Saeid Ghavami blev støttet af sundhed Science Centre opererer tilskud, CHRIM drift tilskud og forskning Manitoba nye Investigator opererer Grant. Javad Alizadeh blev støttet af forskning Manitoba studentship. Shahla Shojaei blev støttet af en Health Science Foundation opererer grant og den MITACS fremskynde postdoc stipendium. Adel Rezaei Moghadam blev støttet af en NSERC drift tilskud, som blev holdt af Joseph W. Gordon. Amir A. Zeki blev støttet af NIH/NHLBI K08 award (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los venligst anerkender støtte fra Rikke yde #2016/21/B/NZ1/02812, støttet af LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (region centrum-Val de Loire, Frankrig) gennem sin Smart Loire dalen generelle Program og samfinansieret af Marie Sklodowska-Curie aktioner, yde #665790. Simone da Silva Rosa blev støttet af UMGF studentship.

1. bestemmelse af RhoA lokalisering ved hjælp af membran/Cytosol fraktionering
<ol><li>
Celle kultur og simvastatin behandling
	<ol>
<li>Frø 50.000 af U251 celler i en 100 mm fad og kultur dem i Dulbeccos ændrede Eagle's medium (DMEM) (høje glukose, 10% føtal bovint serum [FBS]).</li>
		<li>Når 30% sammenflydende, behandle cellerne ved at fjerne mediet og tilføje simvastatin-holdige medium til det (10 µM af simvastatin opløst i dimethylsulfoxid [DMSO]), og der inkuberes i 36 timer ved 37 ° C<...

<ol>
	<li>Yeganeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+mevalonate+cascade+as+a+new+therapeutic+approach+in+heart+disease,+cancer+and+pulmonary+disease.">Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).</li><li>Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ras+protein+family:+evolutionary+tree+and+role+of+conserved+amino+acids.">The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids.</a> Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+family+GTPases.">Rho family GTPases.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).</li><li>Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ras+protein+superfamily:+evolutionary+tree+and+role+of+conserved+amino+acids.">The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids.</a> The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).</li><li>Cherfils, J., Zeghouf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+small+GTPases+by+GEFs,+GAPs,+and+GDIs.">Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).</li><li>Shojaei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perillyl+Alcohol+(Monoterpene+Alcohol),+Limonene.">Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene.</a> Enzymes. 36, 7-32 (2014).</li><li>Ghavami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mesenchymal+cell+death+by+mevalonate+cascade+inhibition:+integration+of+autophagy,+unfolded+protein+response+and+apoptosis+focusing+on+Bcl2+family+proteins.">Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).</li><li>Alizadeh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mevalonate+Cascade+Inhibition+by+Simvastatin+Induces+the+Intrinsic+Apoptosis+Pathway+via+Depletion+of+Isoprenoids+in+Tumor+Cells.">Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells.</a> Scientific Reports. 7, 44841 (2017).</li><li>Ghavami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mevalonate+cascade+regulation+of+airway+mesenchymal+cell+autophagy+and+apoptosis:+a+dual+role+for+p53.">Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53.</a> PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).</li><li>Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Rho+GTPases+in+breast+cancer.">Role of Rho GTPases in breast cancer.</a> Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).</li><li>DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GDIs:+central+regulatory+molecules+in+Rho+GTPase+activation.">GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation.</a> Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).</li><li>Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'invisible+hand':+regulation+of+RHO+GTPases+by+RHOGDIs.">The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).</li><li>Etienne-Manneville, S., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+in+cell+biology.">Rho GTPases in cell biology.</a> Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).</li><li>Ghavami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geranylgeranyl+transferase+1+modulates+autophagy+and+apoptosis+in+human+airway+smooth+muscle.">Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).</li><li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC.">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).</li><li>Ghavami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statin-triggered+cell+death+in+primary+human+lung+mesenchymal+cells+involves+p53-PUMA+and+release+of+Smac+and+Omi+but+not+cytochrome+c.">Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).</li><li>Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+statin-mediated+inhibition+of+small+G-protein+function.">Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).</li><li>Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geranylgeranylation+but+not+GTP-loading+of+Rho+GTPases+determines+T+cell+function.">Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function.</a> Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).</li><li>Waiczies, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geranylgeranylation+but+not+GTP+loading+determines+rho+migratory+function+in+T+cells.">Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells.</a> Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).</li><li>Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+on+Recent+Advances+in+the+Analysis+of+Isolated+Organelles.">Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles.</a> Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).</li><li>Berndt, N., Sebti, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+farnesylation+and+geranylgeranylation+in+vitro,+in+cultured+cells+and+in+biopsies,+and+the+effects+of+prenyl+transferase+inhibitors.">Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors.</a> Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).</li><li>Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+integrin+regulation+and+signaling+events+in+three-dimensional+systems.">Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems.</a> Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).</li><li>Oliver, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HPV16+E6+binding+protein+Tip-1+interacts+with+ARHGEF16,+which+activates+Cdc42.">The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42.</a> British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).</li><li>Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK2+modulates+MEK1+activity+through+the+Rho+GTPase+pathway.">WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway.</a> Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).</li></ol>

