Name: micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Мы признательны для немецкого фонда научных исследований (DFG) для финансовой поддержки (Грант Nr. RO2414/5-1-KR).

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мониторинг динамики пространственно-временных белков и других молекул в живых клетках стала важным инструментом во многих областях клеточной и молекулярной биологии. Расширенный флуоресцентной микроскопии методов, включая передачи энергии резонансной флюоресценции (ЛАДА) и лад Флуоресценция жизни изображений (Лада-FLIM), или FRAP, флуоресценции потери в Фотообесцвечивание (FLIP) и photoactivation, а также многие другие позволяют для временных и пространственных Отслеживание взаимодействий протеин протеина, конформационные изменения, а также определения кинетика диффузии и локализация различных белков в ячейку1,2. FRAP и photoactivation методы, в частности, широко применяются для изучения регуляторов актина цитоскелета и клеточной миграции. Эти методы могут применяться отдельно или в сочетании с дополнительной микроманипуляции методы, такие как микроинъекции3и включать выражение дневно меченых белков. Они позволяют производить оценку кинетики ассоциации белка актин богатых структур участвующих в ячейке миграции, например filopodia или lamellipodia, оборот белков в фокуса спайки4, или разветвленных сетей актина5. Они также дают возможность определения lamellipodial актина полимеризации ставок, оценки дисперсии мономерных актина в цитозоле, скорость субцеллюлярные актина транслокации мономер для полимеризуя филаментов актина в выступающие lamellipodia6и другие параметры.
FRAP — это метод для визуализации и количественной оценки подвижности белков в живой клетке, первоначально разработанная в 1970-х Аксельрод7. Область интереса (ROI) в ячейке, заполненный дневно меченых белков, временно подвергается лазер высокой интенсивности, достаточно, чтобы вызвать отбеливания Флюорофор молекул, присутствующих в этом регионе данный короткий период времени. Небеленой, дневно помечены белки, расположенные за пределами ROI во время отбеливания, диффузный и проникнуть отбеленной региона в зависимости от их пространственно-временных динамика, вызывающих перемещение молекул photobleached с течением времени. Скорость восстановления флуоресцентным в беленой регионах зависит от различных факторов, включая размер и скорость распространения данной молекулы, и конечно его текучести кадров в рамках предполагаемого связанные отбеленной структуры. Таким образом растворимые белки будет посредничать восстановления флуоресцентным в беленой ROI быстро путем диффузии, а белки, тесно связанные с структуры, такие как фокуса спайки, будет иметь больше оборот раз, как их флуоресценции восстановления будет зависеть на диффузии растворимых фракции белков и диссоциации Ассоциация кинетики связанные структуры дроби. Флуоресценции восстановления обычно приобретается и количественно вплоть до начального уровня до отбеливатель интенсивности флуоресценции. Однако это не происходит, если является частью первоначального флуоресценции интенсивности принадлежит к так называемой неподвижной фракция, которая не может быть пополнен путем диффузии или пополнения очень медленными темпами по сравнению с большинство молекул, включая мобильные фракция. Чтобы определить скорость оборота белка, генерируются FRAP кривых, представляющий степень восстановления флуоресценции со временем. От этих кривых восстановления можно рассчитать среднее раза белка восстановления. Создание кривой подходит средний FRAP данных, и следовательно математического анализа, это также можно вывести ли средняя текучесть мобильных фракции представляет собой совокупность одной однородность населения молекул, или же она состоит из два или более субпопуляций молекул, перебирая на дифференциальных ставок. Помимо оценки белка текучесть количественные подходы, отслеживание восстановления photobleached регионов в lamellipodia также можно разрешить для точной количественной оценки параметров подвижности lamellipodial как Ретроградная потока, выступ, и тарифы полимеризацию миозина. Таким образом FRAP представляет собой универсальный инструмент для применяться для оценки различных параметров в пределах структуры живых клеток.
Photoactivation-это метод, используемый для отслеживания диффузии и подвижности белков или молекул, возникая от назначенного сотовой местоположения. Техника использует, например, вариант Зеленый флуоресцирующий белок одичал тип (КГВ), первоначально разработанный Паттерсон и Lippincott-Шварц8, которые мутировали в манере, которая позволяет его флуоресценции сильно возрасти после воздействия ультрафиолетового (УФ) света (около 400 Нм; здесь, 405 нм). Как описано в Паттерсон и др., одичал типа КГВ хромофоры существуют как смешанное население нейтральных фенолов и анионными фенолятам, которые производят крупные поглощения пика примерно 397 Нм и незначительные один на 475 Нм, соответственно. После облучения белка с ультрафиолетовым светом население подвергается photoconversion, смещается в сторону анионной форме. Когда возбуждается 488 нм, белок photoconverted/photoactivated экспонатов вывозимому увеличение в флуоресцировании, недостаточно на практике различие между активирована и неактивированные GFP благодаря высокой внутренней фон флуоресценции. Однако снижение интенсивности фона было достигнуто путем введения единого аминокислоты мутации в последовательность GFP (гистидин замещение позиции 203). Полученный T203H мутант, известный также как photoactivatable-GFP (ПА-GFP) характеризуется значительным снижением поглощения незначительные пик, который после облучения с УФ-излучения увеличивается почти в 100 раз, когда впоследствии возбужденные 488 нм свет. Следовательно гиперэкспрессия PA-GFP-тегами белков является широко используется подход, который позволяет определение диффузии и подвижность молекул в клетках. Мы ранее подали ПА-GFP-тегами актина, чтобы определить скорость рассеяния мономеров актина цитозольной районов, позволяя не только изучение их мобильности в цитозоле, но и уровень их включения в выступающие lamellipodial актина сети6. Более последние литературе также описывает роман, Фото кабриолет белки, которые в принципе могут быть использованы в аналогичных моды, но укрывательство потенциальное преимущество быть видны уже до фото преобразования. Примеры для этой группы флуоресцентных белков включают Dendra2 и mEos29,10,11,12.
В этой статье мы объясним методологии microinjecting клеток с белками. Мы также объяснить, как эта техника может сочетаться с FRAP, Фотообесцвечивание белков, участвующих в регулировании Цитоскелет актина и подвижности, и каким образом могут быть получены FRAP кривых и половина время восстановления мобильных фракций. Кроме того мы предоставляем пример того как FRAP техника может использоваться для определения ставок актина полимеризации lamellipodial сетей. Мы также предоставляем инструкции и советы о том, как выполнять photoactivation экспериментов, которые могут быть использованы для определения цитозольной мобильность мономерных актина и ставки актина включения в lamellipodia. Эти методы, конечно же, являются не только ограничены для отслеживания компонентов Цитоскелет актина, но после оптимизации или потенциально требуется умеренной адаптации, могут широко применяться для других типов клеток, или для расследования различных белков, структур, и параметры.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

