Name: intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

इस परियोजना NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987, और नैदानिक विज्ञान प्रसार कोष के विभाग द्वारा समर्थित किया गया था

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

सुअर का के एक मॉडल के विकास के लिए एक ही जानवर के भीतर ऊतक चोट के कई समय अंक के अध्ययन के लिए अनुमति देकर पिछले murine मॉडल पर फैलता है । वहां उचित पोत बंधाव, ऊतक reperfusion और सफल तहखाना सेल संस्कृति सहित इस प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण चर्चा अंक हैं ।
उचित पोत बंधाव पूरा ischemia के एक मॉडल के निर्माण के लिए आवश्यक है । यदि सीवन असमान या दबाना नहीं कस पूरी तरह से बंधा है, मोटी घिरी धमनी से रक्त ऊतक में प्रवेश करने के लिए जारी रख सकते है और पतली दीवारों नस के पतन के कारण बाहर नहीं निकल सकता । यह लेमिना propria में रक्त की extravasation में परिणाम अतिरिक्त ऊतक क्षति पैदा कर रहा है । हालांकि, कोरोनरी चोट का अध्ययन किया जा रहा है के प्रकार पर निर्भर करता है, पूर्ण या रक्तस्रावी ischemia वांछित हो सकता है । उदाहरण के लिए, आंत्र प्रत्यारोपण की प्रक्रिया में, आंत पूरी तरह से संवहनी आपूर्ति से अलग है (धमनी और नस) प्रक्रिया है, जो पूरा आंत्र ischemia में परिणाम के लकीर के दौर के दौरान । वैकल्पिक रूप से, तथापि, जब अन्त्रपेशी इस तरह के एक आंत्र volvulus के रूप में एक घटना के दौरान मुड़ जाता है, शिरापरक वापसी अक्सर बाधित किया जा रहा है पहले ऊतक के भीतर अतिरिक्त रक्त के लिए अग्रणी, धमनी की आपूर्ति करने से पहले, इस प्रकार बनाने रक्तस्रावी ischemia ।
अंकुर टिप पर शुरू ऊतक क्षति में कोरोनरी चोट परिणाम और तहखाना3के आधार करने के लिए नीचे का विस्तार । ischemia के दौरान, adenosine ट्राइफॉस्फेट के रूप में ऊर्जा के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है और metabolite hypoxanthine उत्पंन करता है । जब ऊतक ऑक्सीजन के साथ reperfused है, hypoxanthine xanthine oxidase द्वारा metabolized हो जाता है और सुपरऑक्साइड चोट और ऊतक हानिकारक श्लैष्मिक के आकर्षण के लिए प्रमुख न्यूट्रोफिल मुक्त कण का उत्पादन17,18. प्रजातियों श्लैष्मिक संवहनी वास्तुकला में मतभेद के साथ ही xanthine oxidase की बदलती अभिव्यक्ति, reperfusion चोट की डिग्री बदलती में परिणाम3. की डियर और कुतर मॉडल ischemia-reperfusion से अधिक reperfusion चोट करने के लिए अतिसंवेदनशील होते है प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन चयापचयों19,20। इसके विपरीत, सूअरों को कम xanthine oxidase पाया गया है, और इसलिए कम reperfusion चोट, इस मॉडल को और अधिक मानव आंत्र21ischemia के बराबर बना । इस समय, नॉकआउट या ट्रांसजेनिक सुअर का मॉडल का उपयोग करने के लिए आंत्र चोट का अध्ययन नहीं बताया गया है, इस मॉडल का यह एक प्रमुख सीमा बना । उचित पशु मॉडल का चयन रोग प्रक्रिया या विशिष्ट शर्त पर निर्भर करता है शोधकर्ता अध्ययन करना चाहता है । उदाहरण के लिए, 6 एच तक कोरोनरी चोट के सुअर का मॉडल 22 वर्णित किया गया है, जबकि murine मॉडल में सबसे कोरोनरी प्रक्रियाओं 45-60 मिनट 23 कर रहे हैं ।
सामान्य और कोरोनरी क्षतिग्रस्त आंत से आंत्र तहखाना के सफल अलगाव संस्कृति में उपकला वसूली के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. इस प्रणाली के शोधकर्ता अकेले उपकला पर विशिष्ट ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है, के रूप में वहाँ संवहनी आपूर्ति या प्रतिरक्षा कोशिका घटक पर विचार करने के लिए नहीं है. यह विभिंन विकास कारकों, या सर्जरी के दौरान प्रशासित उपचार या संस्कृति मीडिया का सप्लीमेंट द्वारा तहखाना अलगाव का पालन करने के लिए इसके अलावा में चोट के बाद उपकला कोशिका बातचीत और वसूली का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है । यह कदम सबसे कठिन रहता है, के रूप में गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त छोरों से अलगाव कोमल मिलाते हुए और EDTA के त्वरित हटाने की आवश्यकता