Det vigtigste bidrag fra vores papir er, at vi har udforsket en præcis og fin landskab af amyloid beta patologi af Alzheimers sygdom hjernen med billeddannelse teknologi MALDI billeddannelse massespektrometri. Vi opnåede teknologiske fremskridt ved at generere en særlig protokol med myresyre forbehandling af vævsdias. Efter MALDI-IMS genereres segmenteringskort, og der udføres beregninger for at opdage nye markørproteiner eller peptider, der er udsmykket med plak og subaraknoid vaskulatur.
Opnå menneskelige kortikale prøver til IMS fra hjerner, der blev fjernet, behandlet og opbevaret ved minus 80 grader Celsius inden for otte timer efter slagtning. Tag hjernen prøve fra occipital cortex af AD patienter og alders-matchede kontrol. At skære væv sektioner på en kryostat, første sted ledende indium tinoxid eller ITO-belagt mikroskop glas glider inde i kryostat.
Varm obduktionshjerne prøven fra minus 80 grader Celsius til minus 22 grader Celsius inde i kryostaten. Fastgør en ny engangsklinge til kryostaten til hvert eksperiment. Forsøg altid at bruge en ren del af klingen.
Sæt den frosne obduktion hjerner på scenen sammen med en lille mængde af optimal skæretemperatur sammensatte. For IMS og immunhistokkemi skæres fem til seks sektioner fra hver vævsprøve. Når klingen lige er begyndt at skære vævet, drej hjulet og vender mod blokken, indtil alt væv er udsat.
Hvis der er en lille stribe eller rive på tværs af afsnittet, vente i kryostaten, indtil temperaturjusteringen automatisk løser det. Tæl et par sekunder, før du åbner anti-roll med et væv nedenunder. Placer straks vævsskivet på den ITO-belagte side af glasrutsjebanen.
Tø vævsskiven op ved at sætte en finger under sliden på den ikke-ITO-belagte side. Vævet vil holde sig til diaset. Sørg for, at vævet er så fladt som muligt uden rynker.
Vævssektionerne skylles i 40 til 100 milliliter 70 % ethanol i en glasfarvrukke i 30 sekunder for at fjerne endogene lipider og uorganiske salte. Prøverne vaskes ved hjælp af den vaskesekvens, der er anført i tekstprotokollen. Tør derefter prøverne i et vakuum i 30 minutter.
Nu, behandle væv sektioner med en myresyre damp for en bedre ionisering af amyloid beta proteiner fra obduktion hjernevæv. For at gøre dette, forberede ovnen ved 60 grader Celsius og en inkubation glas fad med fem milliliter 100% myresyre. Hold luftfugtigheden i inkubationsglasskålen på mætningsniveau.
Placer vævsdias i inkubationsglasskålen, mens du undgår nedsænkning i myresyren og behandles i seks minutter. Tag et optisk billede af prøverne ved hjælp af en filmscanner, gelscanner eller et digitalt mikroskop. Udfør dette trin ved stuetemperatur.
Justeringen af prøvernes optiske billede er nødvendig, når prøvemålet placeres inde i instrumentet. Normalt vil det ikke være muligt at genkende vævssektionen under matrixlaget. For at korrelere de optiske billeder med prøverne skal du lave styremærker, der er synlige både i det optiske billede og under matrixlaget i kameraoptikken.
Den nemmeste måde er at få øje på mindst tre korrektion væske mærker omkring prøven, før du tager det optiske billede. For at sprøjte matrixen med en ultralydsprøjte fjernes det væv, der skal sprøjtes fra eksiccatoren, og den sættes i kammeret. Sørg for, at vævet ikke dækker sensorvinduet.
Start forberedelsen ved at trykke på knappen Start. Normalt prep tid er omkring 90 minutter. Præparatet reguleres automatisk via overvågning af matrixlagtykkelsen og vådheden.
Alternativt kan du sprøjte matrixopløsningen på vævsoverfladen med en automatisk sprøjte ved hjælp af et opløsningsmiddelpumpesystem, der er indstillet til 10 psi og 0,15 milliliter i minuttet til at levere matrixopløsningen. En konstant strøm af opvarmet kappegas vil blive leveret sammen med matrixopløsningssprayen. Udfør billedforsøg med høj overførselshastighed og høj rumlig opløsning med MALDI-IMS.
Ved massespektrometrimåling skal vævsområderne defineres ved hjælp af MALDI-kontrolsoftwaren og dataanalysesoftwaren. Indløs spektre i en positiv lineær tilstand med en masse til opladningsforholdområde på 2, 000 til 20, 000 og en rumlig opløsning på 20 og 100 mikron. For at gøre kalibreringsstandarden opløses peptidkalibreringsstandarden og proteinkalibreringsstandarden i et 1-4 forhold med CHCA- og TA30-opløsningen, og den fortyndes derefter 10 gange.
Placer en mikroliter kalibreringsstandard på sliden på fire forskellige steder. Ved hjælp af molekylær histologi software, overlay flere signal billeder for at finde den rumlige korrelation af forskellige signaler såsom forskellige amyloid beta peptider colocalizing i senil plaques og arterielle vægge. Den cerebrale amyloid angiopati eller CAA fænotyper af patient nummer tre var mest fremtrædende i denne undersøgelse.
MALDI-IMS af denne patients hjernevæv klart visualiseret, at amyloid beta 1-42 og amyloid beta 1-43 blev fortrinsvis deponeret som senil plaques i cerebral parenkym. Derimod blev kortere amyloid betaer såsom amyloid beta 1-36 til 1-41 fortrinsvis deponeret på leptomeningeal vaskulære områder. Der var ingen signifikante signaler i den ikke-patologiske kontrol.
Distributioner af amyloid beta 1-40 og amyloid beta 1-42 blev yderligere valideret med immunohistochemistry ved hjælp af tilstødende frosne dele af vævene. Den anti-amyloid beta 1-40 antistof mærket CAA og afslørede amyloid beta 1-40 er fortrinsvis deponeret i leptomeningeal blodkar, hvilket er klar kontrast til fordelingen af amyloid beta 1-42 i cerebral parenkym som senil plaques. Vist her er en segmentering kort opnået med en bisecting k-midler analyse anvendes på samme sektion fra patient nummer tre.
Denne klyngemetode identificerede med succes plaklignende strukturer i parenkym- og vaskulære strukturer i subaraknoidrummet. Det er interessant at finde et lille cirkulært område i parenkym, som detekteres lige omkring en lille arteriel i parenkym samt i subaraknoid rummet. Dette er verificeret af enkelt ion billeder af disse individuelle amyloid beta peptider.
Der er en grænse for at spore en bred vifte af amyloid betaer samtidigt, selv om du bruger de specifikke antistoffer. Her viser vi fordelingen af amyloid beta i menneskelige hjerner ved hjælp af den banebrydende MALDI-billeddannelsesmassespektrometrimetode. Vi mener, at dette bidrag gør gennembrud i Forskning i Alzheimers sygdom, fordi denne rapport tilbyder karakterisering af det fulde sæt af amyloid beta proteiner i humane obduktion hjerner.
Det mest imponerende resultat er, at kun en enkelt aminosyre ændring på C terminal af amyloid beta protein gør en drastisk ændring i deres fordeling. Vævspræparattrinene er afgørende for at opnå en effektiv ionisering af aggregerede proteiner i humant hjernevæv. Homogen cocrystallization af analysanden med matrixer afgørende for høj følsomhed og artefakt-fri billeddannelse.