Name: micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Vi er takknemlige til tysk Research Foundation (DFG) for økonomisk støtte (grant Nr. RO2414/5-1 til KR).

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Her diskuterer vi avgjørende skritt i teknikkene som beskrives i denne artikkelen, og hvordan de kan optimaliseres for programmet i ulike eksperimentelle forhold.
Microinjection er en metode som kan brukes for å overvåke i cellene den øyeblikkelige effektene fra introdusere eksogene proteiner, hemmere eller narkotika. Det kan være spesielt fordelaktig for å bestemme funksjoner proteinene i vanskelig å transfect celletyper eller i situasjoner når langsiktige uttrykk ikke er ønsket. Det må bemerkes at overlevelse av visse celletyper varierer avhengig av den ekstracellulære matrisen de er seeded på. Mest endothelial, epithelial eller fibroblast-lignende celletyper, selv små liker fisk keratocytes (se Dang et al. 21 og Anderson og tvers22) kan med hell injiseres. Det finnes imidlertid unntak, for eksempel B16-F1 celler seeded på laminin, som utgjør en utmerket modellsystem av celle migrasjon, men er ikke kompatible med injeksjon på denne typen undergrunnen av ukjent grunn. For NIH3T3 fibroblast celler utfører vi rutinemessig injeksjoner på fibronectin undergrunnen og ekstra photomanipulation teknikker som FRAP (selv med photoactivation, vises B16-F1 celler her) like godt kan utføres i disse fibroblaster (se f.eks Köstler et al. 3). det må også betraktes som ulike proteiner, deres funksjonelle egenskaper og eksperimentet mål, kan ta forskjellige mengder tid å forårsake endringer, varierende fra sekunder til timer. En fordel med teknikken er at dosen/konsentrasjonen av eksogene agent kan kontrolleres mer nøyaktig på enkeltcelle nivå enn f.eksved plasmider transfection. I tillegg er fluorescerende merking av et protein ikke en nødvendighet for å garantere sin tilstedeværelse i cellen, som kan øke fleksibiliteten hvis samtidige flerkanals visualisering av andre fluorescently-merket proteiner. Microinjection kan være spesielt nyttig for å analysere øyeblikkelige effektene av spesifikke proteiner eller protein blandinger på dynamiske endringer på celle morfologi eller cytoskeleton (f.eks Dang et al. 21 for et eksempel på øyeblikkelige effekter på overføring av den Arp2/3 komplekse inhibitor Arpin). En ulempe ved teknikken er dens invasiveness, som kan forårsake celle skade eller påvirke celle morfologi. Derfor overvåker en viktig faktor når du utfører microinjections celle levedyktighet. Metoden innført her er avhengig av manuell manipulasjon. Betingelser testet med vellykket injeksjoner, som fibroblaster vokser på fibronectin undergrunnen, kan manuell injeksjon protokollen beskrevet her en nær 100% suksessrate; Dette er viktig når kombinere dette med sofistikert og tidkrevende oppfølgingseksperimenter inkludert video mikroskopi eller FRAP, som publisert tidligere3. Dette utelukker ikke at noen ganger, enkeltceller kan lide av en microinjection hendelse, som trygt kan gjenkjennes av plutselige forandringer av kontrast til både kjernen og cytoplasma, etterfulgt av cellen kanten retraksjon. Slike sjeldne eksperimentelle tilfeller er ekskludert og derfor ikke ansett for videre analyser.
Men en halv-automatiske tilnærming er også vanlig, for eksempel ansette rask (< 300 ms) maskin-kontrollerte nål redusere sammenfallende med injeksjon press økningen, slik at nålen har bare skal plasseres over hver celle før respektive injeksjon. Suksessrate på halv-automatiske injeksjoner er per definisjon lavere enn den manuelle fremgangsmåten beskrevet ovenfor, bare fordi den er optimalisert for hastighet, etterfulgt av analyse av flere celler som har overlevd denne behandlingen; dermed stole den ikke på vellykket injeksjon av en enkeltcelle. Derfor, i motsetning til én celle analyse, halv-automatiske injeksjoner er bedre egnet for å analysere injeksjon effekter av flere hundre celler, f.eks av video mikroskopi ved lav forstørrelse eller cellen fiksering og flekker. Uansett detaljert tilnærming ansatt, microinjection utgjør ikke en end-point analyse, men kan kombineres med en rekke teknikker, inkludert FRAP eller photoactivation3.