Изучение пространственно-временных динамики белков может выявить их функциональное значение в различных контекстах. В этой статье это обсуждается как флуоресцентные восстановления после Фотообесцвечивание (FRAP) и photoactivation методов может использоваться для изучения пространственно-временных динамики белков в субцеллюлярные местах. Мы также показать, как эти методы позволяют простым определение различных параметров, связанных с актина цитоскелета регулирования и ячейки подвижности. Кроме того микроинъекции клеток дополнительно описывается как альтернативное лечение (потенциально предшествующий или дополнить вышеупомянутые добавлены методы) для триггера мгновенного воздействия арестовано белков на ячейку Морфология и функции. Микроманипуляции такие инъекции белков или местное применение плазматической мембраны проницаемой наркотиков или цитоскелета ингибиторов может служить мощным инструментом для записи непосредственных последствий данного лечения на поведение ячеек в одну ячейку и внутриклеточных уровне. Примером этого является здесь немедленной индукции lamellipodial выступ края ячейки путем инъекций рекомбинантных Rac1 белка, как установлено четверть века назад. Кроме того, мы предоставляем протокол для определения оборот расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP)-VASP, полимеразы накаливания актина, заметно накапливается в lamellipodial советы B16-F1 клеток, используя FRAP, включая связанные данные анализ и кривой. Мы также представляем руководящие принципы для оценки показателей lamellipodial актина сети полимеризации, примером чему клетки, выражая EGFP-тегами β-миозина. Наконец даны указания о том, как исследовать показатели актина мономера мобильности в цитоплазме клетки, следуют актина включения на сайты быстрого накаливания Ассамблеи, например советы выступающих lamellipodia, с помощью photoactivation подходы. Ни один из этих протоколов ограничивается компонентами или регуляторы Цитоскелет актина, но может быть легко расширен для изучения в аналогичных моды пространственно-временных динамика и функции белков в различных различных внутриклеточных структур или функциональных контексты.

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Мы опишем, как микро - и добавлены методы, такие как FRAP и photoactivation включить определение параметров подвижности и пространственно-временных динамики белков внутри миграции клеток. Экспериментальная отсчетов включают субцеллюлярные динамика и оборот регуляторов подвижности или базовой Цитоскелет актина.

Микроманипуляции методы, позволяя анализ морфогенетических динамики и оборот цитоскелета регуляторов

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis и Микроманипуляция для Прижизненное флуоресценции микроциркуляции

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Отслеживание Деформации Морфогенетические тканей в раннем куриного эмбриона

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Phosphopeptide Анализ грызунов придатка яичка сперматозоидов

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

миРНК Скрининг для идентификации Убиквитин и Убиквитин-подобной системе регуляторов биологических путей в культивируемых клетках млекопитающих

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‹Å“Touch DNAÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢ Evidence

Улучшенная Генетический анализ одного человека Bioparticles извлечены с помощью упрощенной Микроманипуляция от судебно-медицинской экспертизы на ощупь ДНК »

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Изображения с высоким разрешением и анализ индивидуальной астральных микротрубочек динамики в почкующихся дрожжах

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Приложения пространственно временных карт и методы анализа частиц для количественного определения внутриклеточных Ca2 + сигнализации в Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...