ROI के बाहर स्थित प्रोटीन, उनके spatiotemporal गतिशीलता के आधार पर ब्लीचिंग क्षेत्र में फैलाना और घुसपैठ करेगा, जिससे समय के साथ photobleached अणुओं का विस्थापन होता है । ब्लीच्ड क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति वसूली की दर विभिन्न कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें दिए गए अणु के आकार और प्रसार की दर, और निश्चित रूप से ख्यात संबद्ध प्रक्षालित संरचना के भीतर अपनी कारोबार दर । इस प्रकार, घुलनशील प्रोटीन ब्लीच्ड रॉय के भीतर प्रतिदीप्ति की वसूली तेजी से प्रसार के माध्यम से मध्यस्थता करेंगे, जबकि प्रोटीन कसकर ऐसी फोकल आसंजन के रूप में संरचनाओं के साथ जुड़े, अब कारोबार समय होगा, के रूप में उनके प्रतिदीप्ति वसूली करेगा प्रोटीन और पृथक्करण संरचना के कैनेटीक्स-संबद्ध अंश के घुलनशील अंश के प्रसार पर दोनों निर्भर करते हैं । प्रतिदीप्ति की प्री-ब्लीच गहनता के प्रारंभिक स्तर तक पहुंच जाने तक प्रतिदीप्ति वसूली आमतौर पर अधिग्रहीत और quantified है । हालांकि, यह नहीं होती यदि प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक हिस्सा तथाकथित मोबाइल अंश है, जो प्रसार द्वारा मंगाया जा करने में असमर्थ है या बहुत धीमी दरों पर मंगाया जा रहा है के अंतर्गत आता है के रूप में अणुओं के बहुमत की तुलना में मोबाइल शामिल अंश. प्रोटीन कारोबार की दर निर्धारित करने के लिए, frap है curves उत्पन्न कर रहे हैं, समय के साथ प्रतिदीप्ति वसूली की हद का प्रतिनिधित्व. इन रिकवरी curves से, प्रोटीन की औसत आधा समय वसूली की गणना की जा सकती है । औसत frap है डेटा के वक्र फिट बनाने के द्वारा, और इसलिए गणितीय विश्लेषण, यह भी deduce के लिए संभव है कि मोबाइल अंश की औसत टर्नओवर दर अणुओं की एक सजातीय आबादी का एक समग्र गठन, या कि क्या यह से बना है अंतर दर पर मोड़ अणुओं के दो या अधिक उपजनसंख्या । मात्रात्मक दृष्टिकोणों द्वारा प्रोटीन कारोबार की दर का आकलन करने के अलावा, lamellipodia में photobleached क्षेत्रों की वसूली पर नज़र रखने, प्रतिगामी प्रवाह, दखलंदाजी जैसे lamellipodial गतिशीलता मापदंडों के सटीक ठहराव के लिए भी अनुमति दे सकते हैं, आणि actin बहुलकीकरण व्याजदर आहे. इस प्रकार, frap है एक बहुमुखी उपकरण का गठन करने के लिए जीवित कोशिकाओं की संरचनाओं के भीतर विभिंन मापदंडों का आकलन करने के लिए लागू किया जाएगा ।
Photoactivation एक निर्दिष्ट सेलुलर स्थान से उद्भव प्रोटीन या अणुओं की प्रसार और गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है । तकनीक काम करते हैं, उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार के एक संस्करण हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), शुरू में पैटरसन और Lippincott द्वारा विकसित-Schwartz8, जो एक तरह से है कि अपने प्रतिदीप्ति को अत्यधिक जोखिम पर वृद्धि की अनुमति देता में रूपांतरित हो जाता है पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश (चारों ओर ४०० एनएम; यहां, ४०५ एनएम) । के रूप में पैटरसन एट अल., जंगली प्रकार GFP chromophores द्वारा वर्णित तटस्थ phenols और anionic phenolates, जो लगभग ३९७ एनएम में एक प्रमुख अवशोषक चोटी और ४७५ एनएम में एक छोटी सी एक, क्रमशः का उत्पादन की एक मिश्रित जनसंख्या के रूप में मौजूद हैं । यूवी प्रकाश के साथ प्रोटीन के विकिरण पर, जनसंख्या photoconversion से गुजरती है, anionic फार्म की ओर स्थानांतरण । जब ४८८ एनएम द्वारा उत्साहित, photoconverted/photoactivated प्रोटीन दर्शाती है एक 3-प्रतिदीप्ति में वृद्धि गुना, सक्रिय और गैर के बीच भेद करने के लिए व्यवहार में अपर्याप्त उच्च आंतरिक पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के कारण GFP सक्रिय । हालांकि, पृष्ठभूमि की तीव्रता में कमी GFP अनुक्रम में एक एकल एमिनो एसिड उत्परिवर्तन शुरू करने से प्राप्त किया गया है (histidine प्रतिस्थापन स्थिति में २०३) । जिसके परिणामस्वरूप T203H उत्परिवर्ती, भी photoactivatable के रूप में जाना-GFP (PA-GFP) मामूली चोटी, यूवी प्रकाश के साथ विकिरण पर जो लगभग १०० वृद्धि हुई है के अवशोषण में एक महत्वपूर्ण कमी की विशेषता है गुना जब बाद में ४८८ एनएम प्रकाश से उत्साहित । इसलिए, PA-GFP-टैग किए गए प्रोटीन का इजहार एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है, जो प्रसार और कोशिकाओं के भीतर अणुओं के गतिशीलता के निर्धारण की अनुमति देता है । हमने पहले PA-GFP-टैग actin लागू किया है cytosolic क्षेत्रों से दूर actin मोनोमर के फैलाव की दर निर्धारित करने के लिए, cytosol के भीतर अपनी गतिशीलता की न केवल अन्वेषण की अनुमति है, लेकिन यह भी फैलाने में अपने निगमन दर lamellipodial actin नेटवर्क6. अधिक हाल के साहित्य भी उपंयास, फोटो-परिवर्तनीय प्रोटीन का वर्णन है कि सिद्धांत में एक अनुरूप फैशन में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन संभावित लाभ बंदरगाह पहले से ही तस्वीर रूपांतरण से पहले दिखाई । फ्लोरोसेंट प्रोटीन के इस समूह के लिए उदाहरण Dendra2 और mEos29,10,11,12शामिल हैं ।
इस लेख में, हम प्रोटीन के साथ microinjecting कोशिकाओं की कार्यप्रणाली की व्याख्या । हम आगे की व्याख्या कैसे इस तकनीक frap है के साथ संयुक्त किया जा सकता है, photobleaching प्रोटीन actin cytoskeleton विनियमन और गतिशीलता में शामिल द्वारा, और कैसे frap है घटता है और आधा मोबाइल भागों की वसूली के समय प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, हम कैसे frap है तकनीक lamellipodial नेटवर्क के actin बहुलकीकरण दरों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक उदाहरण प्रदान करते हैं । हम यह भी निर्देश और कैसे photoactivation प्रयोगों, जो actin में lamellipodia निगमन की monomeric actin और दरों की cytosolic गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर सुझाव प्रदान करते हैं । इन तकनीकों, ज़ाहिर है, केवल actin cytoskeleton घटकों पर नज़र रखने तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन संभावित उदारवादी अनुकूलन या अनुकूलन पर, व्यापक रूप से अन्य कोशिका प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है या विभिन्न प्रोटीन की जांच करने के लिए, संरचनाओं, और पैरामीटर.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

