Det viktigaste bidraget från vårt papper är att vi har utforskat ett exakt och fint landskap av amyloid beta patologi av Alzheimers sjukdom hjärnan med bildteknik av MALDI imaging masspektrometri. Vi uppnådde tekniska framsteg genom att generera ett speciellt protokoll med myrsyra före behandling av vävnadsrutschbanorna. Efter MALDI-IMS genereras segmenteringskartor och beräkningar utförs för att upptäcka nya markörproteiner eller peptider som colocalized med plack och subarachnoid vasculature.
Få mänskliga kortikalprov för IMS från hjärnor som togs bort, bearbetas och lagras vid minus 80 grader Celsius inom åtta timmar efter slakt. Ta hjärnexemplar från occipital cortex av AD patienter och åldersmatchade kontroller. För att skära vävnadssektionerna på en kryostat, första plats ledande indium tennoxid eller ITO-belagda mikroskop glas diabilder inuti cryostat.
Värm obduktionen hjärnan exemplaret från minus 80 grader Celsius till minus 22 grader Celsius inne i cryostat. Fäst ett nytt engångsblad på kryostaten för varje experiment. Försök alltid att använda en ren del av bladet.
Sätt frysta obduktion hjärnor på scenen tillsammans med en liten mängd optimal skärtemperatur förening. För IMS och immunohistokemi, skär fem till sex sektioner från varje vävnadsprov. När bladet just har börjat skära vävnaden, vrid hjulet och vänd blocket tills alla vävnaden är utsatt.
Om det finns en liten strimma eller riva över sektionen, vänta i kryostaten tills temperaturjusteringen automatiskt fixar den. Räkna några sekunder innan du öppnar anti-roll med en vävnad under. Placera omedelbart vävnadsskivan på den ITO-belagda sidan av glasglaset.
Tina vävnadsskivan genom att sätta ett finger under bilden på den icke ITO-belagda sidan. Vävnaden kommer att hålla sig till bilden. Se till att vävnaden är så platt som möjligt utan rynkor.
För att skölja vävnadssektionerna, sänk ner proverna i 40 till 100 milliliter 70%etanol i en glasfärgningsburk i 30 sekunder för att avlägsna endogena lipider och oorganiska salter. Tvätta proverna med hjälp av tvättsekvensen som anges i textprotokollet. Torka sedan proverna i ett vakuum i 30 minuter.
Nu, behandla vävnadssektionerna med en myrsyraånga för en bättre jonisering av amyloid betaproteinerna från obduktionen hjärnvävnad. För att göra det, förbereda ugnen vid 60 grader Celsius och en inkubation glas skålen med fem milliliter på 100%myrsyra. Håll luftens fuktighet i inkubationsglasfatet på mättnadsnivå.
Placera vävnadsglasen i inkubationsglasfatet samtidigt som du undviker att undersänkar i myrsyran och behandla i sex minuter. Ta en optisk bild av proverna med hjälp av en filmscanner, gelskanner eller ett digitalt mikroskop. Utför detta steg i rumstemperatur.
Uppriktningen av den optiska bilden av proverna är nödvändig när provmålet placeras inuti instrumentet. Vanligtvis kommer det inte att vara möjligt att känna igen vävnadssektionen under matrisskiktet. För att korrelera de optiska bilderna med proverna, gör guidemärken som är synliga både i den optiska bilden och under matrisskiktet i kameraoptiken.
Det enklaste sättet är att upptäcka minst tre korrigeringsvätskemärken runt provet innan du tar den optiska bilden. För att spruta matrisen med en ultraljudssprutare, avlägsna vävnaden som ska sprutas från exsiccatorn och placera den i kammaren. Se till att vävnaden inte täcker sensorfönstret.
Starta förberedelserna genom att trycka på Start-knappen. Vanligtvis är prep tid runt 90 minuter. Beredningen kommer att regleras automatiskt via övervakning av matrisskiktets tjocklek och väta.
Alternativt, för att spruta matrislösningen på vävnadsytan med en automatisk spruta, använd ett lösningsmedelspumpsystem inställt på 10 psi och 0,15 milliliter per minut för att leverera matrislösningen. Ett konstant flöde av uppvärmd mantgas kommer att levereras conjointly med matrislösningen spray. Utföra bildexperiment med hög genomströmning och hög-spatial-upplösning med MALDI-IMS.
För masspektrometrimätning, definiera vävnadsområdena med hjälp av MALDI-styrprogramvaran och dataanalysprogramvaran. Förvärva spektra i ett positivt linjärt läge med ett mass-laddningsförhållandeintervall på 2, 000 till 20, 000 och en rumslig upplösning på 20 och 100 mikrometer. För att göra kalibreringen standard, lös peptidkalibreringsstandarden och proteinkalibreringsstandarden i ett till fyra-förhållande med CHCA- och TA30-lösningen och späd sedan ut den 10 gånger.
Placera en mikroliter av kalibreringsstandard på bilden på fyra olika platser. Med hjälp av molekylära histologi programvara, överlagra flera signalbilder för att hitta den rumsliga korrelationen av olika signaler såsom olika amyloid beta peptider colocalizing i senil plack och arteriell väggar. Den cerebrala amyloid angiopathy eller CAA fenotyper av patienten nummer tre var mest framträdande i denna studie.
MALDI-IMS av denna patientens hjärnvävnad visualiseras tydligt att amyloid beta 1-42 och amyloid beta 1-43 var företrädesvis deponeras som senil plack i cerebral parenkym. Däremot var kortare amyloid betaversioner såsom amyloid beta 1-36 till 1-41 preferentigt deponeras på leptomeningeal Vaskulär områden. det fanns inga betydande signaler i den icke-patologiska kontrollen.
Distributioner av amyloid beta 1-40 och amyloid beta 1-42 validerades ytterligare med immunohistokemi med hjälp av intilliggande frysta avsnitt av vävnaderna. Anti-amyloid beta 1-40 antikroppen märkt CAA och avslöjade amyloid beta 1-40 är företrädesvis deponeras i leptomeningeal blodkärl, vilket är tydlig kontrast till fördelningen av amyloid beta 1-42 i cerebral parenkym som senil plack. Visas här är en segmentering karta erhålls med en bisecting k-medel analys tillämpas på samma avsnitt från patient nummer tre.
Denna klustring metod identifierade framgångsrikt plakett-liknande strukturer i parenkym och Vaskulär strukturer i den subarachnoid utrymmet. Det är intressant att hitta ett litet cirkulärt område i parenkymet som detekteras precis runt en liten arteriole i parenkymen samt i det subarachnoid utrymmet. Detta verifieras av enstaka jonbilder av dessa individuella amyloid beta peptider.
Det finns en gräns för att spåra ett brett spektrum av amyloid betaversioner samtidigt även om du använder de specifika antikropparna. Här visar vi fördelningen av amyloid beta i mänskliga hjärnor genom att använda den banbrytande MALDI imaging masspektrometri metod. Vi tror att detta bidrag gör genombrott i Alzheimers sjukdom forskning eftersom denna rapport erbjuder karakterisering av hela uppsättningen av amyloid betaproteiner i mänskliga autopsied hjärnor.
Det mest imponerande konstaterandet är att endast en enda aminosyra förändring vid C-terminalen av amyloid betaprotein gör en drastisk förändring i deras distribution. Vävnadsprepareringsstegen är avgörande för att erhålla en effektiv jonisering av aggregerade proteiner i mänsklig hjärnvävnad. Homogena cocrystallization av analyten med matrixes avgörande för hög känslighet och artefakt-free avbildning.