है मामले में तहखाने समय से पहले असंबद्ध हो गए हैं । यदि आंत के इन छोरों अच्छी तरह से धोया नहीं कर रहे हैं, तहखाना संस्कृति में दूषित हो जाने की क्षमता है. नतीजतन, एंटीबायोटिक antimycotic समाधान IESC मीडिया के अलावा दोनों डॉ समाधान के लिए जोड़ा गया था । एक और चर्चा बिंदु एक सामांय नियंत्रण के रूप में एकत्र आंत पर केंद्रित है । के रूप में जानवरों प्रणालीगत ऊतक छिड़काव में संभव परिवर्तन के साथ संज्ञाहरण से गुजरना, सूजन के ischemia के लिए द्वितीयक माध्यमिक परिसंचारी की संभावना के साथ, यहां तक कि "सामांय" नियंत्रण ऊतक एक सच्चे नियंत्रण का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं । इन प्रयोगों में, यह ध्यान रखें कि नियंत्रण ऊतक मोटे तौर पर दिखाई दिया और जानवरों है कि अंय प्रयोगों (गोंजालेज, लक्ष्मीमल्ल, अप्रकाशित डेटा, २०१७) में ischemia से गुजरना नहीं किया से ऊतक के लिए तुलनीय histologically ।
संक्षेप में, इस विधि सुअर का आंतों के ischemia के एक reproducible मॉडल का वर्णन करता है, कि बारीकी से मॉडल क्या मानव कोरोनरी चोट में होता है । इसके अतिरिक्त, कोरोनरी छोरों से आंत्र स्टेम कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन किया है, जो उपकला मरंमत और संस्कृति में उपचार के लिए संभव प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए कार्य करता है ।

आंत्र कोरोनरी चोट, कमी या आंत में रक्त के प्रवाह की पूरी रोड़ा के कारण ऑक्सीजन की उपलब्धता में कमी का परिणाम है, मानव और पशु रोगियों में रुग्णता और मृत्यु का एक महत्वपूर्ण कारण है1,2. कोरोनरी क्षति, बाद में सूजन और सेलुलर घुसपैठ के साथ, श्लैष्मिक बाधा समझौते की ओर जाता है । श्लैष्मिक बाधा प्रणालीगत संचलन में बैक्टीरियल translocation और जुड़े विषाक्त पदार्थों की रोकथाम के लिए महत्वपूर्ण है3,4। कोरोनरी ऊतकों के बाद reperfusion हानिकारक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों है कि5चोट बढ़ा सकते हैं के गठन में परिणाम कर सकते हैं । के बाद से आंत्र ischemia शायद ही कभी रोके है, सबसे वर्तमान अनुसंधान ischemia के जल्दी पता लगाने और उपंयास चिकित्सकीय दृष्टिकोण है कि reperfusion चोट या लक्ष्य श्लैष्मिक मरंमत को कम करने के विकास के लिए तकनीक को आगे बढ़ाने पर ध्यान केंद्रित किया है ।
पशु मॉडल बड़े पैमाने पर किया गया है के लिए हमारे ischemia के बुनियादी विज्ञान ज्ञान-reperfusion चोट का विस्तार और शोधों अनुसंधान के लिए आवश्यक रहते हैं । कुतर मॉडल सबसे व्यापक रूप से उनकी क्षमता के कारण इस्तेमाल किया गया है आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा6। अधिक हाल ही में हालांकि, बड़े पशु मॉडलों के उपयोग, विशेष रूप से सुअर, भविष्य के अनुवाद सूअर शारीरिक और मनुष्य7,8के लिए शारीरिक समानता सहित लाभ की एक संख्या के कारण अध्ययन के लिए वकालत की गई है । चोट मॉडलों की एक किस्म के ischemia-reperfusion चोट का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है और पूरा संवहनी रोड़ा, कम प्रवाह ischemia और फॉल्ट mesenteric संवहनी रोड़ा शामिल हैं । इन मॉडलों की एक पूरी समीक्षा इस लेख के दायरे के बाहर है लेकिन लेखक एक हाल ही में समीक्षा के लिए सीधे पाठकों3।
vivo में मॉडल के अलावा, पूर्व vivo सेलुलर कल्चर सिस्टम का उपयोग एक होनहार उपकरण आंतों homeostasis अध्ययन और चोट के बाद की मरंमत करने के लिए प्रदान करता है । आंत्र स्टेम कोशिकाओं सेलुलर प्रसार और आंतों उपकला अस्तर के कारोबार के लिए जिंमेदार हैं । जब सामान्य या घायल आंत से अलग, आंत्र स्टेम कोशिकाओं को संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है, और स्टेम सेल और उपकला कोशिका जीवविज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण या मॉडल के रूप में सेवा. तरीकों को अलग करने और इन तीन आयामी संस्कृति प्रणाली की स्थापना (enteroids और colonoids जब छोटी और बड़ी आंत से व्युत्पंन, क्रमशः) प्रजातियों और अंग प्रणालियों की एक किस्म के लिए वर्णित किया गया है9,10 ,11,12,13. विशेष रूप से, जठरांत्र संबंधी