Name: micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Vi är tacksamma att de tyska Research Foundation (DFG) finansiellt stöd (bidrag Nr. RO2414/5-1 till KR).

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Här diskuterar vi kritiska steg i de tekniker som beskrivs i denna artikel, och hur de kan optimeras för tillämpning i olika experimentella förhållanden.
Mikroskop är en metod som kan användas för att övervaka i celler instant effekterna från att införa exogena proteiner, hämmare eller läkemedel. Det kan vara särskilt fördelaktigt för att bestämma funktionerna av proteiner i svårt att transfect celltyper eller i situationer när långvarigt uttryck inte är önskvärd. Det måste noteras att överlevnaden för vissa celltyper varierar beroende på den extracellular matrisen de är seedade på. Mest endothelial, epitelial eller fibroblast-liknande celltyper, även de små gillar fisk keratocyter (se Dang o.a. 21 och Anderson och Cross22) kan injiceras framgångsrikt. Det finns dock undantag, såsom B16-F1 celler dirigeras till laminin, som utgör en utmärkt modellsystem av cellmigration, men är inkompatibla med injektion på denna typ av underskikt av okänd anledning. För NIH3T3 fibroblast celler utför vi rutinmässigt injektioner på Fibronektin underskikt och ytterligare photomanipulation tekniker såsom FRAP (även med ljusaktivering; visas för B16-F1 celler här) lika väl kan utföras i dessa fibroblaster (se t.ex. Köstler et al. 3). det måste också beaktas att olika proteiner, enligt deras funktionella egenskaper och mål som experiment, kan ta olika lång tid att orsaka förändringar, varierande från sekunder till timmar. En fördel med tekniken är att dos eller koncentration av exogena agent kan kontrolleras mer exakt på enstaka cellnivå än e.g., när du använder plasmid transfection. Dessutom är fluorescerande taggning av ett protein inte en nödvändighet för att garantera dess närvaro i cellen, vilket kan öka flexibilitet om samtidiga Multi-Channel visualisering av andra fluorescently-taggade proteiner krävs. Mikroskop kan vara särskilt användbart för att analysera omedelbar verkan av specifika proteiner eller protein blandningar på dynamiska förändringar av cellmorfologi eller cellskelettet (t.ex. Dang o.a. 21 exempel på omedelbara effekter på migration av den komplexa Arp2/3-hämmaren Arpin). En nackdel med tekniken är dess invasivt, som kan orsaka cellskador eller påverka cellmorfologi. Därför en viktig faktor när du utför microinjections övervakning av cellernas viabilitet. Metoden införs här förlitar sig på manuell manipulation. I villkor som testats för att vara kompatibel med framgångsrika injektioner, såsom fibroblaster växer på Fibronektin underskikt, tillåter manuell injektion protokollet beskrivs här en nära 100% framgång; Detta är viktigt när man kombinerar detta tillvägagångssätt med sofistikerade och tidskrävande uppföljande experiment inklusive video mikroskopi eller FRAP, som publicerats tidigare3. Detta utesluter inte att ibland, enskilda celler kan drabbas av en Mikroskop händelse, som säkert kan erkännas av plötsliga förändringar av kontrast både kärnan och cytoplasman, följt av cell kanten dementi. Sådana sällsynta experimentella fall är uteslutna och således inte anses för ytterligare analyser.
Dock en halv-automatisk inställning är också ofta används, till exempel anställa snabb (< 300 ms) maskin-kontrollerade nål sänka sammanfallande med injektion tryckökning, så att nålen har endast ska placeras ovanför varje cell före respektive injektion. Framgången av halv-automatiska injektioner är definitionsmässigt lägre än den manuella metod som beskrivs ovan, helt enkelt eftersom det är optimerat för hastighet, följt av analys av flera celler som framgångsrikt överlevde denna behandling; således förlitar det sig inte på framgångsrika injektion av en enskild cell. Därför, i motsats till enstaka cell analys, halv-automatiska injektioner är bättre lämpade för att analysera injektion effekter av flera hundra celler, t.ex. med hjälp av video mikroskopi låg förstoring eller vid cell fixering och färgning. Oavsett detaljerad ämnescentrum, Mikroskop utgör inte en slutpunkt analys, men kan kombineras med en mängd olika tekniker, inklusive FRAP eller ljusaktivering3.