Når protein omløpshastighet av FRAP, intensiteten av laseren må være optimalisert, avhengig av mikroskopet oppsett og bildebehandling forholdene (forstørrelse, mål, etc., og celle type, strukturen og fluorescerende protein for photobleaching). Merk at på optimal laser makt, effektiv bleking er kombinert med minst mulig photodamage, for å unngå krymping eller fullføre tilbakekalling av strukturen under analyse (f.eks lamellipodia eller filopodia) eller med skade på cellenivå. Ideelt sett skal minst 70 – 80% av bleking effektivitet oppnås, men fullstendig bleking kan bli hindret av ekstremt rask omsetning av protein, som tilfellet noe over 50% kan også være akseptabelt. Optimal bleking effekt for en gitt struktur og fluorescerende fargestoff bør testes eksperimentelt, starter fra en lav laser makt etterfulgt av sin gradvis økning. Selvfølgelig noen fluorescerende farge kan per definisjon være bleket med laserlys nær sin topp på eksitasjon (488 nm for brukte grønne fargestoffer som FITC eller EGFP). Men lasere med kortere bølgelengde, som nær-UV lasere, leverer høyere makter og kan dermed også brukes for effektiv bleking av brukte fargestoffer. Vi rutinemessig bruker en 405 nm diode laser (120 mW) for bleking av både EGFP og røde fluorescerende fargestoffer (for eksempel mCherry), men med litt lavere effektivitet ved den sistnevnte (data ikke vist). Som 405 nm-dioden kan også brukes til photoactivation av PA-GFP (se nedenfor), endows dette systemet med maksimal fleksibilitet.
For B16-F1 celle strukturer og fluorescerende proteiner photobleached her, ble 405 nm-laser makt mellom 65-100 mW brukt. Når analysere et photobleached område, er det viktig å vurdere om gitt strukturen er bevart i sin opprinnelige form over analysen tidsperiode. For eksempel når analysere omsetning av proteiner på lamellipodia tips, utvises om Bøyningen på lamellipodia er betydelig endret over tid, som endringer i krumning kan føre til unøyaktige resultater hvis regionen/konturen analysert ikke fullt omfatte hele strukturen i hver målte ramme. I tillegg bør det bemerkes at pakker som er innebygd i lamellipodia, som microspikes, kan forårsake avvik i fluorescens intensitet. Som illustrert i figur 2b (hvit pil i 9 s tidsramme), en microspike-lignende struktur ligger ved målt photobleached regionen, men forblir utenfor gjennom hele mål, og dermed forårsaker ikke noen unøyaktighet. Analyse av protein omsetning er viktige betraktninger ved å velge plassering og størrelse på analysert regioner at deres fluorescens over tid ikke bør bli betydelig påvirket av endringer i celle morfologi eller faktorer enn hardt å unngå Kjøp photobleaching. For eksempel må strukturer gir betydelig kvantitative bidrag til analysert strukturen ikke flytte ut av regionen målt under analyse; i tillegg bør ubeslektet, fluorescerende enheter som vesicula strukturer som tiltrekker protein ikke angi feltet rundt under analyse. For å bestemme frekvensen av lamellipodial utgangen polymerisasjon, bør utvises at analyseres ikke trekke eller ruffling (dvs. oppover folding) lamellipodia, som dette vil sterkt påvirke nøyaktigheten av resultatet. I tillegg tilbakekalling av lamellipodial regioner kan vises som Hurtig bakover translokasjon, kan føre til overvurdering av andelen lamellipodial utgangen polymerisasjon. Tas er avstanden intracellulær normalisering regioner (tatt som referanse stillinger for korrigering av oppkjøpet photobleaching) fra den faktiske posisjonen til photobleaching, som bør være store nok til å unngå direkte innflytelse av photobleached området.
Når optimale forhold for photoactivation av PA-GFP-merket konstruerer, bør forsiktighet utvises for å unngå umiddelbar bleking under photoactivation. I vårt arbeid, de beste resultatene ble oppnådd med laser krefter 5 - 10 ganger lavere enn normalt ansatt for bleking av EGFP. For bildeopptak photoactivated molekyler, skal eksponeringstid og tidsintervallet mellom rammer være optimalisert med tanke på størrelsen på regioner og strukturer for å være photoactivated og analysert, og potensielle mobilitet av photoactivated proteiner til andre subcellular steder. Som for alle typer fluorescens bildebehandling er vedlikehold av cellen levedyktighet avgjørende for å få fysiologisk relevante resultater.
I prinsippet grønn til rød photoconversion fluorescerende proteiner som mEos eller Dronpa varianter12 utgjør en like kraftig metode for følgende dynamics og omsetning på subcellular strukturer som lamellipodium (se f.eks Burnette et al. 23). fordelen av sistnevnte metoden i motsetning til PA-GFP ville være muligheten til å følge protein dynamics før og etter konvertering med to forskjellige farger, uten behovet å co express en ekstra røde fluorescerende protein. Imidlertid våre foreløpige eksperimenter skyldtes omfanget av kontrast endring og intensitet av fluorescerende signal oppnådd ved photoactivation av PA-GFP større sammenlignet med photoconverted sonder, kanskje de overlegne spectral funksjonene av grønt mot rød fluorescerende sonder (data ikke vist). I alle fall publisert detaljerte studier begrepsordbok filament omsetning i celle-edge utstikkende deler som lamellipodia eller Vaccinia forårsaket av virus begrepsordbok haler så langt bare med PA-GFP derivater5,6,24.