Her beskriver vi en nøjagtige metode til at måle små GTPase prenylation og GTP bindende vist som små GTPase subcellulært lokalisering (membran versus cytosol) og Rho GTP lastning. Små GTPases er udtrykt i eukaryote celler og spiller en afgørende rolle i cellulære spredning, motilitet og struktur. Både prenylation og GTP bindende er involveret i reguleringen af GTPase aktivitet; Derfor er assays til at evaluere prenylation og GTP binding af disse proteiner vigtige værktøjer for celle biologer<sup class...

Rho GTPases er en gruppe af små proteiner (21-25 kDa), som er godt bevaret i hele udviklingen, og danner en unik underfamilie i Ras superfamilien af små GTPases. I hver underfamilie inden for denne superfamilien er der en delt G domæne kerne, der er involveret i GTPase aktiviteter og nukleotid udveksling1. Forskellen mellem familien Rho og andre Ras underfamilierne er tilstedeværelsen af et "Rho Indsæt domæne" inden for de 5th β strand og de 4th α helix i den lille GTPase domæne2.
Baseret på den seneste klassificering, anses Rho GTPases for en familie af signalering proteiner, der passer ind i Ras GTPase superfamilien3. Pattedyr Rho GTPases har 22 medlemmer baseret på deres særlige funktion og generelle karakterisering4 , RhoA, Rac1 og Cdc42 er blandt de mest studerede medlemmer i denne gruppe. Rho GTPases er knyttet til intracellulær signalering veje via en stramt reguleret mekanisme, som er afhængige af molekylære switches via protein posttranslationelle modifikationer5.
GTP lastning og hydrolyse er vigtige mekanismer i aktivering/deaktivering cyklus af små Rho GTPases og er reguleret via aktivering af GTPase proteiner (huller). Hullerne er ansvarlig for GTP hydrolyse og arbejde i koncert med guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs), som er ansvarlige for GTP-loading reaktion. Rho BNP dissociation hæmmere (GDIs) giver yderligere regulering af små Rho GTPases via binding til BNP-bundet Rho GTPases. Dette hæmmer BNP dissociation og letter binding af små Rho GTPases væk fra de aktive intracellulære membran websteder. Der er også yderligere regulering af Rho GTPase proteiner med prenylation af GDIs, som regulerer både nukleotid hydrolyse og udveksling og kontrol BNP/GTP cykling1,6,7,8.
Både GTP-loading og Rho GTPase prenylation er involveret i Rho GTPase frie bevægelighed mellem cytosol og cellemembraner ved at ændre de lipofile egenskaber af disse proteiner1,9. De ovennævnte tilsynsmyndigheder interagere med fosfolipider i cellemembranen og andre modulerende proteiner af BNP/GTP exchange aktivitet10. Derudover blokere GDIs, dissociation hæmmere, både GTP hydrolyse og BNP/GTP udveksling. GDIs hæmmer dissociation af de inaktive Rho proteiner fra BNP, og derfor deres interaktion med downstream effektorer. GDIs også regulere cykling af GTPases mellem cytosol og membran i cellen. Aktivitet af Rho GTPases i vid udstrækning afhænger af deres bevægelse til cellemembranen; således betragtes GDIs som kritiske regulatorer, der kan udskille GTPases i cytoplasma gennem skjule deres hydrofobe region/domæner11,12.
Den dynamiske cyklus af GTP-indlæsning/GTP hydrolyse er afgørende for Rho GTPase at have en optimal signalering og funktion i alle faser af dens aktivering cyklus. Nogen form for ændringer i denne proces kan medføre efterfølgende ændringer i cellefunktioner reguleret af Rho GTPase, såsom celle polaritet, spredning, morfogenese, cytokinesis, migration, vedhæftning og overlevelse13,14.
Den nuværende protokol giver læserne med en detaljeret metode til at overvåge små RhoA GTPase aktivering via undersøgelse af deres prenylation og BNP/GTP lastning. Denne metode kan også bruges til at registrere prenylation og GTP bindingen af en bred vifte af små GTPases. GTPase-forbundet immunosorbent assay kan bruges til at måle niveauet af aktivering af andre former for GTPases, Rac1, Rac2, Rac3, H-, K-eller N-Ras, Arf og Rho15. Farmakologiske agent simvastatin bruges som eksempel, da det blev for nylig rapporteret at være involveret i reguleringen af små Rho GTPase prenylation og aktivitet8,9,14,16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1055px;" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">DMEM high Glucose</td>
			<td style="width:228px;">VWR (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">VWRL0101-0500</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:228px;">VWR (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">CA45001-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:228px;">VWR (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">97062-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid)</td>
			<td style="width:228px;">VWR (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">CA71007-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid)</td>
			<td style="width:228px;">VWR (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">CAAAJ60767-AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td style="width:228px;">VWR (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">CA97061-340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:228px;">VWR (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">CABDH9214-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-Hydroxymethylaminomethane</td>
			<td style="width:228px;">VWR (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">CA71009-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td style="width:228px;">Biorad (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td style="width:228px;">Biorad (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:228px;">Sigma/Aldrich (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">P8340-5ML</td>
			<td>1:75 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rho-GTPase Antibody Sampler Kit</td>
			<td style="width:228px;">Cell Signaling (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">9968</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pan-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:228px;">Cell Signaling (Canada)</td>
			<td style="width:123px;">4068</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GAPDH antibody</td>
			<td style="width:228px;">Santa Cruz Biotechnology (USA)</td>
			<td style="width:123px;">sc-69778</td>
			<td>1:3000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format)</td>
			<td style="width:228px;">Cytoskeleton Inc. (USA)</td>
			<td style="width:123px;">BK121</td>
			<td>Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">RhoA Antibody</td>
			<td style="width:228px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:123px;">2117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">ECL</td>
			<td style="width:228px;">Amersham-Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:123px;">RPN2209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A6154-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td style="width:228px;">Molecular Devices&#160;</td>
			<td style="width:123px;">1612071A</td>
			<td style="width:172px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:532px;">Nonidet P-40</td>
			<td style="width:228px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">11332473001</td>
			<td style="width:172px;">non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">DMSO</td>
			<td style="width:228px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">PBS</td>
			<td style="width:228px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5493-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">Phophatase Inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:228px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P5726-5ML</td>
			<td>1:75 Dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of small gtpase prenylation and gtp binding using membrane fractionation and  gtpase-linked immunosorbent assay

