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March 7th, 2019
DOI :
March 7th, 2019
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Title
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Preparation of Tissue Sections for Imaging Mass Spectrometry (IMS)
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MALDI-IMS
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Results: Visualization of Aβ and Its Isoforms from Autopsied Brains with AD and CAA with MALDI-IMS
8:14
Conclusion
Transcript
हमारे पेपर का मुख्य योगदान यह है कि हमने माल्डी इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री की इमेजिंग तकनीक के साथ अल्जाइमर रोग मस्तिष्क के एमिलॉयड बीटा पैथोलॉजी के सटीक और ठीक परिदृश्य का पता लगाया है। हमने ऊतक स्लाइड के फोर्मिक एसिड प्री-उपचार के साथ एक विशेष प्रोटोकॉल उत्पन्न करके तकनीकी प्रगति हासिल की। माल्डी-आईएमएस के बाद, विभाजन मानचित्र उत्पन्न होते हैं और गणनाएं पट्टिका और सबराचनॉयड वैक्यूलेचर के साथ उपन्यास मार्कर प्रोटीन या पेप्टाइड्स कोलोकैलाइज्ड की खोज करने के लिए की जाती हैं।
आठ घंटे के भीतर हटा दिया गया, संसाधित, और शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत दिमाग से आईएमएस के लिए मानव कॉर्टिकल नमूने प्राप्त करें । विज्ञापन मरीजों के ऑक्सीपिटल कॉर्टेक्स और उम्र से मेल खाने वाले कंट्रोल से दिमाग का नमूना लें। क्रायोस्टेट पर ऊतक अनुभागों को काटने के लिए, क्रायोस्टेट के अंदर पहली जगह प्रवाहकीय इंडियम टिन ऑक्साइड या आईटीओ-लेपित माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड।
शव परीक्षण मस्तिष्क के नमूने को शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस से गर्म कर क्रायोस्टेट के अंदर शून्य से 22 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें । हर प्रयोग के लिए क्रायोस्टेट के लिए एक नया डिस्पोजेबल ब्लेड संलग्न करें। हमेशा ब्लेड के एक साफ हिस्से का उपयोग करने की कोशिश करें।
इष्टतम काटने तापमान यौगिक की एक छोटी राशि के साथ मंच पर जमे हुए शव परीक्षण दिमाग रखो। आईएमएस और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए, प्रत्येक ऊतक नमूने से पांच से छह वर्गों में कटौती करें। जब ब्लेड सिर्फ ऊतक में कटौती करने के लिए शुरू कर रहा है, पहिया बारी और ब्लॉक का सामना जब तक ऊतक के सभी उजागर हो रहा है ।
यदि पूरे खंड में एक छोटी सी लकीर या आंसू है, तो क्रायोस्टेट में तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि तापमान समायोजन स्वचालित रूप से इसे ठीक न कर ले। नीचे एक ऊतक के साथ विरोधी रोल खोलने से पहले कुछ सेकंड की गणना करें। तुरंत ग्लास स्लाइड के आईटीओ-लेपित साइड पर टिश्यू स्लाइस रखें।
गैर-आईटीओ-लेपित पक्ष पर स्लाइड के नीचे एक उंगली डालकर ऊतक टुकड़ा पिघला। ऊतक स्लाइड से चिपके रहेंगे। सुनिश्चित करें कि ऊतक कोई झुर्रियों के साथ संभव के रूप में फ्लैट के रूप में है।
