Name: intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Dette projekt blev støttet af NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 og Dept. af kliniske videnskaber formidling midler

For disse eksperimenter blev alle dyreforsøg godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) i North Carolina State University.
1. forberedelse til kultur
Bemærk: Alle reagenser er angivet i Tabel af materialer. Specifikke vækstfaktor koncentrationer er angivet i tabel 1.
<ol><li>Der fremstilles en 0,5 M ethylendiamintetra syre (EDTA) opløsning i destilleret deioniseret vand (ddH2O). Bland tilstrækkeligt og ph indstilles til 7.4 ved hjælp af NaOH og/eller HCl løsninger. Bemærk: Udgør EDTA stamopløsning frisk før hvert forsøg.</li>
	<li>Forberede dissociation reagens #1 (DR #1) som følger og Anbring på is: Kombiner fosfatbufferet saltopløsning uden Ca2 + og Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT), 10 µM Y27632 og 1 X antibiotikum-antimykotikum løsning (anti-Anti) med penicillin, streptomycin og amphotericin B. Bemærk: Tilføje Y27632 umiddelbart før væv samling.</li>
	<li>Forberede dissociation reagens #2 (DR #2) som følger og i et 37 ° C vandbad: kombinere PBS uden Ca2 + og Mg2 +, 0,5 M EDTA, 10 µM Y27632 og 1 X anti-Anti. Bemærk: Tilføje Y27632 umiddelbart før væv samling.</li>
	<li>Forberede intestinale epitel stamceller (IESC) medier som følger: Mix 25 mL avanceret DMEM/F12 medium med 1 X N2 supplement, 1 X B-27 supplement, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax og 1 X anti-Anti. Opbevares ved 4 ° C indtil brug.</li>
	<li>Forberede en master mix af nedsat vækst faktor basalmembranen matrix (matrix) og supplerende vækstfaktorer som følger: tø matrix på is. I et microcentrifuge rør, tilføje 100 ng/mL rekombinant humant Noggin, 500 ng/mL rekombinant humant R-Spondin 1, 50 ng/mL rekombinant human epidermal vækst faktor (EGF), 100 ng/mL rekombinant human Wnt3a, 10 mM nicotinamid, 10 nM gastrin, 500 nM AV-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 og 2,5 µM glykogen syntase kinase 3 hæmmer (GSK3i, CHIR99021). Når matrix er optøet, supplere med vækstfaktor mix (gør master mix) og opbevares på is. Bemærk: Være omhyggelig med at undgå at indføre luftbobler, som dette vil skabe artefakt i matrix patty under plating.</li>
	<li>Pre varm en 24-godt vævskultur fad i et 37 ° C inkubator før du starter celle isolationsprocedurer.</li>
</ol>2. kirurgiske Model af iskæmi og væv samling
<ol><li>Brug otte til ti uger gamle Yorkshire krydset svin af begge køn (anbefales). Fjerne alle feed 16-18 h før operation. Tillad svin adgang til vand på alle tidspunkter.</li>
	<li>Planlægge svin at ankomme mindst 48 timer før eksperimenter til miljømæssige akklimatisering. Bemærk: Uddannet veterinær og/eller laboratorium teknikere under tilsyn af en bevilget veterinarian give rutine dyrs pleje og bistand med bedøvelsesmiddel procedurer.</li>
	<li>Premedicate grisen med xylazin (1,5 mg/kg intramuskulært (IM)) og ketamin (11-20 mg/kg (IM))15. Når adstadig, intubate svin orotracheally.</li>
	<li>Vedligeholde svin under generel anæstesi med isofluran (2-5%) fordampet i 100% O2 indtil tidspunktet for aktiv dødshjælp.</li>
	<li>Placer en intravenøs (IV) kateter (øre vene anbefales) og administrere en erstatningsvæske som laktat ringers løsning til en vedligeholdelse af 15 mL/kg/h.</li>