Når du vurderer hvilket celle område å analysere følgende photoactivation, faktorer bør tas i betraktning, som drøftes med spesifikke eksempelet som vises her (innlemmelse av utgangen monomerer ytterst cellen ved aktivering i stoffer), men kan sikkert være extrapolated til ulike analoge vitenskapelige problemer. Først når måle frekvensen av lamellipodial innlemmelse av cytosolically photoactivated proteiner, for eksempel i forskjellige eksperimentelle forhold (som vist i Dimchev et al. 6), størrelser av cytosolic regioner og deres avstander lamellipodial kantene skal være sammenlignbare mellom eksperimentelle grupper. Det er også viktig å vurdere som photoactivating cytosolic regioner, celle tykkelsen er større i posisjoner nærmere til kjernen. Aktivere tykkere mobilnettet regioner kan resultere i høyere mengder aktivert proteiner, gitt at fordelingen av protein aktiveres er homogenously fordelt på stoffer. Endelig kan uttrykk nivåer av proteinet aktiveres sikkert være svært variabel i enkeltceller. Fordi alle disse hensynene på variasjon er det avgjørende å sammenligne innlemmelse nivåer av cytosolically aktivert proteiner andre steder i cellen i forhold til den totale fluorescensen oppnådd ved aktivering i bestemte regioner.
Vi har beskrevet hvordan microinjection kan brukes som et verktøy for å undersøke effekten av proteiner på celle morfologi og har eksemplifisert dette ved å demonstrere potente induksjon av lamellipodial strukturer i NIH3T3 fibroblast celler microinjected med den små GTPase Rac1. Vi har tidligere brukt denne teknikken for å forstyrre Arp2/3-funksjonen i celler microinjected med C-terminalen WCA domenet Scar/bølge3. Ulike parametere i microinjected celler kan analyseres av andre analyser, for eksempel FRAP eller photoactivation. Vi har beskrevet hvordan FRAP og photoactivation kan benyttes for å undersøke subcellular dynamikk og mobilitet av utgangen monomerer. FRAP har blitt brukt av vår gruppe tidligere5 å undersøke omsetningen av proteiner lokalisere til lamellipodia, som VASP, Abi, cortactin, cofilin, og capping protein eller Klargjørende omsetningen av komponenter i fokal adhesjon i nærvær og fravær av Rac signalering4. Videre måle begrepsordbok polymerisasjon priser kan oppnås ved photobleaching EGFP-merket β-utgangen5, men alternative metoder finnes. Sporing fluorescerende inhomogeneities sett av levende celle imaging-kompatible sonder merking mobilnettet begrepsordbok filamenter, som Lifeact25, kan også være ansatt6,26. Fordelen er at overuttrykte β-utgangen kan unngås, som kan øke celle kanten protrusion og migrasjon, og dermed potensielt forstyrrer den bestemte analysen eller eksperimentelle spørsmål (se f.eks webpakke et al. 26; Peckham et al. 27). men en distinkt ulempe av Lifeact sonden utgjør rapid/på kinetics av binding til utgangen filamenter, slik at bleking begrepsordbok filament strukturer merket av Lifeact i cellene gir informasjon på sonde omsetningen, men ikke omsetningen av utgangen filamenter, som binder det25. Sporing av fluorescens inhomogeneities ansatt tidligere6,26 gir en praktisk kompromiss, mye lik brukte sporing av fluorescens flekker innlemmet i trådformede cellen cytoskjelett strukturer (se f.eks laks og Waterman28), men kanskje ikke så rett frem til bruk og så presis som FRAP EGFP-merket F-utgangen strukturer. Photoactivation har blitt brukt av oss til å estimere antallet monomerisk utgangen inkorporering utstående lamellipodia, i tillegg til sin mobilitet gjennom stoffer i sammenheng med eksperimentelt innstilt cytosolic F-utgangen nivåene6. Teknikken er nyttig når undersøke mobilitet og distribusjon av proteiner avledet fra relativt store områder, for eksempel cytosolic regioner. Imidlertid avledet undersøke fordelingen av proteiner fra relativt liten photoactivated strukturer; f.eks veksten kjeglene kan være utfordrende på grunn av lavt antall fluorescerende molekyler aktivert, svake signaler, og dermed mangel på sensitivitet. Mulige alternativ teknikker for å photoactivation eller photoconversion av fluorescens (se ovenfor) kan inneholde inverse FRAP, som bygger på photobleaching hele cellen unntatt Avkastningen, etterfulgt av sporing mobilitet fluorescerende molekyler unna Denne regionen. Teknikken krever ikke overexpressing photoactivatable versjoner av proteiner, men alltid innebærer eksponering for en uvanlig høy dose av laser makt, potensielt forårsake uønskede bivirkninger som photodamage.
Tydelig, photoactivation og FRAP kan ikke skille om proteiner er bevegelige monomerer, dimers eller selv små oligomers, og om de flytter sammen med ekstra binding partnere. Informasjon av denne typen kan fås i stedet fra fluorescens korrelasjon spektroskopi teknikker29 eller alternativt FLIM-bånd30. Likevel utgjør FRAP og photoactivation enkle metoder for å vurdere direkte lokale og globale protein dynamikk i celler, uavhengig av protein av interesse, subcellular plassering eller celle type studerte.

