우리의 논문의 주요 기여는 우리가 MALDI 화상 진찰 질량 분석의 화상 진찰 기술로 알츠하이머 병 두뇌의 아밀로이드 베타 병리학의 정확하고 정밀한 풍경을 탐구했다는 것입니다. 우리는 조직 슬라이드의 포믹 산 전처리와 특별한 프로토콜을 생성하여 기술 발전을 달성했다. MALDI-IMS에 이어, 세분화 맵이 생성되고 플라크 및 수막 혈관과 함께 국화된 새로운 마커 단백질 또는 펩타이드를 발견하기 위해 계산이 수행됩니다.
제거, 처리 및 8 시간 사후 내에서 영하 80도에서 저장 된 뇌에서 IMS에 대한 인간의 피질 표본을 가져옵니다. AD 환자의 후두 피질과 연령 일치 제어에서 뇌 표본을 가져 가라. 저온저온스트에 조직 섹션을 잘라, 1 위 전도성 인듐 산화또는 ITO 코팅 현미경 유리 는 극저온 내부 슬라이드.
부검 뇌 표본을 영하 80도에서 영하 22도까지 따뜻하게 합니다. 모든 실험을 위해 냉동에 새 일회용 블레이드를 부착합니다. 항상 블레이드의 깨끗한 부분을 사용하려고합니다.
냉동 부검 뇌를 소량의 최적의 절삭 온도 화합물과 함께 무대에 놓습니다. IMS 및 면역 조직 화학의 경우 각 조직 샘플에서 5 ~6 개의 섹션을 잘라냅니다. 칼날이 조직을 자르기 시작하면 바퀴를 돌리고 모든 조직이 노출 될 때까지 블록을 향합니다.
섹션을 가로질러 작은 줄무늬나 눈물이 있는 경우 온도 조정이 자동으로 수정될 때까지 극저온에서 기다립니다. 밑에 티슈로 안티 롤을 열기 전에 몇 초 계산합니다. 즉시 유리 슬라이드의 ITO 코팅 측에 조직 조각을 배치합니다.
ITO 코팅되지 않은 쪽의 슬라이드 아래에 손가락을 넣어 조직 슬라이스를 해동합니다. 조직은 슬라이드에 충실합니다. 조직이 주름없이 가능한 한 평평하도록하십시오.
조직 단면을 헹구려면 내인성 지질과 무기 염을 제거하기 위해 30초 동안 유리 염색 항아리에 70%에탄올의 40~100밀리리터에 샘플을 담그면 됩니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 세척 시퀀스를 사용하여 샘플을 세척합니다. 그런 다음 30 분 동안 진공 상태에서 샘플을 건조시.
지금, 부검 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 단백질의 더 나은 이온화를 위해 포름산 증기로 조직 단면을 취급합니다. 이렇게 하려면 오븐을 섭씨 60도에서 준비하고 100% 포믹산5밀리리터가 있는 인큐베이션 유리 접시를 준비합니다. 인큐베이션 유리 접시의 공기 습도를 포화 수준으로 유지합니다.
포믹산에 침을 피하고 6분 동안 치료하면서 인큐베이션 유리 접시에 티슈 슬라이드를 놓습니다. 필름 스캐너, 젤 스캐너 또는 디지털 현미경을 사용하여 샘플의 광학 이미지를 촬영합니다. 실온에서 이 단계를 수행합니다.
샘플 대상이 계측기 내부에 배치될 때 시료의 광학 이미지 의 정렬이 필요합니다. 일반적으로, 매트릭스 층 의 밑에 조직 단면을 인식하는 것은 불가능할 것이다. 광학 이미지와 샘플의 상관 관계를 구성하려면 광학 이미지와 카메라 광학의 매트릭스 레이어 아래에 표시되는 가이드 마크를 만듭니다.
가장 쉬운 방법은 광학 이미지를 촬영하기 전에 샘플 주위에 적어도 세 개의 보정 유체 마크를 발견하는 것입니다. 초음파 분무기로 매트릭스를 분사하려면 건조기에서 분사되는 조직을 제거하고 챔버에 놓습니다. 조직이 센서 창을 덮고 있지 않은지 확인합니다.
시작 버튼을 눌러 준비를 시작합니다. 일반적으로 준비 시간은 약 90 분입니다. 제제는 매트릭스 층 두께 및 습윤의 모니터링을 통해 자동으로 조절됩니다.