Familien Rho GTPase tilhører Ras superfamilien og omfatter cirka 20 medlemmer hos mennesker. Rho GTPases er vigtige i reguleringen af forskellige cellulære funktioner, herunder cytoskeletal dynamics, celle motilitet, celle polaritet, cytoskeletale vejledning, vesikulær handel og cellecyklus kontrol. Ændringer i Rho GTPase signalering spille en væsentlig regulerende rolle i mange patologiske tilstande, såsom kræft, centrale nervesystem sygdomme og immunforsvar-afhængige sygdomme. Den posttranslationelle modifikation af Rho GTPases (dvs., prenylation af mevalonsyre pathway mellemprodukter) og GTP bindende er centrale faktorer, der påvirker aktivering af dette protein. I dette papir tilbydes to væsentlige og enkle metoder til at opdage en bred vifte af Rho GTPase prenylation og GTP bindende aktiviteter. Detaljer om de tekniske procedurer, der er brugt er forklaret trin for trin i dette håndskrift.

Membran fraktionering:
Ultracentrifugering blev brugt til fraktionering af membranen og cytosol komponenter. Som vist i figur 1, supernatanten indeholder det cytosole brøkdel, og pellet membran brøkdel. Overfloden af RhoA i cytosole andmembrane fraktioner fra U251 celler blev undersøgt efter behandlingen med simvastatin ved hjælp af immunoblotting. Renhed og lastning kontrol af ...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay at JoVE.com

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Her beskriver vi en protokol for at undersøge prenylation og Guanosinmonofosfat-5'-trifosfat (GTP)-lastning af Rho GTPase. Denne protokol består af to detaljerede metoder, nemlig membran fraktionering og en GTPase-forbundet immunosorbent assay. Protokollen kan bruges til at måle prenylation og GTP indlæsning af forskellige andre små GTPases.

