Hovedbidraget i papiret vårt er at vi har utforsket et presist og fint landskap av amyloid betapatologi av Alzheimers sykdomshjerne med bildeteknologien til MALDI-bildemassespektrometri. Vi oppnådde teknologiske fremskritt ved å generere en spesiell protokoll med maursyreforbehandling av vevsskliene. Etter MALDI-IMS genereres segmenteringskart og beregninger utføres for å oppdage nye markørproteiner eller peptider som er colocalized med plakk og subaraknoid vaskulatur.
Få menneskelige kortikale prøver for IMS fra hjerner som ble fjernet, behandlet og lagret på minus 80 grader Celsius innen åtte timer etter mortem. Ta hjerneprøven fra occipital cortex av AD-pasienter og alderstilpassede kontroller. For å kutte vevseksjonene på en kryostat, glir første omgang ledende indiumboksoksid eller ITO-belagt mikroskopglass inne i kryostaten.
Varm obduksjonshjerneprøven fra minus 80 grader Celsius til minus 22 grader Celsius inne i kryostaten. Fest et nytt engangsblad til kryostaten for hvert eksperiment. Prøv alltid å bruke en ren del av bladet.
Sett de frosne obduksjonshjernene på scenen sammen med en liten mengde optimal skjæretemperaturforbindelse. For IMS og immunohistochemistry, kutt fem til seks seksjoner fra hver vevsprøve. Når bladet bare begynner å kutte vevet, drei hjulet og ansiktet blokken til alt vevet er utsatt.
Hvis det er en liten strek eller rive over delen, vent i kryostaten til temperaturjusteringen automatisk fikser den. Telle noen sekunder før du åpner anti-roll med et vev under. Plasser umiddelbart vevsskiven på den ITO-belagte siden av glasslysbildet.
Tin vevskiven ved å sette en finger under lysbildet på den ikke-ITO-belagte siden. Vevet vil holde seg til lysbildet. Sørg for at vevet er så flatt som mulig uten rynker.
For å skylle vevseksjonene, senk prøvene i 40 til 100 milliliter med 70% etanol i en glassflekkglass i 30 sekunder for å fjerne endogene lipider og uorganiske salter. Vask prøvene ved hjelp av vaskesekvensen som er oppført i tekstprotokollen. Tørk deretter prøvene i et vakuum i 30 minutter.
Behandle nå vevsseksjonene med en maursyredamp for en bedre ionisering av amyloid betaproteinene fra obduksjonshjernevev. For å gjøre dette, forberede ovnen på 60 grader Celsius og en inkubasjon glassrett med fem milliliter på 100% maursyre. Hold luftfuktigheten i inkubasjonsglassfatet på metningsnivå.
Plasser vevet glir i inkubasjonsglassfatet mens unngå nedsenking i maursyre og behandle i seks minutter. Ta et optisk bilde av prøvene ved hjelp av en filmskanner, gelskanner eller et digitalt mikroskop. Utfør dette trinnet ved romtemperatur.
Justeringen av det optiske bildet av prøvene er nødvendig når prøvemålet er plassert inne i instrumentet. Vanligvis vil det ikke være mulig å gjenkjenne vevsdelen under matriselaget. Hvis du vil korrelere de optiske bildene med prøvene, gjør du ledemerker som er synlige både i det optiske bildet og under matriselaget i kameraoptikken.
Den enkleste måten er å oppdage minst tre korreksjonsvæskemerker rundt prøven før du tar det optiske bildet. For å sprøyte matrisen med en ultralydsprøyter, fjern vevet som skal sprøytes fra desiccatoren og legg det i kammeret. Kontroller at vevet ikke dekker sensorvinduet.
Start preparatet ved å trykke på Start-knappen. Vanligvis er prep tid rundt 90 minutter. Preparatet vil bli regulert automatisk via overvåking av matriselagets tykkelse og våthet.
Alternativt, for å sprøyte matriseløsningen på vevsoverflaten med en automatisk sprøyter, bruk et løsningsmiddelpumpesystem satt til 10 psi og 0,15 milliliter per minutt for å levere matriseløsningen. En konstant strøm av oppvarmet kappegass vil bli levert sammen med matriseløsningssprayen. Utfør bildeeksperimenter med høy gjennomstrømning og høyoppløselig oppløsning med MALDI-IMS.
For massespektrometrimåling definerer du vevsområdene ved hjelp av MALDI-kontrollprogramvaren og dataanalyseprogramvaren. Få spektra i en positiv lineær modus med et masse-til-lade-forholdsområde på 2 000 til 20 000 og en romlig oppløsning på 20 og 100 mikrometer. For å lage kalibreringsstandarden oppløs peptidkalibreringsstandarden og proteinkalibreringsstandarden i ett til fire forhold med CHCA- og TA30-oppløsning og fortynne den deretter 10 ganger.
Plasser én mikroliter kalibreringsstandard på lysbildet på fire forskjellige steder. Ved hjelp av molekylær histologi programvare, overlegg flere signalbilder for å finne den romlige korrelasjonen av ulike signaler som forskjellige amyloid beta peptider colocalizing i senil plakk og arterielle vegger. Cerebral amyloid angiopati eller CAA fenotyper av pasient nummer tre var mest fremtredende i denne studien.
MALDI-IMS av denne pasientens hjernevev tydelig visualisert at amyloid beta 1-42 og amyloid beta 1-43 ble fortrinnsvis deponert som senil plakk i cerebral parenchyma. Til sammenligning ble kortere amyloid betas som amyloid beta 1-36 til 1-41 fortrinnsvis deponert på leptomeningeal vaskulære områder. Det var ingen signifikante signaler i ikke-patologisk kontroll.
Distribusjoner av amyloid beta 1-40 og amyloid beta 1-42 ble ytterligere validert med immunohistochemistry ved hjelp av tilstøtende frosne deler av vevet. Anti-amyloid beta 1-40 antistoff merket CAA og avslørte amyloid beta 1-40 er fortrinnsvis deponert i leptomeningeal blodkar, som er klar kontrast til fordelingen av amyloid beta 1-42 i cerebral parenchyma som senil plakk. Vist her er et segmenteringskart oppnådd med en bisecting k-means analyse brukt på samme avsnitt fra pasient nummer tre.
Denne klyngemetoden identifiserte vellykket plakklignende strukturer i parenchyma og vaskulære strukturer i subaraknoidrommet. Det er interessant å finne et lite sirkulært område i parenchyma som oppdages like rundt en liten arteriole i parenchyma så vel som i subaraknoidrommet. Dette bekreftes av enkeltionbilder av disse individuelle amyloid betapeptider.
Det er en grense for å spore et bredt spekter av amyloid betas samtidig selv om du bruker de spesifikke antistoffene. Her viser vi fordelingen av amyloid beta i menneskelige hjerner ved hjelp av den banebrytende MALDI imaging massespektrometrimetoden. Vi tror dette bidraget gjør gjennombrudd i Alzheimers sykdom forskning fordi denne rapporten tilbyr karakterisering av hele settet av amyloid beta proteiner i menneskelige obduksjonhjerner.
Det mest imponerende funnet er at bare en enkelt aminosyreendring ved C-terminalen av amyloid betaprotein gjør en drastisk endring i distribusjonen. Vevsforberedelsestrinnene er avgjørende for å oppnå en effektiv ionisering av aggregerte proteiner i menneskelig hjernevev. Homogen cocrystallisering av analytten med matriser avgjørende for høy følsomhet og artefaktfri avbildning.