Vid bestämning av protein Omsättningshastigheten av FRAP, intensiteten i lasern måste optimeras, beroende på mikroskopet setup och imaging (förstoring, mål, etc., samt den celltyp, struktur och fluorescerande protein för fotoblekning). Observera att vid optimal lasereffekt, effektiv blekning kombineras med de minsta möjliga åldrad hud, för att undvika krympning eller fullständig indragning av struktur under analys (t.ex. lamellipodia eller filopodia) eller även skador på cellnivå. Helst bör minst 70 – 80% av blekning effektivitet uppnås, även om fullständig blekning kan hämmas av extremt snabb omsättning av protein, i vilket fall, något över 50% kan också vara godtagbar. Optimal blekning effekt för en given struktur och fluorescerande färg bör testas experimentellt, start från en låg lasereffekt följt av dess gradvisa ökning. Naturligtvis någon fluorescerande färgämne kan definitionsmässigt vara blekt med laserljuset som nära sin topp av excitation (488 nm för vanliga gröna färgämnen som FITC eller andra). Men lasrar med kortare våglängder, såsom nära-UV lasrar, leverera högre makter och kan således även användas för effektiv blekning av vanliga färgämnen. Vi använder rutinmässigt en 405 nm diode laser (120 mW) för blekning av både andra och röd fluorescerande färgämnen (t.ex. mCherry), om än med något lägre effektivitet vid den sistnämnda (inga data anges). 405 nm-dioden kan också användas för ljusaktivering av PA-GFP (se nedan), begåvar det detta system med maximal flexibilitet.
B16-F1 cellstrukturer och fluorescerande proteiner photobleached här tillämpades 405 nm-laser befogenheter mellan 65 – 100 mW. När analysera en photobleached region, är det viktigt att överväga huruvida den given strukturen bevaras i sin ursprungliga form över analysen tidsperiod. Exempelvis när man analyserar omsättningen av proteiner på lamellipodia tips, bör försiktighet iakttas om krökningen av lamellipodia är påtagligt förändras över tid, eftersom förändringar i krökning kan leda till felaktiga resultat om regionen/konturen analyseras inte fullt ut omfatta hela strukturen i varje uppmätt ram. Det bör dessutom noteras att buntar inbäddade i lamellipodia, såsom microspikes, kan orsaka avvikelser i fluorescensintensiteten. Som illustreras i figur 2b (vit pil i 9 s tid stomme), en microspike-liknande struktur ligger intill regionen uppmätta photobleached, men är fortfarande utanför den under hela mätningen, och därmed orsakar inte någon felaktighet. För analys av protein omsättningen är viktiga överväganden när du väljer plats och storlek för analyserat regioner att deras fluorescens över tid inte bör påtagligt påverkas av förändringar i cellmorfologi eller faktorer annat än hårt att undvika förvärv fotoblekning. Exempelvis bör strukturer som tillhandahåller betydande kvantitativa bidrag till den analyserade strukturen inte flytta ut ur den uppmätta regionen under analys; Dessutom bör icke-närstående, fluorescerande enheter såsom vesikulär strukturer som attraherar proteinet inte ange fältet sevärdheter under analysen. För att fastställa lamellipodial aktin polymerisation, bör försiktighet iakttas att analyseras ingen SRL-block eller arruffano (dvs uppåt vikning) lamellipodia, eftersom detta kommer att starkt påverka noggrannheten i resultaten. Dessutom, indragning av lamellipodial regioner kan visas som snabb bakåt translokation, vilket kan leda till överskattning av andelen lamellipodial aktin polymerisation. En ytterligare faktor är avståndet av intracellulära normalisering regioner (tas som referens positioner för korrigering av förvärvet fotoblekning) från den faktiska positionen av fotoblekning, som bör vara tillräckligt stor för att undvika direkt påverka genom området photobleached.
När du skapar optimala förhållanden för ljusaktivering av PA-GFP-märkta konstruktioner, bör vara försiktig att undvika omedelbar blekning under ljusaktivering. I vårt arbete, bästa resultat erhölls med laser befogenheter 5 - 10 gånger lägre än normalt anställd för blekning av andra. För bild förvärv av photoactivated molekyler, bör exponeringstid och tidsintervallet mellan ramar optimeras genom beaktande av storleken på regioner och strukturer för att vara photoactivated och analyseras, liksom potentiella rörlighet för photoactivated proteiner till andra subcellulär platser. När det gäller alla typer av fluorescens imaging är underhåll av cellernas viabilitet avgörande för att erhålla fysiologiskt relevanta resultat.
Grön-till-röd photoconversion av fluorescerande proteiner såsom mEos eller Dronpa varianter12 utgör i princip en lika kraftfull metod för följande dynamics och omsättning av subcellulära strukturer såsom lamellipodium (se t.ex. Burnette o.a. 23). fördelen med den senare metoden i motsats till PA-GFP skulle finnas möjlighet att följa protein dynamics före och efter konvertering med två olika färger, utan att behöva tillsammans uttrycker en ytterligare röd fluorescerande proteiner. I våra preliminära experiment var omfattningen av kontrast förändring och intensitet av fluorescerande signal uppnås vid ljusaktivering av PA-GFP dock större jämfört med photoconverted sonder, kanske på grund av de överlägsna spektrala funktionerna gröna kontra röd fluorescerande sonder (inga data anges). I varje fall har detaljerade studier på aktin filament omsättning i cell-kant utskjutande delar såsom lamellipodia eller Vaccinia virus-inducerad aktin svansar hittills endast publicerats med PA-GFP derivat5,6,24.