	<li>Udfør rutine bedøvelsesmiddel overvågning herunder pulsoximetri, Elektrokardiografi og indirekte blodtryk målinger15. Overvåge grisens respirationsfrekvens og indsats og ventilere manuelt eller mekanisk efter behov hvis ende tidevandsenergi CO2 stiger over 55-60 mmHg. Bemærk: Passende anæstesi er bekræftet gennem løbende overvågning af tendenser i puls (range 80-130 slag/min), ikke-invasiv blodtryk (gennemsnitlige arterietryk 75-100 mmHg), og respirationsfrekvens (10-25 vejrtrækninger/min)16og periodisk kontrol for fravær af kæben og anal tone. Dybde af anæstesi kan også blive bedømt af graden af muskelafslapning og muskel fasciculation efter kirurgisk stimulus. Okulær reflekser er normalt ingen værdi16. Analgesi kan leveres som anvist af institutioner IACUC politik. I dette tilfælde kan en opioid, såsom buprenorphin, administreres under kirurgi.</li>
	<li>Placer grisen på en varmepude og begrænse i dorsal recumbency for den kirurgiske procedure.</li>
	<li>Barbere den ventrale maven og prep ved hjælp af kirurgisk krat (klorhexidin opløsning) og isopropylalkohol.</li>
	<li>Gøre en 8-10-cm ventrale midterlinjen indsnit ved hjælp af en skalpel klinge centreret på navlen adgang til maven.</li>
	<li>Identificere tyndtarmen (jejunum) ca 40 cm oral ileocecal krydset. Afgrænse ten-cm lang sløjfer i jejunum ved circumferentially ligating tarmen to gange, én cm mellem hver ligatur, før oprettelse af efterfølgende loops 10 cm beliggende mundtligt (figur 1).</li>
	<li>Opret to løkker pr. tidspunkt af iskæmi støder op til hinanden, én til iskæmi og én for iskæmi med en yderligere 1h af reperfusion hvis det ønskes. For at skabe komplette iskæmi (ingen strøm af enten arterier eller vener), klemme eller ligate mesenteriallymfeknuderne Vaskulaturen ved hjælp af bulldog vaskulære klemmer, buede Halstead mosquito hemostats eller 2-0 ikke-resorberbare silke for 1, 2, 3 og 4h og derefter fjerne klemmer for 1h reperfusion, hvis det ønskes. Bemærk: Forfatterne lavet alle sløjfer af iskæmi i rækkefølge startende med 4h iskæmisk loop og skred bevæger sig proksimalt (at minimere samlede kirurgi tid). For at tage fat på muligheden for, at nabolandet iskæmisk intestinal segmenter kan beskadige tilstødende sløjfer, kan rækkefølgen af iskæmisk sløjfer varieres. Dette kan ændre kirurgisk totaltid. Bemærk: Tidsrammen for reperfusion kan varieres baseret på forskningsspørgsmål af interesse eller hvis terapier ønsker skal testes i løbet af perioden reperfusion. Men som vævsskader bliver mere alvorlig i at øge varigheden af iskæmi alene, reperfusion skade sandsynligvis ikke bidrage til yderligere epitelial skade. Reperfusion sandsynligvis spille en rolle efter milde perioder af iskæmisk skade.</li>
	<li>I mellem iskæmi tid point, holde maven dækket eller lukket med en steril håndklæde og/eller et håndklæde klemme. Bemærk: Inden for et enkelt dyr for dette eksperiment, otte iskæmisk segmenter kan oprettes. Identificere en yderligere jejunal segment, mindst 5-10 cm proksimalt for den sidste iskæmiske sløjfe, der vil tjene som en intern normal kontrol.</li>
	<li>Hindre ca tre mesenteriallymfeknuderne skibe pr. bulldog vaskulære klemme eller buede Halstead myg hemostat. Pleje skal tages under hemostat program, fordi fartøjerne, der er let traumatiseret. Prøv at stable fartøjer i kæberne af klemmerne.</li>
	<li>I slutningen af forsøget, følgende eutanasi med pentobarbital 85-100 mg/kg IV, indsamle alle sløjfer af væv ved hjælp af metzenbaum saks, efter døden er blevet bekræftet med ingen hjerteslag auscultated og tab af cornea refleks. Start ved at indsamle en kontrol stykke af normale jejunum mindst 5 - 10 cm proksimalt for den sidste iskæmiske sløjfe.</li>
	<li>Adskille og gemme loops fra hvert skade tidspunkt i små beholdere med iskolde PBS indtil klar til krypten isolation. Bemærk: Hvis det ønskes, gør iskæmisk loops længe nok til at opdele i separate prøver til histologi og tarm stamcelle kultur; Men forfatterne har fundet at sløjfer større end ca. 10 cm lang er mest sandsynligt at blive hæmoragisk.</li>
</ol>3. crypt (stamceller) Isolation fra iskæmisk og kontrol sløjfer