मार्ग के भीतर, इन संस्कृति प्रणालियों मॉडल जठरांत्र रोग सहित कैंसर के लिए इस्तेमाल किया गया है, रोगज़नक़ संक्रमण और भड़काऊ आंत्र रोग14। इस समय, अलगाव और किसी भी प्रजाति में कोरोनरी घायल छोटी आंत से आंत्र स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव का वर्णन करने के लिए कोई रिपोर्ट नहीं हैं । इसलिए, यहां हम एक उपंयास में आंतों के ischemia की प्रक्रिया का वर्णन, बड़े पशु सुअर का मॉडल जो reproducible चोट में परिणाम और सामांय से आंत्र स्टेम कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता और के अतिरिक्त अध्ययन के लिए कोरोनरी घायल आंत रिकवरी पूर्व vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BP-399</td>
			<td style="width:167px;">Dilute 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Distilled, deionized water (ddH2O)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to prepare EDTA and PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">20688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">ED45</td>
			<td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Y-27632</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">B-27 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Glutamax</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-096</td>
			<td>Anti-Anti solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Wnt-3a</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">5036 WN/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Rspondin1</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">4645- RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Noggin</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">LY2157299</td>
			<td style="width:107px;">SelleckChem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">52230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:107px;">Cayman Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Human [leu]15-Gastrin 1</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">SB202190</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">A83-01</td>
			<td style="width:107px;">Tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Water, WFI Quality</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Matrigel Matrix, GFR</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">356231</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">24 Well Culture Dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Conical Tube, 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Scalpel Handle</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">504169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Debakey Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501752</td>
			<td>Curved or straight</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Metzenbaum Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mosquito Forceps, Curved</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td>503724-12</td>
			<td>Curved or straight (503728-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td style="width:107px;">Stoelting Co.</td>
			<td>52120-40P</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Silk, 2-0&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">685S-BUT</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Towel Clamps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Needle Holder</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">V503382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Wire suture, 20 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">19075</td>