När man överväger vilken cell region att analysera efter ljusaktivering, flera faktorer bör beaktas, vilket diskuteras med hjälp av det specifika exemplet som visas här (införlivande av aktin monomerer i cell kanten vid aktivering i cytosolen), men kan säkerligen extrapoleras till olika motsvarande vetenskapliga problem. Först, vid mätning av lamellipodial införlivandet av cytosolically photoactivated proteiner, exempelvis i olika experimentella villkor (som visas i Dimchev et al. ( 6), storlekar på cytosoliska regioner och deras avstånd till lamellipodial kanter ska vara jämförbara mellan experimentella grupper. Det är också viktigt att beakta att när photoactivating cytosoliska regioner, cell tjocklek är större i positioner närmare till kärnan. Aktivera tjockare cellulära regioner kan resultera i högre mängder aktiverade proteiner, med tanke på att fördelningen av proteinet aktiveras distribueras likartad i cytosolen. Slutligen kan uttrycket nivåer av proteinet aktiveras säkert vara mycket varierande i enskilda celler. På grund av alla dessa överväganden av variabilitet är det viktigt att jämföra införlivandet nivåer av cytosolically aktiverade proteiner någon annanstans i cellen i förhållande till den totala fluorescens som erhålls vid aktivering i specifika regioner.
Vi har beskrivit hur Mikroskop kan användas som ett verktyg för att undersöka effekterna av proteiner på cellmorfologi och har exemplifierat detta genom att Visa potent induktion av lamellipodial strukturer i NIH3T3 fibroblast celler microinjected med den små GTPase Rac1. Vi har tidigare tillämpat denna teknik för att störa Arp2/3 funktion i cellerna microinjected med C-terminal WCA domänen för ärr/WAVE3. Olika parametrar i microinjected celler kan analyseras med andra analyser, såsom FRAP eller ljusaktivering. Vi har beskrivit hur FRAP och ljusaktivering kan användas för att utreda subcellulär dynamik och rörlighet av aktin monomerer. FRAP har använts av vår grupp tidigare5 att undersöka omsättningen av proteiner lokalisering till lamellipodia, såsom VASP, Abi, cortactin, cofilin, och tak protein eller belysa omsättningen för komponenter i focal sammanväxningar i närvaro och avsaknad av Rac signalering4. Dessutom mäta aktin polymerisation priser kan åstadkommas av fotoblekning andra-taggade β-aktin5, men det finns alternativa metoder. Spårning fluorescerande inhomogeneities som ses av levande cell imaging-kompatibel sonder märkning cellulära aktin filament, såsom Lifeact25, kan också vara anställd6,26. Fördelen här är att överuttryck av β-aktin kan undvikas, vilket är kan öka cellen kanten utstick och migration, och därmed potentiellt stör den specifika test eller experimentella frågan (se t.ex. Kage o.a. 26. Peckham o.a. 27). dock ett tydligt underläge Lifeact sondens utgör dess snabba tvåläges nedbrytnings-och urlakningshastighet bindning till aktin filament, så att blekning av aktin filament strukturer märkt av Lifeact i celler innehåller information endast om sonden omsättning, men inte omsätter aktin filament, som det binder25. Spårning av fluorescens inhomogeneities anställd tidigare6,26 ger en praktisk kompromiss, mycket lik till allmänt använda spårning av fluorescens prickar införlivas med fintrådiga cytoskeletal strukturer (se exempelvis lax och Waterman28), men kanske inte så rakt framåt att använda och så exakt som FRAP av andra-taggade F-aktin strukturer. Ljusaktivering har tillämpats av oss för att uppskatta andelen monomer aktin införlivande med utskjutande lamellipodia, liksom dess rörlighet i hela cytosolen, i ramen för experimentellt trimmad cytosoliska F-aktin nivåer6. Tekniken är användbar när undersöker rörlighet och distribution av proteiner härrör från relativt stora områden, såsom cytosoliska regioner. Emellertid kommer att undersöka fördelningen av proteiner från relativt små photoactivated strukturer. t.ex. tillväxt kottar kan vara utmanande på grund av det låga antalet fluorescerande molekyler aktiveras svaga signaler och därmed brist på känslighet. Potentiella alternativa tekniker att ljusaktivering eller photoconversion av fluorescens (se ovan) kan inkludera inversen FRAP, som bygger på fotoblekning hela cellen utom den ROI, följt av spårning av fluorescerande molekyler ifrån rörlighet denna region. Tekniken kräver inte överuttryck av photoactivatable versioner av proteiner, men alltid kommer att medföra exponering för en ovanligt hög dos av lasereffekten, potentiellt orsaka oönskade biverkningar såsom photodamage.
Tydligt, ljusaktivering och FRAP kan inte skilja på om proteiner är rörliga som monomerer, dimerer eller även små oligomerer och om de flyttar i kombination med ytterligare bindande partner. Information av detta slag kan erhållas i stället från fluorescens korrelation spektroskopi tekniker29 eller, alternativt, FLIM-bandet30. Dock utgör FRAP och ljusaktivering enkla metoder för att direkt bedöma lokala och globala protein dynamics i celler, oberoende proteinet av intresse, subcellulär läge eller celltyp studerade.