<ol><li>Invertere hver sløjfe af tyndtarmen ved hjælp af en 20-gauge tråd og væv pincet til at eksponere slimhinden. Binde toppen og bunden af løkken sikkert til wire ved hjælp af sutur (2-0 ikke-resorberbare silke eller tilsvarende).</li>
	<li>Efter inversion, skyl hver sløjfe i is koldt PBS til at fjerne luminale snavs.</li>
	<li>Placere prøver straks i 50 mL konisk rør indeholdende DR #1 på is i 30 min.</li>
	<li>Indsamle loops begynder med kontrol og følge med sløjfer af trinvist stigende varigheder af iskæmi. Loops fra mindre beskadiget væv (dvs. kontrol og 1 h iskæmisk væv) kan rystes kraftigt, snapper håndled for de bedste resultater. Væv fra alvorligt beskadiget væv (3 og 4 h af iskæmi) bør være forsigtigt rystet eller omvendt kun da for meget ryster vil forårsage krypt forstyrrelser og yderligere væv destruktion. Rør bør rystet eller omvendt hvert 5 min mens på is.</li>
	<li>Overføre prøver i DR #2 til 10 min i et 37° C vandbad. Ryste eller invertere rør hvert 5 min.</li>
	<li>Efter overførsel af væv, der centrifugeres de koniske rør indeholdende DR #1 fra 2-4 h beskadiget sløjfer til Fjern supernatanten EDTA (200 x g for 5 min). Da disse væv er stærkt beskadiget er det muligt, Krypter har allerede blevet adskilt. Fjern supernatanten og resuspend pellet med en lille mængde af PBS (5 mL) og Fortsæt til trin 3.9.</li>
	<li>Fjern prøver fra DR #2 og placere vævsprøver direkte i 25 mL koldt PBS på is (etiket som vask #1). Prøveemner på en orbitalryster på isen ved 60 rpm. Fortsætte med at ryste eller invertere hver tube for 30 s hver 2 til 5 min.</li>
	<li>Efter overførsel af væv, spin de koniske rør indeholdende DR #2 fra 2-4 h beskadiget loops til at fjerne EDTA supernatanten (200 x g for 5 min). Da disse væv er stærkt beskadiget er det muligt at Krypter har blive adskilt. Fjern supernatanten og resuspend pellet med en lille mængde af PBS (5 mL) og Fortsæt til trin 3.9.</li>
	<li>Fjerne en 50 µL alikvot fra vask #1 (eller DR) at kontrollere graden af crypt dissociation og mængden af affald. Placer væv ind i en ny 50 mL konisk rør (vask #2, #3, etc.) fyldt med 25 mL af kolde PBS og ryst, indtil intakt crypts er isoleret med minimal debris og villi. Bemærk: Målet er at være i stand til at isolere en ren brøkdel med intakt krypter og minimal debris. Hver ekstra vask vil rengøre cellerne dog for meget ryster vil begynde at resultere i sekundære væv/celle skader. Desuden opnås de bedste resultater med mindst forurening hvis Krypter er forgyldt fra en vask skridt og ikke fra en dissociation reagens trin.</li>
	<li>Fjern de resterende væv og 50 mL konisk rør på 200 x g der centrifugeres i 5 minutter for at fjerne supernatanten, så resuspend resterende krypt pellet i mindre mængde af PBS (5 mL).</li>
	<li>Ved hjælp af en omvendt mikroskop undersøge 50 µL delprøver af hver prøve at bestemme antallet af Krypter/fraktion. Målet er 50-100 Krypter/50 µL, da dette vil være størrelsen af den endelige matrix patty. Bemærk: Hvis prøven er for koncentreret, fortsætte med at tilføje kolde PBS indtil ønskede koncentration er nået. Hvis prøven er for fortyndet, bestemme antallet af delprøver, der er nødvendige for at nå ønskede krypt udbytte og justere.</li>
	<li>Alikvot passende diskenhed(er) Krypter (bestemmes af alikvote observationer) ind i et microcentrifuge rør. For eksempel, hvis prøven indeholder 50 Krypter/50 µL så alikvot 50 µL pr. patty X 3 replikater = 150 µL / microcentrifuge tube. Hvis prøven indeholder kun 25 Krypter/50 µL derefter 2 delprøver behov / patty X 3 replikater = 300 µL/tube.</li>
	<li>Pellet Krypter på 200 x g i 5 min. ved 4° C.</li>
	<li>Forsigtigt resuspend pelleted Krypter med passende mængde af master mix (50 µL pr. brønd). Blandes grundigt ved hurtigt pipettering 15 gange uden at skabe luftbobler. Bemærk: Cool pre pipette tip med kolde steril PBS inden sugning master mix. Dette vil hjælpe med at holde den master mix fra breder sig ud. Tips kan også opbevares i køleskabet og placeret i hætten umiddelbart før anvendelsen.</li>