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Den lille Rho GTPase er et protein af en superfamilie med forskellige cellulære funktion. For eksempel er disse proteiner involveret i reguleringen af celle skæbne, cellulære reaktion på en stress, cellulære motilitet, og celle cyklus. Aktiviteten af en lille Rho GTPase protein er reguleret af post-translationel modifikation.Disse ændringer er involveret i en stram regulering af deres aktiviteter. Som et eksempel, protein prenylation og GTP obligation er de vigtigste post-oversættelse modifikation af disse proteiner. Mit laboratorium har for nylig ændret og udviklet enkel metode til at undersøge den post-translationelle ændring af disse superfamilie proteiner.Til dette formål har vi brugt 251 glioblastoma cellelinjer, og målrette dem med simvastatin, og målt post-translationel ændring af disse proteiner. Metoden indebærer subcellulære fraktionering og GTP bundet protein til dette protein superfamilie. Til dette formål har vi brugt lokalisering af RhoA, og GTP bundet til RhoA at måle post-translationel ændring af dette protein.Fjern celler fra 37 graders inkubator. Kig på cellerne under mikroskopet for at bekræfte sammenløbet. Cellerne skal være på 70 til 80 procent sammenløb.Vask cellerne én gang med kold PBS. Tilsæt fem milliliter EDTA, og læg cellerne tilbage i 37 graders inkubator i fem minutter. Efter fem minutters inkubation indsamles EDTA med celler i et 15 mil rør.Læg røret i en isboks, og fortsæt til centrifugen. Opret centrifugen til 1500 g ved fire grader, og drej cellerne i fem minutter. Efter spin, fjerne supernate, og tilsæt en milliliter kold PBS.Triturate cellerne godt. Celleblandingen overføres til et nyt mærket 1,5 milliliterrør. Efter overførsel fortsættes centrifugen.Indstil centrifugen til 1500g ved fire grader, og drej cellerne i fem minutter. Tjek pelletstørrelsen. Læg prøverne på is.Kassér supernate helt, uden at forstyrre pellet. Tilføj buffer 1. Bland godt ved pipettering op og ned.Fortsæt til sonikering. Indstil sonicator i fem cyklusser, fem sekunder hver, og gentag tre gange. Sonikering bør fortsætte på is, men er ikke vist i videoen, til illustrative formål.Fortsæt til ultracentrifuge. Brug en ultracentrifuge til at adskille cellehomogenater i cytoplasmatiske og membranfraktioner. Indstil centrifugen til 100, 000 g i 35 minutter, ved fire grader.Tjek pelletstørrelsen. Adsklog overbygningen. Saml supernate helt, være omhyggelig med ikke at forstyrre pellet.Superædatet er den cykliske brøk. Placer supernate i en nyligt mærket rør. Tilføj Buffer to til pellet.Dette er membranfraktionen. Bland godt ved pipettering op og ned. Fortsæt til proteinbestemmelse og western blot prøvepræparat.Læg prøverne på en SDS-PAGE med en 15%gel. Bekræft proteinoverførsel ved at visualisere molekylvægtmarkøren eller ved hjælp af en Ponceau-plet. Tilsæt primære antistoffer til immunblotting analyse.Vi bruger Rac1/2/3, Cdc42 og RhoA. Bring kulturpladerne ud af kuvøsen. Kig på cellerne under mikroskopet for at bekræfte sammenløbet.Cellerne skal være 70 til 80% sammenløb. Placer kulturpladen på is. Aspirere medierne og vask cellerne med iskold PBS pH'd til 7,2.Aspirere PBS. Vip pladerne på is i et ekstra minut for at fjerne alle rester af PBS. Resterende PBS påvirker denne analyse negativt.Lys cellerne i et passende volumen af iskold lysis buffer indeholdende protease og fosfatasehæmmere. Høstcelle lyser med celleskraberen. Hæld kulturpladen til denne teknik.Overfør lysatet i et mærket, iskoldt kryorør, og hold dig på is. Bland grundigt ved hjælp af en vortex. Hold 10 mikroliter af lysatet for en proteinanalyse.Snap fryse den resterende celle lysat i flydende nitrogen. Overfør snap frosne kryorør til et minus 80 fryser. Gem disse prøver.Bemærk, at prøverne ikke bør opbevares længere end 14 dage. Forbered celle lysater fra de andre kultur plader ved at gentage trin en til otte, én efter én. Arbejd hurtigt, og efterlad