ऊतक वर्गों को कुल्ला करने के लिए, अंतर्जात लिपिड और अकार्बनिक लवण को हटाने के लिए 30 सेकंड के लिए एक ग्लास धुंधला जार में 70% इथेनॉल के 40 से 100 मिलीलीटर में नमूनों को विसर्जित करें। पाठ प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध वाशिंग अनुक्रम का उपयोग करके नमूनों को धोएं। इसके बाद नमूनों को 30 मिनट तक वैक्यूम में सुखा लें।
अब, ऑटोप्सी मस्तिष्क ऊतक से एमिलॉयड बीटा प्रोटीन के बेहतर आयनीकरण के लिए एक प्राथमिक एसिड वाष्प के साथ ऊतक वर्गों का इलाज करें। ऐसा करने के लिए, ओवन को 60 डिग्री सेल्सियस पर तैयार करें और एक इनक्यूबेशन ग्लास डिश जिसमें पांच मिलीलीटर 100% फॉर्मिक एसिड होता है। इनक्यूबेशन ग्लास डिश में हवा की आर्द्रता को संतृप्ति स्तर पर रखें।
स् टिश्यू स्लीव्स को इनक्यूबेशन ग्लास डिश में रखें जबकि फॉरमिक एसिड में सबमर्ण से बचें और छह मिनट तक इसका इलाज करें। एक फिल्म स्कैनर, जेल स्कैनर, या एक डिजिटल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूनों की एक ऑप्टिकल छवि ले लो । कमरे के तापमान पर इस कदम को करें।
जब नमूना लक्ष्य को उपकरण के अंदर रखा जाता है तो नमूनों की ऑप्टिकल छवि का संरेखण आवश्यक होता है। आमतौर पर, मैट्रिक्स परत के नीचे ऊतक अनुभाग को पहचानना संभव नहीं होगा। नमूनों के साथ ऑप्टिकल छवियों को सहसंबंधित करने के लिए, गाइड के निशान बनाएं जो ऑप्टिकल छवि में और कैमरे ऑप्टिक में मैट्रिक्स परत के नीचे दोनों दिखाई देते हैं।
सबसे आसान तरीका ऑप्टिकल छवि लेने से पहले नमूने के आसपास कम से कम तीन सुधार तरल पदार्थ के निशान हाजिर करने के लिए है। मैट्रिक्स को अल्ट्रासोनिक स्प्रेयर के साथ स्प्रे करने के लिए, डेसिकेटर से छिड़काव करने के लिए ऊतक को हटा दें और इसे कक्ष में रखें। सुनिश्चित करें कि ऊतक सेंसर खिड़की को कवर नहीं कर रहा है।
स्टार्ट बटन को धक्का देकर तैयारी शुरू करें। आमतौर पर, प्रस्तुत करने का समय 90 मिनट के आसपास होता है। तैयारी स्वचालित रूप से मैट्रिक्स परत मोटाई और गीलापन की निगरानी के माध्यम से विनियमित किया जाएगा।
वैकल्पिक रूप से, स्वचालित स्प्रेयर के साथ ऊतक की सतह पर मैट्रिक्स समाधान स्प्रे करने के लिए, मैट्रिक्स समाधान देने के लिए 10 साई और 0.15 मिलीलीटर प्रति मिनट पर सेट एक सॉल्वेंट पंप सिस्टम का उपयोग करें। मैट्रिक्स समाधान स्प्रे के साथ गर्म म्यान गैस का एक निरंतर प्रवाह संयुक्त रूप से वितरित किया जाएगा। मालडी-आईएमएस के साथ उच्च-थ्रूपुट और उच्च-स्थानिक-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्रयोग करें।
बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री माप के लिए, माल्डी नियंत्रण सॉफ्टवेयर और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ऊतक क्षेत्रों को परिभाषित करें। 2, 000 से 20, 000 की अनुपात सीमा और 20 और 100 माइक्रोन के स्थानिक समाधान को चार्ज करने के लिए एक द्रव्यमान के साथ एक सकारात्मक रैखिक मोड में स्पेक्ट्रा प्राप्त करें। अंशांकन मानक बनाने के लिए, पेप्टाइड अंशांकन मानक और प्रोटीन अंशांकन मानक को सीएचसीए और TA30 समाधान के साथ एक से चार अनुपात में भंग करें और फिर इसे 10 गुना पतला करें।
चार अलग-अलग स्थानों पर स्लाइड पर अंशांकन मानक का एक माइक्रोलीटर रखें। आणविक हिस्टोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, विभिन्न संकेतों जैसे कि विभिन्न एमिलॉयड बीटा पेप्टाइड्स के स्थानिक सहसंबंध को खोजने के लिए कई सिग्नल छवियों को ओवरले करें। इस अध्ययन में रोगी संख्या तीन के सेरेब्रल एमिलॉयड एंजियोपैथी या सीएए फेनोटाइप सबसे प्रमुख थे।