	<li>Undvære en 50 µL master mix plus krypt droplet i midten af hvert hul i en pre varmede 24 godt plade.</li>
	<li>Inkuber kultur pladen i 30 min ved 37 ° C.</li>
	<li>Overlay hver matrix patty med 500 µL / godt af IESC media (ingen ekstra vækstfaktorer nødvendigt på dag 0, som de er indeholdt i den master mix).</li>
	<li>Tilføje 500 µL sterilt PBS til nogen ubenyttede brønde tilbage på pladen til at opretholde fugt.</li>
	<li>Tæller antallet af forgyldt Krypter på dag 0. Bemærk: Det er nyttigt at pre gitter hver celle kultur plade i kvadranter for at sikre mere præcis optælling.</li>
	<li>Tæller antallet af enterospheres hver 24 h og overvåge for enteroid udvikling dagligt.</li>
	<li>Tilføje vækstfaktorer til hver godt hver 48 h. fjerne IESC medierne hver 96 h og erstatte med 500 µL friske medier (vækstfaktorer skal derefter føjes til media).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation.">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li><li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+gastrointestinal+ischemic+injury.">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury:+progress+and+promise+for+translational+research.">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li><li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair:+the+best+offense+is+a+good+defense.">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li><li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+clinical+manifestations,+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury.">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li><li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury.">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+models+of+digestive+disease:+the+future+of+large+animal+translational+research.">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids-Current+and+future+applications.">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li><li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging &amp; Experimental Techniques, 3rd Ed. , (2015).</li><li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , (1995).</li><li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation.">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li><li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine.">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li><li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine.">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li><li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ischemia/reperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event.">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li><li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia.">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li><li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CCN1+(Cyr61)+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia/reperfusion.">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li><li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+intestinal+ischemia-reperfusion+injury.">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Udviklingen af et svin model af segmental intestinal iskæmi udvider efter tidligere murine modeller ved at give mulighed for undersøgelse af flere tidspunkter af vævsskade inden for de samme dyr. Der er flere kritiske diskussionspunkter i denne protokol, herunder korrekt fartøj ligatur, væv reperfusion og vellykket krypt cellekultur.