Overvåking spatiotemporal dynamikken i proteiner og andre molekyler i levende celler har blitt et uunnværlig verktøy på mange felt i cellen og molekylærbiologi. Avanserte fluorescens mikroskopi teknikker inkludert fluorescens resonans energioverføring (bånd) og bånd-fluorescens levetid imaging (bånd-FLIM) eller FRAP fluorescens tap i photobleaching (vende) og photoactivation samt mange andre tillate for timelige og romlig sporing av protein-protein interaksjoner, conformational endringer, samt bestemme the kinetics av diffusjon og lokalisering av ulike proteiner i cellen1,2. FRAP og photoactivation teknikker, spesielt gjelder mye for å undersøke regulatorer av utgangen cytoskjelett og celle migrasjon. Disse teknikkene kan brukes alene eller i kombinasjon med ekstra micromanipulation teknikker som microinjection3, og involverer uttrykk for fluorescently-merket proteiner. De tillater estimering av the kinetics av protein tilknytning til utgangen-rike strukturer involvert i celle migrasjon, for eksempel filopodia eller lamellipodia, omsetningen av proteiner i fokal adhesjon4, eller forgrenet begrepsordbok nettverk5. De kan også bestemme lamellipodial utgangen polymerisasjon priser, vurdering av spredningen av monomerisk utgangen innen stoffer frekvensen av subcellular utgangen monomer translokasjon til polymerizing utgangen filamenter i stikker lamellipodia6, og andre parametere.
FRAP er en metode for å visualisere og kvantifisere mobilitet av proteiner i en levende celle, opprinnelig utviklet i 1970 av Axelrod7. Et område av interesse (ROI) i en celle, med fluorescently-merket proteiner, er transiently utsatt for en laser av høy intensitet, tilstrekkelig til å forårsake bleking av fluorophore molekyler stede i denne regionen under en gitt kort tidsperiode. Den ubleket, fluorescently merket proteiner ligger utenfor Avkastningen under bleking, diffus og infiltrere bleket regionen avhengig av deres spatiotemporal dynamikk, forårsaker forskyvning av photobleached molekyler over tid. Fluorescens utvinning i bleket regioner er avhengig av forskjellige faktorer, blant annet størrelsen og hastigheten av spredningen av et bestemt molekyl, og selvfølgelig sin omløpshastighet innenfor den antatte tilknyttede bleket struktur. Dermed løselig proteiner vil megle utvinning av fluorescens innen bleket Avkastningen raskt gjennom diffusjon, mens proteiner tett knyttet strukturer, for eksempel fokal adhesjon, vil ha lengre omsetning tid, som deres fluorescens utvinning vil avhenge både på spredningen av løselige brøkdel av protein og dissosiasjon-samarbeid kinetics i struktur-assosiert brøken. Fluorescens utvinning er vanligvis ervervet og kvantifisert til første nivå av pre blekemiddel intensiteten av fluorescens er nådd. Men oppstår dette ikke hvis en del av den første fluorescens tilhører den såkalte immobile brøken, som ikke kan fornyes ved diffusjon eller er fylle til meget langsom priser i forhold til fleste av molekylene bestående av mobile brøk. For å bestemme frekvensen av protein omsetning, genereres FRAP kurver som representerer omfanget av fluorescens utvinning over tid. Fra disse utvinning kurver, kan gjennomsnittlig halv-ganger av protein utvinning beregnes. Oppretter kurve passer gjennomsnittlig FRAP dataene, og dermed matematiske analyser, er det også mulig å avgjøre om den gjennomsnittlige omløpshastighet av mobile brøkdel er sammensatt av en homogen befolkningen av molekyler, eller om det er sammensatt av to eller flere subpopulasjoner av molekyler snu på hvordan. I tillegg til å estimere protein omsetning PR av kvantitative metoder, kan sporing utvinning av photobleached områder i lamellipodia også tillate for nøyaktig kvantifisering av lamellipodial motilitet parametre som retrograd flyt, protrusion, og utgangen polymerisasjon priser. Dermed utgjør FRAP et allsidig verktøy som skal brukes for å vurdere ulike parametere i strukturer av levende celler.