Övervakning spatiotemporal dynamiken av proteiner och andra molekyler i levande celler har blivit ett viktigt verktyg inom många områden för cell- och molekylärbiologi. Advanced fluorescence mikroskopi tekniker inklusive fluorescens resonans energiöverföringen (bandet) och bandet-fluorescens livstid imaging (bandet-FLIM) eller FRAP, fluorescens förlust i fotoblekning (FLIP) och ljusaktivering samt många andra tillåta för den tidsmässiga och rumsliga spårning av protein-protein interaktioner, konfirmerande förändringar, samt att fastställa kineticsen av diffusion och lokalisering av olika proteiner i cellen1,2. FRAP och ljusaktivering tekniker, i synnerhet, är allmänt tillämplig för prövningen av regleringsmyndigheter aktin cytoskelettet och migrationen. Dessa tekniker kan användas ensamt eller i kombination med ytterligare mikromanipulation tekniker såsom Mikroskop3och involvera uttrycket av fluorescently-märkta proteiner. De tillåter skattning av kineticsen av protein association till aktin-rika strukturer involverade i cellmigration, till exempel filopodia eller lamellipodia, omsättningen av proteiner i focal sammanväxningar4, eller Grenade aktin nätverk5. De möjliggör även bestämning av lamellipodial aktin polymerisation priser, bedömningen av spridningen av monomer aktin i cytosolen, graden av subcellulär aktin monomer flyttning till polymeriserande aktin filament i utskjutande lamellipodia6, och andra parametrar.
FRAP är en metod för visualisering och kvantifiering av proteiner inom en levande cell, ursprungligen utvecklades på 1970-talet av Axelrod7rörlighet. En region av intresse (ROI) i en cell, befolkade med fluorescently-märkt proteiner, är övergående utsätts för laserstrålning av hög intensitet, tillräckligt för att orsaka blekning av de fluorophore molekylerna som finns i denna region under en viss kort tid. Den oblekta, fluorescently märkt proteiner som ligger utanför ROI under blekning, kommer diffus och infiltrera regionen blekt beroende på deras spatiotemporal dynamik, orsakar förskjutningen av photobleached molekyler över tid. Fluorescens återhämtningstakten i blekt regioner är beroende av olika faktorer, inklusive storleken och graden av spridning av en viss molekyl, och naturligtvis dess omsättningshastighet inom den förmodade tillhörande blekt struktur. Således, lösliga proteiner kommer medla återvinning av fluorescens inom blekt ROI snabbt genom diffusion, medan proteiner tätt förknippad med strukturer, såsom fokal sammanväxningar, kommer att ha längre omsättning gånger, liksom deras fluorescens återhämtning bero både på diffusionen av den lösliga fraktionen av protein och dissociation-föreningen kineticsen av den struktur-associerade fraktionen. Fluorescens återhämtning är oftast förvärvat och kvantifierade tills den ursprungliga nivån före blekmedel intensitet av fluorescens nås. Detta uppstår emellertid inte om en del av den ursprungliga fluorescensintensiteten tillhör den så kallade orörliga fraktionen, som inte kan fyllas genom diffusion eller är påfyllning i mycket långsam takt jämfört med majoriteten av molekyler som består av mobilen fraktion. För att bestämma protein Omsättningshastigheten, genereras FRAP kurvor, som representerar omfattningen av fluorescens återhämtning över tid. Från dessa återhämtning kurvor, kan genomsnittliga halv-gånger av protein återvinning beräknas. Genom att skapa kurva passar genomsnittliga FRAP uppgifter och därmed matematiska analyser, är det också möjligt att dra slutsatsen huruvida genomsnittliga omsättningshastigheten för mobila fraktionen utgör en sammansatt av en homogen population av molekyler eller om den består av två eller flera subpopulations av molekyler som välter differential och billigt. Förutom att beräkna protein omsättningen priser av kvantitativa metoder, kan spårning återvinning av photobleached regioner i lamellipodia också tillåta för exakt kvantifiering av lamellipodial motilitet parametrar såsom retrograd flöde, utstick, och aktin polymerisation priser. FRAP utgör således, ett mångsidigt verktyg som skall tillämpas för bedömning av olika parametrar inom strukturer av levande celler.