Ordentlig fartøj ligatur er afgørende for oprettelsen af en model af komplet iskæmi. Hvis sutur er bundet ujævnt eller klemmen ikke strammet helt, blod fra arteria tykvæggede kan fortsætte med at indtaste væv og kan ikke afslutte på grund af sammenbrud af tyndvæggede vene. Dette resulterer i ekstravasation af blod ind i lamina propria forårsager yderligere vævsskader. Imidlertid afhængigt af iskæmisk skade ved at blive undersøgt, kan komplet eller hæmoragisk iskæmi ønske. For eksempel ved at tarm transplantation, er tarmen helt adskilt fra den vaskulær forsyning (arterie og vene) under resektion fase af proceduren, hvilket resulterer i komplet intestinal iskæmi. Alternativt, men når mesenterium er vredet i løbet af en begivenhed, såsom en tarm Tarmslyng, venøs tilbagevenden er ofte blokeret første, fører til yderligere blod inden for væv inden den arterielle forsyning er blokeret, således at der skabes hæmoragisk iskæmi.
Iskæmisk skade resulterer i vævsskader starter på villus spids og strækker sig ned til bunden af crypt3. Under iskæmi, energi i form af adenosin trifosfat fortsat anvendes og genererer metabolit hypoxanthine. Når vævet er reperfused med ilt, hypoxanthine bliver metaboliseres af xanthin oxidase og producerer superoxid frie radikaler fører til slimhinde skade og tiltrækning af væv skade neutrofiler17,18. Arter forskelle i mucosal kar arkitektur samt varierende udtryk af xanthin oxidase, resultere i varierende grader af reperfusion skade3. Feline og gnavere modeller af iskæmi-reperfusion er mere modtagelige for reperfusion skader fra reaktive oxygen metabolitter19,20. Svin fandtes derimod for at have mindre xanthin oxidase, og derfor mindre reperfusion skade, hvilket gør denne model mere sammenlignelig med menneskelige intestinal iskæmi21. På dette tidspunkt, er brug af knockout eller transgene svin modeller at studere tarm skade ikke blevet beskrevet, hvilket gør dette til en stor begrænsning af denne model. Valget af den passende dyremodel afhænger sygdomsprocessen eller særlige betingelse forskeren ønsker at undersøge. For eksempel, har svin modeller af iskæmisk skade op til 6 h været beskrevet22, mest iskæmisk procedurer i murine modeller er 45-60 min.23.
Vellykket isolation af intestinal Krypter fra normale og ischemically beskadiget tarmen giver mulighed for undersøgelse af epitel opsving i kultur. Dette system tillader forsker at fokusere entydigt på epitel alene, da der ikke vaskulær forsyning eller immun celle komponent til at overveje. Dette giver mulighed for at studere epitelcelle interaktioner og opsving efter skade ud over svar på forskellige vækstfaktorer, eller behandlinger under kirurgi eller følgende krypt isolation ved at supplere dyrkningsmedier. Dette trin er fortsat den vanskeligste, som isolation fra alvorligt beskadiget sløjfer kræver blid ryster og hurtig fjernelse af EDTA-holdige løsninger i tilfælde af Krypter har bliver for tidligt adskilles. Hvis disse sløjfer af tarmen ikke er vasket grundigt, har Krypter potentiale til at blive forurenet i kultur. Som et resultat, blev antibiotikum-antimykotikum løsning føjet til både DR løsninger ud over IESC medierne. Et andet diskussionspunkt fokuserer på tarmen indsamles som en normal kontrol. Som dyr undergår anæstesi med eventuelle ændringer i systemisk væv perfusion, sammen med muligheden for cirkulerende inflammatoriske mediatorer sekundært til iskæmi, kan selv "normale" kontrol væv ikke repræsentere en ægte kontrol. Det er i disse eksperimenter, Bemærk at kontrol væv optrådte groft og histologisk sammenlignes med væv fra dyr, der ikke undergår iskæmi i andre eksperimenter (Gonzalez, L.M., upublicerede Data, 2017).
I sammendrag beskrives i denne metode en reproducerbare model af svin intestinal iskæmi, der nøje modeller, hvad der sker i menneskets iskæmisk skade. Derudover isolering af intestinal stamceller fra iskæmisk loops er beskrevet, som tjener til at studere epitelial reparation og mulige svar på behandling i kultur.