Photoactivation er en metode som brukes til å spore spredningen og mobilitet av proteiner eller molekyler som stammer fra et angitt mobilnettet sted. Teknikken bruker, for eksempel en variant av vill-type grønne fluorescerende protein (GFP), opprinnelig utviklet av Patterson og Lippincott-Schwartz8, som er mutert i en måte som tillater sine fluorescens økes svært ved eksponering til ultrafiolett (UV) lys (rundt 400 nm; her, 405 nm). Som beskrevet av Patterson et al., vill-type GFP chromophores eksisterer som en blandet befolkning på nøytral fenoler og anionic phenolates, som produserer en stor absorbansen peak på ca 397 nm og en mindre på 475 nm, henholdsvis. Ved bestråling av protein med UV lys gjennomgår befolkningen photoconversion, skiftende mot skjemaet anionic. Når opphisset av 488 nm, photoconverted/photoactivated protein utstillinger en 3-fold økning i fluorescens, utilstrekkelig i praksis for skille mellom aktivert og ingen-aktivert GFP på grunn av den høye indre bakgrunn fluorescensen. Imidlertid er en nedgang i bakgrunnen intensitet oppnådd ved å innføre en enkelt aminosyre mutasjon i GFP sekvensen (histidin substitusjon på posisjon 203). Den resulterende T203H mutant, også kjent som photoactivatable-GFP (PA-GFP) er preget av en betydelig reduksjon i absorbansen i mindre toppen, som ved bestråling med UV-lys er økt nesten 100-fold når senere opphisset av 488 nm lys. Derfor er overuttrykte PA-GFP-merket proteiner en utbredt tilnærming, som tillater fastsetting av diffusjon og motilitet av molekyler i celler. Vi har tidligere brukt PA-GFP-merket utgangen for å bestemme frekvensen av spredning av utgangen monomerer fra cytosolic områder, slik at ikke bare utforskning av mobilitet i stoffer, men også timepris innlemmelse i den utstikkende lamellipodial utgangen nettverk6. Mer nylig litteratur beskriver også roman, foto-cabriolet proteiner som kan i prinsippet brukes på en tilsvarende måte, men skjuler den potensielle fordelen skal være synlige før Foto-konvertering. Eksempler for denne gruppen av fluorescerende proteiner er Dendra2 og mEos29,10,11,12.
I denne artikkelen forklarer vi metodikk microinjecting celler med proteiner. Videre forklarer vi hvordan denne teknikken kan kombineres med FRAP, ved photobleaching proteiner involvert i utgangen cytoskjelett regulering og motilitet, og hvordan FRAP kurver og pause for gjenoppretting av mobile fraksjoner kan utledes. I tillegg gir vi et eksempel på hvordan FRAP teknikken kan brukes til å bestemme begrepsordbok polymerisasjon priser lamellipodial nettverk. Vi tilbyr også instruksjoner og tips om hvordan du utfører photoactivation eksperimenter, som kan brukes til å bestemme cytosolic mobilitet av monomerisk utgangen og priser til utgangen innlemmelse i lamellipodia. Disse teknikkene, selvfølgelig, er ikke bare begrenset til utgangen cytoskjelett komponenter, men potensielt nødvendig moderat tilpasning eller optimalisering, kan bli mye brukt til andre celletyper, eller for å undersøke ulike proteiner, strukturer, og parametere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

Undersøke spatiotemporal dynamikken i proteiner kan avsløre funksjonell betydning i ulike sammenhenger. I denne artikkelen er det diskutert hvordan fluorescerende utvinning etter photobleaching (FRAP) og photoactivation teknikker kan brukes til å studere spatiotemporal dynamikken i proteiner subcellular steder. Vi viser også hvordan disse teknikkene aktiverer enkelt bestemmelse av ulike parametere knyttet til utgangen cellen cytoskjelett regulering og celle motilitet. Videre beskrives microinjection celler i tillegg som et alternativ behandling (potensielt foregående eller utfyller de nevnte photomanipulation teknikkene) utløse umiddelbar effektene av translocated proteiner på cellen morfologi og funksjon. Micromanipulation som protein injeksjon eller lokal påføring av plasma membran-permeable narkotika eller cellen cytoskjelett hemmere kan tjene som kraftig verktøy registrere umiddelbare konsekvenser for en gitt behandling på cellen oppførsel på enkelt celle og subcellular nivå. Dette er eksemplifisert her ved umiddelbar induksjon av lamellipodial celle kanten protrusion av injeksjon av rekombinant Rac1 protein, som etablerte et kvart århundre siden. I tillegg gir vi en protokoll for å bestemme omsetningen av forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP)-VASP, en utgangen filament polymerase fremtredende samler på lamellipodial tips av B16-F1 celler, sysselsetter FRAP og inkludert knyttet data analyse og montering kurve. Vi presenterer også retningslinjer for å estimere antallet lamellipodial utgangen nettverk polymerisasjon, som eksemplifisert ved celler som uttrykker EGFP-merket β-utgangen. Til slutt, instruksjoner er gitt å undersøke utbredelsen av utgangen monomer mobilitet i cellen cytoplasma, etterfulgt av utgangen innlemmelse i områder av rask filament montering, som tips av utstikkende lamellipodia, med photoactivation tilnærminger. Ingen av disse protokollene er begrenset til komponenter eller regulatorer av utgangen cytoskjelett, men kan enkelt utvides for å utforske i analoge mote spatiotemporal dynamikken og funksjon av proteiner i ulike ulike subcellular strukturer eller funksjonelle sammenhenger.