प्रोटीन की spatiotemporal गतिशीलता की जांच विभिंन संदर्भों में अपने कार्यात्मक महत्व प्रकट कर सकते हैं । इस अनुच्छेद में, यह चर्चा है कि कैसे photobleaching (frap है) और photoactivation तकनीक के बाद फ्लोरोसेंट वसूली के लिए उपसेलुलर स्थानों में प्रोटीन की spatiotemporal गतिशीलता का अध्ययन किया जा सकता है । हम यह भी बताएंगे कि कैसे इन तकनीकों actin cytoskeletal विनियमन और सेल गतिशीलता से जुड़े विभिंन मापदंडों का सीधा निर्धारण सक्षम करें । इसके अलावा, कोशिकाओं के microinjection इसके अतिरिक्त एक वैकल्पिक उपचार के रूप में वर्णित है (संभावित पूर्ववर्ती या aforementioned photomanipulation तकनीकों के पूरक) के लिए सेल पर translocated प्रोटीन के तात्कालिक प्रभाव ट्रिगर आकृति विज्ञान और समारोह । Micromanipulation जैसे प्रोटीन इंजेक्शन या प्लाज्मा झिल्ली के स्थानीय अनुप्रयोग-पारगंय दवाओं या cytoskeletal अवरोधकों एकल सेल और सेलुलर में सेल व्यवहार पर दिए गए उपचार के तत्काल परिणाम रिकॉर्ड करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं स्तर. यह रिकॉमबिनेंट Rac1 प्रोटीन के इंजेक्शन द्वारा lamellipodial सेल एज की दखलंदाजी के तत्काल प्रेरण द्वारा यहां उदाहरण है, के रूप में एक चौथाई सदी पहले की स्थापना की । इसके अलावा, हम बढ़ाया ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कारोबार का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान (EGFP)-वीएएसपी, एक actin रेशा पोलीमरेज़ lamellipodial के B16 सुझावों पर प्रमुखता से जमते-F1 कोशिकाओं, frap है को रोजगार और जुड़े डेटा सहित विश्लेषण और वक्र फिटिंग । हम भी lamellipodial actin नेटवर्क बहुलकीकरण की दरों का आकलन करने के लिए दिशानिर्देश उपस्थित, EGFP-टैग β-actin व्यक्त कोशिकाओं द्वारा उदाहरण के रूप में. अंत में, निर्देश दिए गए है कि कोशिका कोशिका द्रव्य के भीतर actin मोनोमर गतिशीलता की दरों की जांच कैसे की जाए, जिसके बाद तेजी से रेशा विधानसभा की साइटों पर actin शामिल किया जाए, जैसे कि lamellipodia का प्रयोग, photoactivation का उपयोग करना दृष्टिकोण. इन प्रोटोकॉल में से कोई भी घटकों या actin cytoskeleton के नियामकों के लिए प्रतिबंधित है, लेकिन आसानी से अनुरूप फैशन में spatiotemporal गतिशीलता और विभिंन विभिंन उपसेलुलर संरचनाओं या कार्यात्मक में प्रोटीन के समारोह का पता लगाने के लिए बढ़ाया जा सकता है संदर्भों.

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Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

हम वर्णन कैसे सूक्ष्म और photomanipulation तकनीक जैसे frap है और photoactivation गतिशीलता मानकों और पलायन कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन की spatiotemporal गतिशीलता का निर्धारण सक्षम करें । प्रयोगात्मक readouts उपसेलुलर गतिशीलता और गतिशीलता नियामकों या अंतर्निहित actin cytoskeleton के कारोबार शामिल हैं ।

Micromanipulation Morphogenetic गतिशीलता और Cytoskeletal नियामकों के कारोबार के विश्लेषण की अनुमति तकनीक

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Research

JoVE Journal

Biology

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