Tarm iskæmisk skade, resultatet af nedsat ilt tilgængelighed på grund af en reduktion eller fuldstændig okklusion af blodgennemstrømningen til tarmen, forbliver en væsentlig årsag til morbiditet og mortalitet i menneskers og dyrs patienter1,2. Iskæmisk skade, samt efterfølgende betændelse og cellulære infiltration, fører til slimhinden barriere kompromis. Den slimhinde barriere er kritiske i forebyggelse af bakteriel omplantning og tilknyttede toksiner i systemisk cirkulation3,4. Den efterfølgende reperfusion af iskæmisk væv kan resultere i dannelse af skadelige reaktive ilt arter, der kan forværre skaden5. Da intestinal iskæmi er sjældent forebygges, har mest aktuelle forskning fokuseret på fremme teknikker til tidlig påvisning af iskæmi og udviklingen af nye terapeutiske metoder, der reducerer reperfusion skade eller target slimhinde reparation.
Dyremodeller har været flittigt brugt til at udvide vores grundlæggende videnskab viden om iskæmi-reperfusion skade og er fortsat afgørende for Translationel forskning. Gnavere modeller har været den mest udbredte på grund af deres evne til at være genetisk manipulerede6. For nylig dog har brugen af store dyremodeller, specielt grisen, anbefalet for fremtidige translationel undersøgelser på grund af en række fordele, herunder svin anatomiske og fysiologiske ligheder med mennesker7,8. En bred vifte af skade modeller er blevet udviklet for at studere iskæmi-reperfusion skade og omfatter komplet vaskulære okklusion, lav-flow iskæmi og segmental mesenteriallymfeknuderne vaskulære okklusion. En fuldstændig gennemgang af disse modeller er uden for realm af denne artikel, men forfatterne direkte læsere til en nylig revision3.
Ud over i vivo modeller tilbyder brug af ex vivo cellulære kultur systemer et lovende redskab for at studere intestinal homøostase og reparation efter skade. Tarm stamceller er ansvarlig for cellulær spredning og omsætning af den intestinale epitel foring. Når isoleret fra normale eller tilskadekomne tarmen, intestinal stamceller kan opretholdes i kultur, og tjene som et redskab eller en model til at undersøge stamceller og epitelcelle biologi. Metoder til at isolere og etablere disse tre-dimensionelle kultur systemer (kaldes enteroids og colonoids når stammer fra små og store tarmen, henholdsvis) er blevet beskrevet for en række arter og organ systemer9,10 ,11,12,13. Specifikt, i mave-tarmkanalen, har systemerne kultur været anvendt til model gastrointestinale sygdomme herunder kræft, patogen infektion og inflammatoriske tarm sygdom14. På dette tidspunkt er der ingen rapporter, der beskriver den isolation og vedligeholdelse af intestinal stamceller fra ischemically sårede tyndtarmen i alle arter. Derfor, her vi beskrive processen med intestinal iskæmi i en roman, store dyr svin model, hvilket resulterer i reproducerbar skade og evnen til at isolere intestinal stamceller fra normale og ischemically sårede tarmen for yderligere studier af Recovery ex vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BP-399</td>
			<td style="width:167px;">Dilute 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Distilled, deionized water (ddH2O)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to prepare EDTA and PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">20688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">ED45</td>
			<td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Y-27632</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">B-27 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Glutamax</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-096</td>
			<td>Anti-Anti solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Wnt-3a</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">5036 WN/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Rspondin1</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">4645- RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Noggin</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">LY2157299</td>
			<td style="width:107px;">SelleckChem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">52230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:107px;">Cayman Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Human [leu]15-Gastrin 1</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">SB202190</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">A83-01</td>
			<td style="width:107px;">Tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Water, WFI Quality</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Matrigel Matrix, GFR</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">356231</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">24 Well Culture Dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Conical Tube, 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Scalpel Handle</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">504169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Debakey Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501752</td>
			<td>Curved or straight</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Metzenbaum Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mosquito Forceps, Curved</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td>503724-12</td>
			<td>Curved or straight (503728-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td style="width:107px;">Stoelting Co.</td>
			<td>52120-40P</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Silk, 2-0&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">685S-BUT</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Towel Clamps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Needle Holder</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">V503382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Wire suture, 20 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">19075</td>
			<td>Cut and straighten before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Surgical Towels</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">ST1833</td>
			<td>Any similar product is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Lactated Ringers Solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">VINV-CHMX-SCRB</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isopropyl Alcohol 70%</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">MS071HS</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">IV catheter, 22 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">2225PUR</td>
			<td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Xylazine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Ketamine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">11695-6835-1</td>
			<td>Controlled medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isoflurane solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10015516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td>
			<td style="width:107px;">Vortech Pharm.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Heating pad&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tpump Core Warming System; others are available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Mindray Datascope Monitor</td>
			<td style="width:107px;">Mindray North America</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Vetland Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Fluid Pump</td>
			<td style="width:107px;">Abbott Hospira</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