Ljusaktivering är en metod som används för att spåra diffusion och rörlighet av proteiner eller molekyler med ursprung från en cellulär plats. Tekniken använder, till exempel en variant av vildtyp grönt fluorescerande protein (GFP), ursprungligen utvecklad av Patterson och Lippincott-Schwartz8, som är muterad i ett sätt som tillåter dess fluorescens ökas starkt vid exponering för ultraviolett (UV) ljus (omkring 400 nm; här, 405 nm). Som beskrivs av Patterson et al., vildtyp GFP chromophores existera som en blandad befolkning av neutrala fenoler och anjoniska phenolates, som producerar en större absorbansen peak på cirka 397 nm och en mindre sådan 475 nm, respektive. Vid bestrålning av proteinet med UV-ljus genomgår befolkningen photoconversion, skiftande mot anjon form. När upphetsad av 488 nm, photoconverted/photoactivated protein uppvisar en 3-faldig ökning i fluorescens, otillräcklig i praktiken skilja mellan aktiverad och icke-aktiverade GFP på grund av den höga inneboende bakgrund fluorescensen. Dock har en minskning i bakgrunden intensitet uppnåtts genom att införa en enda aminosyra mutation i sekvensen GFP (histidin substitution på plats 203). Den resulterande T203H mutant, även känd som photoactivatable-GFP (PA-GFP) kännetecknas av en betydande minskning av absorbansen av mindre toppen, som vid bestrålning med UV-ljus ökar nästan 100-fold när därefter upphetsad av 488 nm ljus. Överuttryck av PA-GFP-märkta proteiner är därför en allmänt använd metod, som tillåter fastställande av diffusion och motilitet molekyler inom celler. Vi har tidigare tillämpat PA-GFP-märkta aktin för att avgöra graden av spridning av aktin monomerer från cytosoliska regioner, så att inte bara utforskning av deras rörlighet inom cytosolen, men också deras iblandningen i de utskjutande lamellipodial aktin nätverk6. Nyare litteratur beskrivs också roman, Foto-Cabriolet proteiner som kan i princip användas på ett liknande sätt, men härbärgerat den potentiella fördelen för att synas redan före foto-konvertering. För denna grupp av fluorescerande proteiner exempel Dendra2 och mEos29,10,11,12.
I den här artikeln förklarar vi metodiken av microinjecting celler med proteiner. Vi ytterligare förklara hur denna teknik kan kombineras med FRAP, av fotoblekning proteinerna som är inblandade i aktin cytoskelettet förordning och motilitet, och hur FRAP kurvor och halvtid på återhämtning av mobila fraktioner kan härledas. Dessutom ger vi ett exempel på hur FRAP tekniken kan användas för att fastställa aktin polymerisation av lamellipodial nätverk. Vi ger också instruktioner och tips på hur du utför ljusaktivering experiment, som kan användas för att bestämma cytosoliska rörlighet av monomer aktin och priser av aktin införlivande i lamellipodia. Dessa tekniker, naturligtvis, är inte bara begränsat till spårning aktin cytoskelettet komponenter, men vid potentiellt krävs måttlig anpassning eller optimering, kan i stor utsträckning till andra celltyper eller undersöka olika proteiner, strukturer, och parametrar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

Att undersöka spatiotemporal dynamiken av proteiner kan avslöja deras funktionella betydelse i olika sammanhang. I denna artikel är det diskuteras hur fluorescerande återhämtning efter fotoblekning (FRAP) och ljusaktivering tekniker kan användas för att studera spatiotemporal dynamiken av proteiner i subcellulär platser. Vi visar också hur dessa tekniker möjliggör enkel bestämning av olika parametrar kopplade till aktin cytoskeletal förordning och cell motilitet. Dessutom beskrivs Mikroskop av celler dessutom som en alternativ behandling (potentiellt föregår eller komplettera de tidigare nämnda photomanipulation teknikerna) till trigger momentana effekter av flyttade proteiner på cell morfologi och funktion. Mikromanipulation såsom protein injektion eller lokala tillämpningen av plasmamembran-permeable droger eller cytoskeletal hämmare kan fungera som kraftfullt verktyg för att spela in omedelbara konsekvenserna av en viss behandling på cell beteende vid den enda cellen och subcellulär nivå. Detta exemplifieras här genom omedelbar induktion av lamellipodial cell kanten utstick genom injektion av rekombinant Rac1 protein, som etablerade ett kvarts sekel sedan. Dessutom kan vi tillhandahålla ett protokoll för fastställande av omsättningen för förbättrad grönt fluorescerande protein (andra)-VASP, en aktin filament polymeras framträdande ackumulera lamellipodial tips av B16-F1 celler, anställa FRAP och inklusive tillhörande data analys och kurva montering. Vi presenterar också riktlinjer för skattning av lamellipodial aktin nätverk polymerisation, som exemplifieras av celler som uttrycker andra-taggade β-aktin. Slutligen ges instruktioner för hur du undersöker av aktin monomer rörlighet inom cellens cytoplasma, följt av aktin införlivandet på platser av snabba glödtråden församling, såsom tips av utskjutande lamellipodia, med hjälp av ljusaktivering tillvägagångssätt. Ingen av dessa protokoll är begränsad till komponenter eller regulatorer av aktin cytoskelettet, men kan lätt utvidgas för att utforska i analog mode spatiotemporal dynamik och funktion av proteiner i olika olika subcellulära strukturer eller funktionella sammanhang.