aldrig prøverne på is i mere end 10 minutter.Håndter aldrig alle kulturplader samtidigt. Mål proteinkoncentrationen. Der beregnes en mængde lysisbuffer for at normalisere proteinkoncentrationen mellem prøverne.Bemærk: en milligram per milliliter er normalt den bedste, dog, 0.3 til to milligram per milliliter kan påvises. Forbered en blind kontrol ved at tilføje 60 mikroliter lysis buffer, og 60 mikroliter af bindende buffer til en mikrotube. Forbered en positiv kontrol ved at tilføje 12 mikroliter af Rho kontrol protein, 48 mikroliter lysis buffer, og 60 mikroliter af bindende buffer.Tag Rho affinitet plade ud af sin taske og sted på is. Opløs pulveret i brøndene med 100 mikroliter iskoldt destilleret vand. Hold pladen på is.Tø snap frosne celle lysates i et vandbad sat til 25 grader Celsius. Tilsæt den beregnede mængde iskold lysis buffer til hver prøve for at normalisere proteinkoncentrationen. Overfør 60 mikroliter af normaliserede iskolleprøver til mikrorør, og tilsæt 60 mikroliter bindingsbuffer.Bland grundigt, og holde på is. Fjern vandet helt fra mikropladen ved kraftig svippede, efterfulgt af fem til syv hårde haner på en laboratoriemåtte. Tilføj 50 mikroliter af de normaliserede prøver, en blind kontrol, og en positiv kontrol til brøndene i to eksemplarer.Placer pladen på en orbital shaker i 30 minutter ved fire grader Celsius. Bemærk: Shakerens hastighed skal indstilles til 300 omdr./min. Fjern prøverne fra pladen ved at svippe, og vask to gange med 200 mikroliter af rumtemperaturvaskebufferen.Fjern vaskepudet kraftigt fra brøndene efter hver vask ved at svippe, efterfulgt af at banke, og hold pladen på bænken ved stuetemperatur. Tilsæt 200 mikroliter af rumtemperatur antigen-præsenterer buffer i hver brønd, og inkubere ved stuetemperatur i to minutter. Svirp opløsningen ud fra brøndene, og vask tre gange med 200 mikroliter af rumtemperaturvaskebufferen.Tilføj 50 mikroliter frisk udarbejdet en til 250 anti-RhoA primære antistof til hver brønd. Placer pladen på en orbital shaker i 45 minutter ved 300 rpm, sat til 25 grader Celsius. Svirp opløsningen ud fra brøndene, og vask tre gange med 200 mikroliter vaskepude ved stuetemperatur.Tilføj 50 mikroliter frisk udarbejdet en til 250 anti-RhoA sekundært antistof til hver brønd. Placer pladen på toppen af en orbital shaker i 45 minutter, ved 300 rpm, sat til 25 grader Celsius. Forbered HRP detektionsreagesangen ved at blande lige store mængder reagens A og reagens B.Flick opløsningen ud fra hver brønd, og vask tre gange med 200 mikroliter vaskebuffer for stuetemperatur.Der tilsættes 50 mikroliter frisklavet HRP-detektionsreage til hver brønd. Aflæs luminescenssignalet inden for tre til fem minutter for at opnå et maksimalt signal. Analysér resultaterne ved hjælp af en passende softwarepakke.Vores resultater viser, at simvastatin reduceret lokalisering af RhoA i membranen fraktion. Hvad øget er ophobning i den cykliske fraktion. Interessant, simvastatin øget GTP bundet til RhoA.Why?Vi forventer, at simvastatin mindsker denne aktivitet. Det er meget vigtigt, at de måler både subcellulære lokalisering af dette protein, og måle GTP bindende for dette protein for at få en endelig vurdering af aktiviteten af de små Rho GTPases.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling af G-proteinkoblet receptorreceptor via radio-mærket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjernemembran Fraktionering: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilnærmelse til vurdering af subsynaptisk protein lokalisering

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering påvisning af LRRK2 aktivitet ved hjælp af SDS-PAGE med en fosfat-bindende Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionering for opløsning af opløselige og uopløselige Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikation af Havlampretten feromoner ved hjælp af Bioassay-styrede fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...