Intestinal iskæmi stadig er en væsentlig årsag til morbiditet og mortalitet i human- og veterinærmedicinske patienter. Mange sygdomsprocesser resultere i intestinal iskæmi, når blodforsyningen og derfor ilt er faldet til tarmen. Dette fører til intestinal barriere tab og skader på det underliggende væv. Tarm stamceller findes i bunden af Krypter af Lieberkühn og er ansvarlig for intestinal fornyelse under homøostase og følgende skade. Ex vivo celle kultur teknikker har tilladt for vellykket studiet af stem epitelcelle interaktioner ved at etablere dyrkningsbetingelser, der understøtter vækst af tre-dimensionelle epitelial orgel-lignende systemer (kaldes "enteroids" og" colonoids"fra de små og store tarm, henholdsvis). Disse enteroids er sammensat af krypt og villus-lignende domæner og moden til at indeholde alle celletyper findes inden for epitel. Historisk, har murine modeller været udnyttet til at studere tarm skade. Dog tilbyder et svin model flere fordele, herunder ligheden mellem størrelse samt mave anatomi og fysiologi til mennesker. Ved at udnytte et svin model kan etablere vi en protokol, hvori segmental sløjfer af intestinal iskæmi kan oprettes inden for et enkelt dyr, gør det muligt for undersøgelse af forskellige tid punkter af iskæmisk skade og reparere in vivo. Desuden, vi beskriver en metode til at isolere og kultur de intestinale stamceller fra iskæmisk sløjfer af tarmen, giver mulighed for den fortsatte undersøgelse af epitel reparation, moduleret af stamceller, ex vivo.