इस रोगी के मस्तिष्क के ऊतकों के MALDI-आईएमएस स्पष्ट रूप से कल्पना है कि एमिलॉयड बीटा 1-42 और एमिलॉयड बीटा 1-43 अधिमानतः मस्तिष्क परेंचिमा में बूढ़ा सजीले टुकड़े के रूप में जमा किया गया । इसके विपरीत, छोटे एमिलॉयड बीटा जैसे एमिलॉयड बीटा 1-36 से 1-41 को लेप्टोमेनेनेल वैस्कुलर क्षेत्रों पर अधिमानतः जमा किया गया था। गैर-पैथोलॉजिकल कंट्रोल में कोई खास संकेत नहीं थे ।
ऊतकों के आसन्न जमे हुए वर्गों का उपयोग करके एमिलॉयड बीटा 1-40 और एमिलॉयड बीटा 1-42 के वितरण को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ आगे मान्य किया गया था। एंटी-एमिलॉयड बीटा 1-40 एंटीबॉडी लेबल सीएए और पता चला एमिलॉयड बीटा 1-40 को लेप्टोमीनिंगियल रक्त वाहिकाओं में अधिमानतः जमा किया जाता है, जो सेरेब्रल पैरान्चामा में एमिलॉयड बीटा 1-42 के वितरण के विपरीत है। यहां दिखाया गया एक विभाजन नक्शा है जो रोगी संख्या तीन से एक ही खंड पर लागू एक bisecting k-साधन विश्लेषण के साथ प्राप्त किया गया है ।
इस क्लस्टरिंग विधि ने सबराक्नेयाइड अंतरिक्ष में परेंचिमा और संवहनी संरचनाओं में पट्टिका जैसी संरचनाओं की सफलतापूर्वक पहचान की। परेंचिमा में एक छोटा गोलाकार क्षेत्र ढूंढना दिलचस्प है जो पैरांचिमा में एक छोटी धमनियों के साथ-साथ सबराचनॉइड अंतरिक्ष में भी पाया जाता है। यह इन व्यक्तिगत एमिलॉयड बीटा पेप्टाइड्स की एकल आयन छवियों द्वारा सत्यापित किया जाता है।
विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने पर भी एक साथ एमीलॉयड बीटा की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाने की एक सीमा है। यहां, हम अत्याधुनिक माल्डी इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि का उपयोग करके मानव दिमाग में एमिलॉयड बीटा का वितरण दिखाते हैं। हमारा मानना है कि यह योगदान अल्जाइमर रोग अनुसंधान में सफलता देता है क्योंकि यह रिपोर्ट मानव ऑटोप्सीड दिमाग में एमिलॉयड बीटा प्रोटीन के पूर्ण सेट का लक्षण वर्णन प्रदान करती है ।
सबसे प्रभावशाली निष्कर्ष यह है कि एमिलॉयड बीटा प्रोटीन के सी टर्मिनल पर केवल एक एकल अमीनो एसिड परिवर्तन उनके वितरण में भारी परिवर्तन करता है। ऊतक तैयारी कदम मानव मस्तिष्क के ऊतकों में एकत्रित प्रोटीन का एक प्रभावी आयनीकरण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। उच्च संवेदनशीलता और विरूपण मुक्त इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण मैट्रिक्स के साथ विश्लेषण के सजातीय सहक्रिस्टलाइजेशन।
मैट्रिक्स के साथ आणविक इमेजिंग-असिस्टेड लेजर डिसॉलशन/आयनीकरण आधारित इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (माल्डी-आईएमएस) जैविक नमूनों में मल्टीपल एनालिटीज के एक साथ मानचित्रण की अनुमति देता है । यहां, हम पता लगाने और अल्जाइमर रोग और मस्तिष्क amyloid एंजियोपैथी के नमूने के ब्रेन ऊतकों पर amyloid β प्रोटीन के दृश्य के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद माल्डी-आईएमएस का उपयोग कर ।
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