Figur 1 g h Visa fas kontrast bilder av en NIH3T3 fibroblast cell tidigare och 10 min efter Mikroskop av Rac1, som är en liten Rho-familjen GTPase kan framkalla lamellipodia bildning genom sin samverkan med våg som är komplexa. Cellen är först visualiseras innan Mikroskop (figur 1g), för att bekräfta dess livskraft och morfologi, t.ex., brist på lamellipodia. På 10 min efter Mikroskop förändrats cellen klart dess morfologi, som förväntas från denna behandling, och anger en lyckad injektion (figur 1h).
För enkelhet och tydlighet ger vi nästa föredömligt resultat för FRAP och ljusaktivering analys i celler, som inte har varit dessutom microinjected.
Analys av andra-taggade VASP vid lamellipodium spets omsättning visas i figur 2a-f. Observera att VASP i tillägg mål till begynnande och fokal sammanväxningar, liten och avlång prickar i cell interiör18,19. Fluorescensintensiteten hos en lamellipodial region med en tydlig VASP ackumulering vid spetsen var blekt och mätt för varje tidsram, genom att följa konturen av ROI före, under och efter blekning som lamellipodium sticker framlänges. Som blekt andra-VASP proteiner återvinns av icke blekt molekyler på dessa platser, observeras gradvis återhämtning av fluorescens (figur 2b). FRAP återhämtning kurvan erhållits på detta sätt och normaliserad före blekmedel intensiteten (uttryckt som 1) kan ses i figur 2c. Fotoblekning effektivitet kan variera och var cirka 20% av värdet före blekning i det här exemplet som bestäms från värdet vid t0 (den första bildrutan efter fotoblekning). Ökningen av fluorescens når en platå i exemplet på ungefär 80% av fluorescensen före blekning. I en statisk struktur under tiden av experimentet, såsom en fokal vidhäftning, skillnaden mellan pre blekmedel intensiteten och platå fluorescensen nådde efter återvinning definieras som den orörliga fraktionen (om, röda pilen i figur 2 c, e), medan mängden fluorescens återhämtade mellan tidpunkten för blekning och full återhämtning definieras som den mobila fraktionen (gröna dubbelpil i figur 2c, e). Observera att i en dynamiskt föränderliga struktur såsom den lamellipodium spetsen analyseras här, omfattningen av om kanske inte bara representerar orörliga molekyler, men också härleda från en minskning av utstick hastighet, som andra-VASP intensitet kallas att bero på detta parametern18. För att beräkna halvtid av återhämtning, skapades en fit kurva på Sigma tomt (figur 2d). I detta fall värdet på parametern ”b” som utvinns från att lösa ekvation 2 är lika 0.0754, som när tillämpas till den logaritmiska funktionen (ekvation 4) resulterar i en beräknad halvtid av återvinning av 9,19 s (figur 2d , längst till höger panel), som är relativt snabbt i denna särskilda cell jämfört med genomsnittet i tidigare publicerade5. Det måste noteras att återhämtning halv-gånger kan ibland variera betydligt från cell till cell i samma population. För att erhålla representativa resultat, rekommenderar vi därför att bestämma denna parameter som ett genomsnitt från minst 15-20 celler. För att illustrera graden av variansen, aritmetiska medelvärdena av andra-VASP återhämtning i genomsnitt från 15 celler för varje tidpunkt var genererade (figur 2e), och genomsnittlig kurva passar skapas och visas i ett liknande sätt (figur 2 ( f).
Polymerisation andelen lamellipodial aktin nätverket består av summan av vidarebefordra utstick och retrograd flöde. FRAP kan tillämpas för att mäta andelen aktin polymerisation av transfecting celler (i detta fall B16-F1) med andra-taggade β-aktin och fotoblekning en utskjutande lamellipodial region (figur 2g). För analys av lamellipodial aktin nätverk polymerisation bedöms fluorescens återhämtning vid blekning av andra-taggade β-aktin över tid. Som polymerisation av aktin monomerer fortskrider i taggtråd ändarna av lamellipodial aktin filament (som alla pekar mot den främsta20), är nätverket ständigt flyttade bakåt och framåt framlänges, som kan vara enkelt erhållits genom polariserade återvinning av fluorescens vid fotoblekning. Fluorescens återvinning av lamellipodium är klar så snart blekt zonen har nått i övergångszonen mellan den bakre delen av lamellipodium och lamellerna, som kännetecknas av en lägre täthet av mer horisontellt-ordnat glödtråden buntar välter mycket långsammare än vad som observerats i lamellipodium. Som illustreras i figur 2g, kan fluorescens återhämtning visualiseras som en linje som är vågrät mot kanten och flöda bakåt mot lamellerna, vilket gör att mäta avstånden till utstick och retrograd flöde (individuellt representerade på panelen längst till höger i figur 2g som orange och röd dubbelriktad pilar, respektive).