Komplet intestinal iskæmi var lavet i små tarm loops ved at udnytte vaskulære okklusion med sutur eller klemmer som vist i figur 1. Ved at frigive klemmerne, kan en kontrolleret periode af reperfusion udføres, giver mulighed for yderligere undersøgelse af efterfølgende reperfusion skade, hvis det ønskes. Alle dyr overlevede under proceduren med minimal komplikation indtil eutanasi. De mest almindelige kirurgiske komplikationer var hypotension, der løses med tilskud af en positiv inotrop såsom Dobutamin.
Hvis udføres korrekt, vil iskæmisk skade begynde på spidsen af den intestinale villus og vandrer ned i krypten som varigheden af iskæmi stiger (figur 2). En almindelig fejl med den kirurgiske teknik kan opstå, når blodkarrene ikke er forbundet eller fastspændt jævnt. Resultatet er et hæmoragisk iskæmi (figur 3), hvor den tyndvæggede vene kollapser inden arterie, giver mulighed for yderligere blod at infiltrere væv. Dette ses groft som en mørk lilla serosal overflade (figur 3, venstre) sammenlignet med en lysere overflade under komplet iskæmi (figur 3, højre).
Efter fjernelse af iskæmisk intestinal sløjfer blev intestinal Krypter med held isoleret efter dissociation protokol (figur 4). Som forventet, Krypter fra mere alvorligt beskadiget timepoints var ofte brudt (f; fragment) og krypten fraktioner indeholdt mere baggrund celleaffald sammenlignet med dem, der ingen undergik eller milde skader. Under protokollen, skal alvorligt tilskadekomne tarmen rystes forsigtigt for at undgå yderligere skader på det underliggende væv. Ryster kan også nogenlunde resultere i yderligere krypt skader og fleste af Krypter ender i DR løsninger der indeholder EDTA, hvilket resulterer i yderligere forstyrrelser.
Når forgyldt, Krypter fra alle tidspunkter af iskæmi overleve og er i stand til at blive etableret i kultur (figur 5). Når normal og mildt beskadiget intestinal crypts er belagt i kultur, enterospheres formular inden for 24-48 timer. Med svær iskæmisk skade (3 og 4 h), tarm Krypter overleve men er beskadiget, hvilket resulterer i dannelsen af meget mindre kugler i første omgang. Af 72-120 h bliver enteroids mere komplekse med indlysende central lumen og spirende strukturer. Generelt er der en nedsat vækst effektivitet Krypter samt en nedsat størrelse af enteroids stammer fra alvorligt beskadiget intestinal væv (Gonzalez, L.M., upublicerede Data, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> Figur 1 : Kirurgisk model af komplet intestinal iskæmi i et svin model. A) normal svin jejunum exteriorized. B) mesenteriallymfeknuderne skibe har været forbundet med sutur oprettelse intestinal iskæmi. C) iskæmi oprettet ved hjælp af bulldog vaskulære klemmer til væv reperfusion hvis det ønskes. D) intestinal Vaskulaturen umiddelbart efter fjernelse af de vaskulære klemmer. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> Figur 2 : Histologisk dokumentation (hæmatoxylin og eosin (H & E) plet) for at øge epitelial skader efter længere varighed af komplet intestinal iskæmi. Skader starter på spidsen af villus med gradvise tab af enkelt epitel cellelag, villus sløvhed og cellulære skader strækker sig ned til krypten base med svære kvæstelser (op til 4 h varighed). 100 µm skalalinjen. Jeg = iskæmi. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> Figur 3 : Makroskopiske og histologiske tegn på blødende iskæmi. A) brutto fotografi sammenligning hæmoragisk iskæmi (venstre loop) og komplet iskæmi (højre loop). Når Vaskulaturen ikke er forbundet eller fastspændt jævnt, kan blod fortsætte med at infiltrere væv, resulterer i yderligere betændelse og skader. B) H & E billeder af hæmoragisk iskæmi af øge varighed fra 1-4 h. Ud over cellulære skader set med komplet iskæmi, er der tegn på røde blodlegemer infiltration inden for de omkringliggende lamina propria. 100 µm skalalinjen. Jeg = iskæmi. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> Figur 4 : Delprøver af intestinal Krypter isoleret fra sløjfer af iskæmisk og normal tarm. Komplet og intakt intestinal Krypter (stjerner) blev med held isoleret fra hver sløjfe af tarmen. Som forventet, Krypter fra mere alvorligt beskadiget tidspunkter var ofte brudt (f; fragment) og krypten fraktioner indeholdt mere baggrund celleaffald sammenlignet med dem, der ingen undergik eller milde skader. 100 µm skalalinjen. Jeg = iskæmi. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> Figur 5 : Tidsforløb af intestinal stamceller vækst efter isoleret fra iskæmisk sløjfer af tyndtarmen. Når normal intestinal crypts var forgyldt i kultur, enterospheres dannet inden for 24-48 timer. Med svær iskæmisk skade (3 og 4 h), Krypter overleve men danner meget mindre kugler i første omgang. Af 72-120 h bliver enteroids mere komplekse med indlysende central lumen og spirende strukturer. 20 µm skala bar medmindre noteret. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Vækstfaktor</td>
			<td>Fortyndingsmiddel</td>
			<td>Stock koncentration</td>
			<td>Stock fortynding</td>
			<td>Arbejder fortynding</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>1 µg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggin</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10mM eddikesyre</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>500 µg/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ΜM</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamid</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>100 ΜM</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10.000 X</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>2,5 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 µg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: vækstfaktor reagens tabel. Resumé af vækstfaktor stamopløsninger og fungerende løsninger, der anvendes i denne protokol.

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Denne protokol vil give læserne til før der kan etableres et svin model af segmental intestinal iskæmi og efterfølgende isolere og kultur intestinal stamceller til studiet af epitel reparation efter skade.

Tarm stamceller isoleret og kultur i et svin Model af Segmental lille Intestinal iskæmi

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

A Mouse Model of in Utero Transplantation

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stamcelletransplantation i en In vitro Simuleret Iskæmi / reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Functional Assessment of tarmmotilitet og tarmvæggen Inflammation i Gnavere: Analyser i en standardiseret model af Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Heterotop Renal autotransplantation i en Porcine Model: En trin-for-trin-protokollen

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Murin model af intestinal iskæmi-reperfusionsskade

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininduceret Hævelse i Intestinal Organoids: An<em&gt; In vitro</em&gt; Assay for Vurdering Drug respons i patienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

En Ornesen Endothelial organ kultur model ved hjælp af Split cornea-knapper

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

En præklinisk rotte model for studiet af iskæmi-reperfusion skade i rekonstruktiv mikrokirurgi

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

En rotte halspulsåren Tryk-kontrolleret segmental ballon skade med Periadventitial Terapeutisk Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Undersøgelse intestinal barriere opdeling i levende organoider

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...