Figur 1 g h Vis fase kontrast bilder av en NIH3T3 fibroblast celle før og 10 min post microinjection av Rac1, som er en liten Rho-familien GTPase i stand til å indusere lamellipodia formasjon gjennom bransjens samspill med BØLGEN komplekse. Cellen er først visualisert før microinjection (figur 1g), for å bekrefte sin levedyktighet og morfologi, f.eks mangel på lamellipodia. På 10 min post microinjection, har cellen åpenbart endret sin morfologi, som er forventet fra denne behandlingen, og angir en vellykket injeksjon (figur 1h).
For enkelhet og klarhet gir vi neste eksemplarisk resultater for FRAP og photoactivation analyse i celler som ikke er i tillegg microinjected.
Analyse av omsetningen av EGFP-merket VASP på lamellipodium spissen er vist i figur 2a-f. Merk at VASP i tillegg mål å begynnende og focal adhesjon, avlang og små prikker i cellen interiør18,19. Fluorescens intensiteten i et lamellipodial område med en klar VASP akkumulering på spissen var bleket og målt for hvert tidsrom, etter konturene av Avkastningen før, under og etter bleking som lamellipodium stikker fremover. Som bleket EGFP-VASP proteiner resirkuleres ved ikke-bleket molekyler på disse stedene, er gradvis gjenvinning av fluorescens observert (figur 2b). FRAP utvinning kurven innhentet i denne måten og normalisert til pre blekemiddel intensitet (uttrykt som 1) kan ses i figur 2c. Photobleaching effektivitet kan variere og var omtrent 20% av verdien før bleking i dette eksemplet som bestemmes av verdien ved t0 (det første bildet etter photobleaching). Økningen av fluorescens når et platå i eksempelet på omtrent 80% av fluorescens før bleking. I et statisk strukturdiagram i gang løpet av eksperimentet, som en fokal vedheft, forskjellen mellom pre blekemiddel intensiteten og platå fluorescens nådde etter utvinning er definert som immobile brøken (hvis rød pil i figur 2 c, e), mens mengden fluorescens gjenopprettet mellom tidspunktet for bleking og full gjenoppretting er definert som mobile brøken (grønn tohodet pil i figur 2c, e). Merk at i en dynamisk endre struktur som lamellipodium spissen analysert her, omfanget av hvis kan ikke bare representerer immobile molekyler, men også avledet fra en reduksjon i protrusion hastighet, som EGFP-VASP intensitet er kjent for avhengig av denne parameteren18. For å beregne den halve tiden av utvinning, ble en Tilpass kurve opprettet på Sigma tomt (figur 2d). I dette tilfellet verdien for parameteren "b" utvunnet fra løse ligning 2 er lik til 0.0754, som brukes på den logaritmiske funksjonen (ligningen 4) resulterer i en estimert pause for gjenoppretting av 9.19 s (figur 2d , høyre panel), som er relativt raskt i denne bestemt celle i forhold til gjennomsnittet publisert tidligere5. Det må bemerkes at utvinning halv-ganger kan variere betydelig fra celle til celle innen samme populasjon. For å få representativt resultater, anbefaler vi derfor å bestemme denne parameteren som et gjennomsnitt fra minst 15-20 celler. For å illustrere graden av avvik, aritmetiske gjennomsnittene av EGFP-VASP utvinning gjennomsnitt fra 15 celler for hvert tidspunkt ble generert (figur 2e), og gjennomsnittlig kurve passer opprettes og vises på en tilsvarende måte (figur 2 f).
Polymerisasjon frekvensen av lamellipodial utgangen nettverket består av summen av fremover nettverk protrusion og retrograd flyt. FRAP kan brukes for å måle begrepsordbok polymerisasjon frekvensen av transfecting celler (i dette tilfellet B16-F1) med EGFP-merket β-utgangen og photobleaching en fremstående lamellipodial region (figur 2g). For analyse av lamellipodial utgangen nettverk polymerisasjon vurderes fluorescens utvinning på bleking av EGFP-merket β-utgangen over tid. Som polymerisasjon av utgangen monomerer utvikler i piggete endene av lamellipodial utgangen filamenter (som alle peker mot fronten20), er nettverket kontinuerlig translocated rearwards og utvikler seg fremover, priser som kan være lett innhentet gjennom polarisert utvinning av fluorescens på photobleaching. Fluorescens utvinning av lamellipodium er fullført når sonen bleket har nådd sonen overgangen mellom den bakre delen av lamellipodium og lamell, som er preget av lavere tetthet av mer vannrett arrangert filament pakker snu mye saktere enn hva er observert i lamellipodium. Som illustrert i figur 2g, kan fluorescens utvinning visualiseres som en linje som er vannrett kanten og strømme bakover mot lamell, som lar måling avstanden protrusion og retrograd flyt (individuelt representert i det høyre panelet på figur 2g som oransje og rød dobbelthodet pil, henholdsvis).