또는 자동 분무기로 조직 표면에 매트릭스 용액을 분무하려면 매트릭스 용액을 전달하기 위해 분당 10 psi 및 0.15 밀리리터로 설정된 용매 펌프 시스템을 사용합니다. 가열 된 칼집 가스의 일정한 흐름은 매트릭스 용액 스프레이와 공동으로 전달됩니다. MALDI-IMS를 통해 고처리량 및 고공간 해상도 이미징 실험을 수행합니다.
질량 분석 측정의 경우 MALDI 제어 소프트웨어 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 조직 영역을 정의합니다. 2, 000 ~ 20, 000의 질량 전하 비율 범위와 20 및 100 미크론의 공간 해상도를 가진 양극선형 모드에서 스펙트럼을 획득합니다. 교정 표준을 만들기 위해, 펩티드 교정 표준 및 단백질 교정 표준을 CHCA 및 TA30 용액과 1 대 4 비율로 용해한 다음 10 배 희석하십시오.
네 개의 다른 위치에 슬라이드에 교정 표준의 마이크로 리터 를 배치합니다. 분자 히스토로지 소프트웨어를 사용하여, 노인 플라크 및 동맥 벽에서 지역화하는 상이한 아밀로이드 베타 펩타이드와 같은 다양한 신호의 공간 상관 관계를 찾기 위해 다중 신호 이미지를 오버레이합니다. 환자 번호 3의 대뇌 아밀로이드 혈관병증 또는 CAA 표현형은 이 연구에서 가장 두드러졌습니다.
이 환자의 뇌 조직의 MALDI-IMS는 아밀로이드 베타 1-42 및 아밀로이드 베타 1-43이 대뇌 빈반엽종에 있는 노인 플라크로 우선적으로 증착되었다는 것을 명확하게 시각화했습니다. 대조적으로, 아밀로이드 베타 1-36 에서 1-41까지의 짧은 아밀로이드 베타는 렙토멘딩혈관 부위에 우선적으로 증착되었다. 비 병리학 적 통제에는 중요한 신호가 없었습니다.
아밀로이드 베타 1-40 및 아밀로이드 베타 1-42의 분포는 조직의 인접한 냉동 섹션을 사용하여 면역 조직화학으로 더욱 검증되었다. 항 아밀로이드 베타 1-40 항체는 CAA로 표지되고 아밀로이드 베타 1-40이 우대적으로 렙토멘딩 혈관에 증착되어, 이는 뇌병상 동맥 파렌키마에서 아밀로이드 베타 1-42의 분포와 는 명백한 대조를 이룹니다. 여기에 는 환자 번호 3에서 동일한 섹션에 적용된 이중 k-means 분석으로 얻은 세분화 맵이 있다.
이 클러스터링 방법은 수막크노이드 공간에서 빈맥및 혈관 구조물에서 플라크와 같은 구조물을 성공적으로 확인하였다. 파렌치마의 작은 동맥 주위뿐만 아니라 수막의 공간에서 감지되는 작은 원형 지역을 찾는 것은 흥미롭습니다. 이것은 이러한 개별 아밀로이드 베타 펩티드의 단일 이온 이미지에 의해 확인된다.
특정 항체를 사용하더라도 동시에 광범위한 아밀로이드 베타를 추적하는 데는 한계가 있다. 여기서, 우리는 최첨단 MALDI 이미징 질량 분석 방법을 사용하여 인간의 뇌에서 아밀로이드 베타의 분포를 보여줍니다. 우리는 이 보고가 인간 부검 두뇌에 있는 아밀로이드 베타 단백질의 전체 세트의 특성을 제안하기 때문에 이 기여는 알츠하이머 병 연구에서 돌파구를 만든다는 것을 믿습니다.
가장 인상적인 발견은 아밀로이드 베타 단백질의 C 단말에 단 하나의 아미노산 변경만 그들의 분포에 있는 급격한 변경을 한다는 것입니다. 조직 준비 단계는 인간의 뇌 조직에서 집계 된 단백질의 효과적인 이온화를 얻는 데 중요합니다. 고감도 및 아티팩트 없는 이미징에 중요한 매트릭스와 함께 질질 적인 합종화.