Vi har också tillämpat ljusaktivering i B16-F1 celler transfekterade med PA-GFP-aktin att spåra av aktin monomerer i cytosolen rörlighet och den deras inblandningsprocent inom utskjutande lamellipodia. Som illustreras i figur 3a, b, en cytosoliska region var photoactivated av exponering för en 405 nm laser, medan bilder förvärvades på GFP kanal varje 1,5 s för att visualisera fördelningen av GFP-märkta, photoactivated aktin. Photoactivated GFP-aktin kan ses sprida ut ur regionen cytosoliska i figur 3b. Graden av fluorescens intensitet minskning i regionen photoactivated cytosoliska representeras som procentandelen av den ursprungliga intensiteten vid t0 (först Rama efter ljusaktivering; Figur 3 c). Photoactivated aktin integrerar även vid spetsarna på lamellipodia, där nya aktin monomerer läggs till växande hullingförsedda ändarna av elongating aktin filament under utstick. För att uppskatta graden av lamellipodial införlivande, mätte vi fluorescensintensiteten över tid av en tvådimensionell contour/regionen ca 5 µm i bredd och 1 µm i höjd; regionen var ständigt åter placerad på spetsen av lamellipodium som det stack. Aktin inkorporering föreställdes som andelen fluorescensintensiteten av regionen photoactivated cytosoliska vid t0 (figur 3d). Som töjning av aktin filament fortskred, införlivades nya aktin monomerer framtill lamellipodial. En bråkdel av dessa aktin monomerer härrör stochastically från cytosoliska poolen där monomerer var photoactivated. Detta resulterar i den snabba ökningen av fluorescens i lamellipodia i de första 20 s efter ljusaktivering. Som nya monomerer läggs till lamellipodial fronten, tidigare bildat aktin monomerer flöde med filament mot lamellerna av retrograd flöde. Över tiden, ROI är helt fyllt med fluorescerande monomerer och en platå i fluorescens nås (figur 3d). En gradvis nedgång i fluorescens observeras sedan när, efter spridning av photoactivated monomerer i hela cellen, läggs icke-photoactivated aktin monomerer alltmer åter till lamellipodial framsidan. Denna minskning av fluorescens hittar en ny platå, som kommer att slutas så snart en balans i hela cellen mellan photoactivated och icke-photoactivated monomerer nås (inga data anges).
Rörligheten av aktin monomerer i hela cytosolen härleddes genom att mäta fluorescens stödnivåer i regioner av lika storlek placerade distalt från regionen photoactivated (exemplifieras på figur 3en av färgkodade regioner märkt R1-R5). Som illustreras i figur 3e, fluorescensintensiteten i alla dessa regioner minskar gradvis bort från den cytosolically photoactivated-regionen, som fraktionen av photoactivated aktin monomerer blir alltmer utspädd med icke-aktiverade (dvs. icke-fluorescerande) monomerer. Dessutom toppen av fluorescens nås senare: ju mer avlägsen uppmätta regionen är belägen från regionen photoactivated, ju längre tid som krävs för aktin monomerer till diffus i dessa regioner. Ett representativt värde för graden av aktin monomer infiltration i varje region kan härledas genom att kvantifiera halva tiden för att nå platån fluorescens. Ju mer avlägsen regionen, desto längre tid det tar för photoactivated actin till diffunderar in det, och därmed mer tid krävs för fluorescerande platån som ska nås, vilket slutligen leder till ett högre värde för t-1/2 (figur 3e).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> Figur 1 : Imaging kammare montering och Mikroskop förfarande. (en) Imaging kammare komponenter. (b), silikon fett är noggrant kladdig runt öppningen av en plast sealer. (c) täckglaset placeras med cell-vänd in i centrera av imaging kammaren öppning. (d) en säker tätning är etablerad genom positionering plast sealer ovanpå täckglaset och skärpning sida klämmorna. (e), mikroskopi medium är pipetteras i kammaren inkastet. (f), imaging kammaren är placerad på Mikroskop scenen, värmedetektor och elektroderna är kopplade till en uppvärmning enhet förinställda till 37 ° C och celler tillåts anpassa för minst 30 min innan mikroskopi initieras. I detta exempel, Mikroskop scenen är också utrustad med en micromanipulator för att utföra microinjections och Mikroskop nålen doppas i det medium som täcker det cell-lagret i imaging kammaren. (g), An NIH3T3 fibroblast cell är visualiseras innan Mikroskop av faskontrast mikroskopi. Röda korset i perinukleära facket anger platsen för de framtida Mikroskop, vilket motsvarar en hög cytoplasmiska region på grund av närheten till skrymmande kärnan. (h), 10 min efter Mikroskop med Rac1, cellen reagerar av framstående bildandet av lamellipodia runt hela cellen periferin (indikeras av gröna pilar). <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> Figur 2: FRAP tillåter att fastställa andelen protein omsättningen eller lamellipodial aktin polymerisation. (en) representativa exempel på B16-F1 cellen uttrycker andra-VASP innan fotoblekning i en lamellipodial region som anges. Olikfärgade konturer/former är märkta för att indikera vilka regioner ansågs för fluorescens intensitet mätningar över tid. Obs röd kontur markeras med ett utropstecken, som etiketter en cytosoliska region placerad i ett område som innehåller