Vi har også brukt photoactivation i B16-F1 celler transfekterte med PA-GFP-utgangen spore mobiliteten til utgangen monomerer innen stoffer og rate deres selskap innen utstående lamellipodia. Som illustrert i Figur 3a, b, en cytosolic region var photoactivated av eksponering for en 405 nm laser, mens bildene ble anskaffet på GFP kanal hver 1.5 s for å visualisere distribusjon av GFP-merket, photoactivated utgangen. Photoactivated GFP-utgangen kan sees spre av cytosolic regionen i Figur 3b. Frekvensen av fluorescens intensitet reduksjon i regionen photoactivated cytosolic representeres som prosent første intensiteten ved t0 (først-ramme etter photoactivation; Figur 3 c). Photoactivated utgangen kan også integreres på tuppen av lamellipodia, der nye begrepsordbok monomerer legges til voksende piggete ender elongating begrepsordbok filamenter under protrusion. For å anslå lamellipodial selskap, målt vi fluorescens intensiteten over tid en todimensjonal contour/regionen i ca 5 µm i bredde og 1 µm i høyden. regionen var konstant re plassert på spissen av lamellipodium som det utsparinger stakk. Utgangen innlemmelse var representert som prosent fluorescens intensiteten i regionen photoactivated cytosolic ved t0 (Figur 3d). Som forlengelse av utgangen filamenter kommet, ble nye begrepsordbok monomerer innlemmet lamellipodial foran. En brøkdel av disse begrepsordbok monomerer ble stochastically avledet fra cytosolic bassenget der monomerer var photoactivated. Dette resulterer i den raske økningen av fluorescens i lamellipodia i de første 20 s etter photoactivation. Som ny monomerer legges til lamellipodial fronten, tidligere innarbeidet begrepsordbok monomerer flyt med filamenter mot lameller av retrograd flyt. Over tid, Avkastningen er helt fylt med fluorescerende monomerer og et platå i fluorescens nås (Figur 3d). En gradvis nedgang i fluorescens er deretter observert når, etter spredningen av photoactivated monomerer hele cellen, legges ikke-photoactivated utgangen monomerer stadig re til lamellipodial foran. Denne nedgangen i fluorescens finner et nytt platå, som vil bli nådd så snart en saldo i hele cellen mellom photoactivated og ikke-photoactivated monomerer nås (data ikke vist).
Mobiliteten til utgangen monomerer gjennom stoffer avledet ved å måle fluorescens intensiteter i regioner like store plassert distally fra photoactivated regionen (eksemplifiseres på Figur 3et av fargekodet regioner merket R1-R5). Som illustrert i Figur 3e, fluorescens intensitet i hver av disse regionene er gradvis avtagende bort fra den cytosolically photoactivated-regionen, som brøkdel av photoactivated utgangen monomerer blir stadig mer utvannet med ingen-aktivert (dvs. ikke-fluorescerende) monomerer. Videre toppen av fluorescens nås senere: jo mer fjernt målt regionen ligger fra photoactivated regionen, jo lenger tiden som kreves for utgangen monomerer å spre inn i disse regionene. En representant verdi for graden av utgangen monomer infiltrasjon i hver region kan utledes ved kvantifisere halv tid nå fluorescens platået. Jo mer fjernt regionen, jo lenger det tar photoactivated utgangen å spre inn i det, og dermed mer tid er nødvendig for fluorescerende platået nås, til slutt fører til høyere1/2 verdien (Figur 3e).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> Figur 1 : Imaging kammer forsamling og microinjection prosedyre. (en) Imaging kammer komponenter. (b) silikon fett er nøye smurt rundt åpningen av en plastikk tetningsmiddel. (c) i dekkglassvæske er plassert med celle-siden vendt opp inn i sentrum av tenkelig chamber åpning. (d) en sikker segl er etablert ved å plassere den plastikk tetningsmiddel på dekkglassvæske og ved å stramme siden klemmer. (e) mikroskopi medium er pipetted inn i kammeret sporet. (f) tenkelig kammeret er plassert på mikroskopet scenen, varme detektor og elektrodene er knyttet til en oppvarming enhet forhåndsinnstilt til 37 ° C og celler kan tilpasse for minst 30 min før mikroskopi er startet. I dette eksemplet mikroskop scenen er også utstyrt med en micromanipulator for å utføre microinjections og microinjection nålen er dyppet i mediet dekker cellen laget i tenkelig kammeret. (g) et NIH3T3 fibroblast celle er visualisert før microinjection av kontrast mikroskopi. Røde Kors i perinuclear skuffen angir plasseringen av den fremtidige microinjection, som tilsvarer en høy cytoplasmatiske område på grunn av nærheten til store kjernen. (h) 10 min etter microinjection med Rac1, cellen reagerer ved fremtredende dannelsen av lamellipodia rundt hele cellen periferien (angitt med grønne pilene). <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> Figur 2: FRAP lar bfu av protein omsetning eller lamellipodial utgangen polymerisasjon. (en) representant eksempel B16-F1 cellen uttrykke EGFP-VASP før photobleaching av et lamellipodial område som angitt. Forskjellig fargede konturer/figurer er merket for å angi hvilke områder ble vurdert for fluorescens intensitet målinger over tid. Merk den rød konturen merket med et utropstegn, hvilke merker en cytosolic region i et område som inneholder flere blemmer og celle overflaten ruffles. Dynamisk områder som dette bør unngås for å velge regioner fluorescens referanse, som de er preget av sterke kortsiktige svingninger av fluorescens, potensielt forårsake unøyaktige resultater. (b) Lamellipodial regionen EGFP-VASP uttrykke cellen før og etter photobleaching. Utvinning av fluorescerende signal når photobleaching i regionen merket med lilla er visualisert over tid. Pilen viser spissen av en microspike, beriket for VASP trolig på grunn av utgangen filamenter polymerizing det19. (c) et eksempel på en FRAP utvinning kurve som avledet fra kvantifisere fluorescerende intensiteten av photobleached lamellipodium (lilla konturer) i b. røde og grønne linjer til høyre angir henholdsvis immobile og mobile fraksjoner. (d) en tilpasning av FRAP utvinning kurven i c (venstre panel) og et eksempel på beregningsmetoden brukes til å utlede halv gjenopprettingstid (høyre panel). (e) et eksempel på en FRAP utvinning kurve avledet fra snitt fluorescens utvinning kurvene i 15 celler, med SEM stolper som angir spredningsgraden i populasjonsutvalg. (f) en kurve passer avledet fra snitt FRAP utvinning kurve passer 15 celler (venstre panel) og et eksempel på beregningsmetoden brukes til å utlede halv gjenopprettingstid (høyre panel). (g) Time-lapse paneler for utstikkende lamellipodium i B16-F1 cellen uttrykke EGFP-merket β-utgangen før og etter bleking av lamellipodial regionen som er angitt, etterfulgt av fluorescens utvinning i lamellipodium over tid. På høyre panel, verdier målt for protrusion og retrograd avstander tilbys (i oransje og røde, henholdsvis). Beregninger under bildet panelene avslører hvordan summen av protrusion og retrograd avstander brukes til å utlede polymerisasjon rate av lamellipodial utgangen nettverket. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> Figur 3: Photoactivation av PA-GFP-utgangen for monomer sporing gjennom cellen. (en) A representativt eksempel på en B16-F1 celle uttrykke PA-GFP-utgangen før utløser photoactivation i en cytosolic region som angitt av den røde sirkelen (PA). Forskjellig farget konturer er merket for å angi hvilke områder ble vurdert for fluorescens intensitet målinger over tid. (b) en illustrasjon av timelige fordelingen av PA-GFP-utgangen følgende photoactivation. Legg merke til gradvis reduksjon av fluorescens i photoactivated, cytosolic regionen (røde sirkelen), som photoactivated utgangen diffunderer fra det. På grunn av deres diffusjon til fronten og montering i nettverket, er photoactivated utgangen monomerer gradvis forbedret i lamellipodia (cyan-regionen) og hele stoffer (fargekodede regioner) på en avstand - og tidsavhengige måte. (c) representant, timelige nedgangen av fluorescens i photoactivated cytosolic regionen (rød kontur i b). (d) Temporal endringer i fluorescens intensiteten i regionen lamellipodial (cyan konturer i b). (e) kurver representant timelige endringene fluorescens intensitet cytosolic regioner (fargekodet i b) på grunn av posisjonering i variabel avstander fra området av photoactivation. Merk hvordan halv-ganger for å nå fluorescensen platået (angitt i forklaringen til høyre) øke med avstanden gitt regionen til området photoactivation, sannsynligvis samkjøre med den økte ganger nødvendig for spredning av utgangen monomerer i den respektive regionen. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Beskriver vi hvordan mikro- og photomanipulation teknikker som FRAP og photoactivation aktiverer fastsettelse av motilitet parametere og spatiotemporal dynamikken i proteiner i migrere celler. Eksperimentell readouts inkluderer subcellular dynamikk og omsetning av motilitet regulatorer eller underliggende begrepsordbok cytoskeleton.

Micromanipulation teknikker slik at analyse av Morfogenetiske Dynamics og omsetning av cellen cytoskjelett regulatorer

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Phosphopeptide Analyse av gnagere bitestiklenes Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening for å identifisere Ubiquitin og Ubiquitin-lignende system regulatorer av biologiske mekanismer i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‹Å“Touch DNAÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢ Evidence

Forbedret Genetic Analysis of enkelt menneske Bioparticles Gjenn av forenklet Mikromanipulasjon fra Forensic &#39;Touch DNA&#39; Evidence

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høyoppløselig avbildning og analyse av enkelt Astral mikrotubulidynamikk i Budding gjær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel og effektiv administrasjon og visualisering av Microparticles i sirkulasjonssystemet av små fisk med nyre injeksjon

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Programmer Spatio-temporale kartlegging og partikkel analyseteknikker for å kvantifisere intracellulær Ca2 + signalering i Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...