flera blåsor och cell surface volanger. Dynamiska områden som denna bör undvikas för att välja regioner av fluorescens referens, eftersom de kännetecknas av stark kortsiktiga fluktuationer av fluorescens, potentiellt orsaka felaktiga resultat. (b), Lamellipodial region av andra-VASP uttrycker cellen före och efter fotoblekning. Återvinning av fluorescerande signal efter fotoblekning inom regionen markerade i lila är visualiseras med tiden. Pilen anger spetsen på en microspike, berikad för VASP sannolikt på grund av den höga tätheten av aktin filament polymeriserande där19. (c), ett exempel på en FRAP återhämtning kurva som härrör från kvantifiera fluorescerande intensiteten i den photobleached lamellipodium (lila kontur) i b. röda och gröna linjer till höger anger, respektive, orörlig och mobila fraktioner. (d) ett passar FRAP återhämtning kurvan i c (till vänster) och ett exempel på den beräkningsmetod som används för att härleda halv återhämtningstiden (höger panel). (e) ett exempel på en FRAP återhämtning kurva härrör från i genomsnitt 15 celler, fluorescens återhämtning kurvor med SEM staplar som visar graden av variabilitet inom ett urval av populationen. (f), en kurva passform härrör från utjämning FRAP återhämtning kurva passar 15 celler (till vänster) och ett exempel på den beräkningsmetod som används för att härleda halv återhämtningstiden (höger panel). (g) Time-lapse paneler av utskjutande lamellipodium cellens B16-F1 uttrycker andra-taggade β-aktin före och efter blekning av en lamellipodial region som anges, följt av fluorescens återhämtning i lamellipodium tiden. På panelen längst till höger, uppmätta värden för utstick och retrograd avstånd tillhandahålls (i orange och rött, respektive). Beräkningar enligt panelerna bild avslöjar hur summan av utstick och retrograd avstånd används för att härleda polymerisation andelen lamellipodial aktin nätverket. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> Figur 3: Ljusaktivering av PA-GFP-aktin för monomer spårning i hela cellen. (en) A representativt exempel på en B16-F1 cell uttrycker PA-GFP-aktin innan utlöser ljusaktivering i en cytosoliska region som indikeras av den röda cirkeln (PA). Olikfärgade konturer är märkta för att indikera vilka regioner ansågs för fluorescens intensitet mätningar över tid. (b), en illustration av den tidsmässiga fördelningen av PA-GFP-aktin efter ljusaktivering. Observera att den gradvisa minskningen av fluorescens i photoactivated, cytosoliska regionen (röd cirkel), som photoactivated actin diffunderar från det. På grund av deras diffusion till framsidan och församlingen in i nätverket förstärks gradvis photoactivated aktin monomerer i lamellipodia (cyan region) och i cytosolen (olika färgkodade regioner) i en distans - och tidsberoende mode. (c) representant, temporal nedgången av fluorescens inom regionen photoactivated cytosoliska (röd kontur i b). (d), temporala förändringar i fluorescensintensiteten i regionen lamellipodial (cyan kontur i b). (e) kurvor som är representativa för de tidsmässiga förändringarna i fluorescensintensiteten hos cytosoliska regioner (färgkodade i b) på grund av positionering i varierande avstånd från området av ljusaktivering. Observera hur halv-gånger nå fluorescensen platå (anges i förklaringen till höger) öka sträckan ges regionen till området av ljusaktivering, sannolikt korrelera med den ökade gånger behövs för spridning av aktin monomerer i den respektive region. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Vi beskriver hur mikro- och photomanipulation tekniker såsom FRAP och ljusaktivering möjliggöra bestämning av motilitet parametrar och spatiotemporal dynamiken i proteiner inom migrera celler. Experimentell utläsningar inkluderar subcellulär dynamics och omsättning av motilitet tillsynsmyndigheter eller underliggande aktin cytoskelettet.

Mikromanipulation tekniker möjliggör analys av Morphogenetic Dynamics och omsättning av Cytoskeletal regulatorer

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis och Mikromanipulation för Intravital fluorescens avbildning av mikrocirkulationen

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Spårning Deformationer Morphogenetic Tissue i tidig Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Fosfopeptiden Analys av gnagare Epididymal Spermier

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‹Å“Touch DNAÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢ Evidence

Förbättrad Genetisk analys av Single Human biopartiklar Återvunna av förenklad Mikromanipulation från Forensic &quot;Touch-DNA&quot; Evidence

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Högupplöst avbildning och analys av enskilda Astral mikrotubuli Dynamics i knoppande jäst

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel och effektiv Administration och visualisering av mikropartiklar i cirkulationssystemet av små fiskar använder njure injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Tillämpningar av plats och tid kartläggning och partikel analystekniker för att kvantifiera intracellulära Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...