			<td>Cut and straighten before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Surgical Towels</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">ST1833</td>
			<td>Any similar product is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Lactated Ringers Solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">VINV-CHMX-SCRB</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isopropyl Alcohol 70%</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">MS071HS</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">IV catheter, 22 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">2225PUR</td>
			<td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Xylazine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Ketamine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">11695-6835-1</td>
			<td>Controlled medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isoflurane solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10015516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td>
			<td style="width:107px;">Vortech Pharm.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Heating pad&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tpump Core Warming System; others are available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Mindray Datascope Monitor</td>
			<td style="width:107px;">Mindray North America</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Vetland Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Fluid Pump</td>
			<td style="width:107px;">Abbott Hospira</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

आंतों ischemia रुग्णता और मानव और पशु चिकित्सा रोगियों में मृत्यु का एक प्रमुख कारण बना हुआ है । कई रोग आंतों ischemia में परिणाम प्रक्रियाओं, जब रक्त की आपूर्ति और इसलिए ऑक्सीजन आंत में कमी आई है । यह आंतों बाधा नुकसान और अंतर्निहित ऊतक को नुकसान की ओर जाता है । आंत्र स्टेम कोशिकाओं Lieberkühn के तहखाने के आधार पर रहते है और homeostasis और निंनलिखित चोट के दौरान आंत्र नवीकरण के लिए जिंमेदार हैं । पूर्व vivo सेल संस्कृति तकनीक संस्कृति की स्थिति है कि तीन आयामी उपकला अंग की तरह प्रणालियों की वृद्धि का समर्थन की स्थापना के द्वारा उपकला स्टेम सेल बातचीत के सफल अध्ययन के लिए अनुमति दी है ("enteroids" और " colonoids "छोटी और बड़ी आंत से, क्रमशः) । इन enteroids तहखाने और अंकुर की तरह डोमेन और उपकला के भीतर पाया सेल प्रकार के सभी शामिल करने के लिए परिपक्व की रचना कर रहे हैं । ऐतिहासिक, murine मॉडल आंत्र चोट का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है । हालांकि, एक सुअर का मॉडल आकार की समानता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जठरांत्र शरीर रचना विज्ञान और मनुष्य के लिए शरीर विज्ञान सहित कई लाभ प्रदान करता है । एक सुअर का मॉडल का उपयोग करके, हम एक प्रोटोकॉल है जिसमें आंतों के ischemia के फॉल्ट छोरों एक ही जानवर के भीतर बनाया जा सकता है स्थापित, कोरोनरी चोट और vivoमें मरंमत के समय अंक अलग के अध्ययन को सक्षम करने से । इसके अतिरिक्त, हम एक विधि को अलग करने और आंत के कोरोनरी छोरों से आंत्र स्टेम कोशिकाओं संस्कृति का वर्णन, उपकला मरंमत के जारी अध्ययन के लिए अनुमति देता है, स्टेम सेल द्वारा संग्राहक, पूर्व vivo.

पूरा आंत्र ischemia सीवन या clamps के साथ संवहनी रोड़ा का उपयोग करके छोटे आंत्र छोरों में बनाया गया था के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है । clamps जारी करके, reperfusion के एक नियंत्रित अवधि प्रदर्शन किया जा सकता है, बाद reperfusion चोट के अतिरिक्त अध्ययन के लिए अनुमति अगर वांछित । सभी जानवरों इच्छामृत्यु तक ंयूनतम जटिलता के साथ प्रक्रिया के दौरान बच गया । सबसे आम शल्य चिकित्सा जटिलता, जो dobutamine जैसे एक सकारात्मक inotrope की पूरकता के साथ हल किया गया था ।
यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया, कोरोनरी चोट आंतों अंकुर की नोक पर शुरू हो जाएगा और ischemia की अवधि के रूप में नीचे की ओर पलायन बढ़ता है (चित्रा 2) । शल्य चिकित्सा तकनीक के साथ एक आम गलती हो सकती है जब रक्त वाहिकाओं ligated या समान रूप से clamped नहीं कर रहे हैं । परिणाम एक रक्तस्रावी ischemia (चित्रा 3), जिसमें पतली घिरी नस धमनी से पहले गिर जाता है, अतिरिक्त रक्त के लिए अनुमति देता है ऊतकों घुसपैठ । यह एक गहरे बैंगनी serosal सतह के रूप में मोटे तौर पर देखा जाता है (चित्रा 3, बाएं) पूरा ischemia के दौरान एक paler सतह की तुलना में (आंकड़ा 3, सही) ।
कोरोनरी आंत्र छोरों को हटाने के बाद, आंत्र तहखाना सफलतापूर्वक पृथक्करण प्रोटोकॉल (चित्रा 4) के बाद अलग किया गया था । के रूप में की उंमीद है, और अधिक गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त timepoints से तहखाना अक्सर टूट रहे थे (f; टुकड़ा) और तहखाना अंश अधिक पृष्ठभूमि सेलुलर मलबे निहित जब उन है कि कोई या हल्के नुकसान से गुजरा की तुलना में । प्रोटोकॉल के दौरान, गंभीर रूप से घायल आंत धीरे अंतर्निहित ऊतक को अतिरिक्त नुकसान से बचने के लिए हिल होना चाहिए । मिलाते हुए भी मोटे तौर पर आगे तहखाना नुकसान में परिणाम कर सकते है और EDTA युक्त डॉ समाधान में समाप्त होने वाले तहखाने के बहुमत, अतिरिक्त व्यवधान में जिसके परिणामस्वरूप ।
एक बार मढ़वाया, ischemia के सभी समय अंक से तहखाने जीवित है और संस्कृति में स्थापित हो (चित्रा 5) कर रहे हैं । जब सामान्य और हल्के से क्षतिग्रस्त आंत्र तहखाना संस्कृति में चढ़ाया जाता है, enterospheres फार्म के भीतर 24-48 ज. गंभीर कोरोनरी क्षति (3 और 4 एच) के साथ, आंतों तहखाने जीवित रहते हैं, लेकिन क्षतिग्रस्त हैं, शुरू में बहुत छोटे क्षेत्रों के गठन में जिसके परिणामस्वरूप । द्वारा 72-120 ज, enteroids स्पष्ट केंद्रीय लुमेन और नवोदित संरचनाओं के साथ और अधिक जटिल हो जाते हैं । कुल मिलाकर, वहां तहखाने के एक कम वृद्धि दक्षता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बुरी तरह से क्षतिग्रस्त आंत्र ऊतक (गोंजालेज, लक्ष्मीमल्ल, अप्रकाशित डेटा, २०१७) से व्युत्पंन enteroids के एक कम आकार है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> चित्र 1 : एक सुअर का मॉडल में पूरा आंत्र ischemia के सर्जिकल मॉडल । क) सामान्य सुअर का jejunum एक्सटीरियर. ख) Mesenteric वाहिकाओं आंतों ischemia बनाने सीवन के साथ ligated किया गया है । ग) Ischemia बुलडॉग संवहनी clamps का उपयोग करने ऊतक reperfusion के लिए अनुमति यदि वांछित बनाया । घ) आंत्र vasculature तुरंत संवहनी clamps को हटाने के बाद । <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> चित्र 2 : Histologic साक्ष्य (hematoxylin और eosin (एच एंड ई) दाग) पूर्ण आंत्र ischemia की लंबी अवधि के बाद बढ़ती उपकला क्षति के । नुकसान एकल कोशिका उपकला परत के क्रमिक नुकसान के साथ अंकुर की नोक पर शुरू होता है, अंकुर कुंद और सेलुलर नुकसान गंभीर चोट के साथ तहखाना आधार के लिए नीचे का विस्तार (4 एच अवधि के लिए). १०० µm स्केल बार । मैं Ischemia = । <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> चित्र 3 : सकल और रक्तस्रावी ischemia के histologic सबूत । एक) सकल रक्तस्रावी ischemia (बाएं पाश) और पूरा ischemia (दाएं पाश) की तुलना तस्वीर । जब vasculature ligated या समान रूप से clamped नहीं है, रक्त के ऊतकों घुसपैठ जारी रख सकते हैं, अतिरिक्त सूजन और नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप । ख) एच और ई 1-4 ज से बढ़ती अवधि के रक्तस्रावी ischemia की छवियां । सेलुलर नुकसान पूरा ischemia के साथ देखा के अलावा, वहां लाल रक्त कोशिका घुसपैठ के आसपास के लेमिना propria के भीतर सबूत है । १०० µm स्केल बार । मैं Ischemia = । <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> चित्र 4 : आंतों और सामान्य आंत के छोरों से पृथक तहखाने के Aliquots. पूर्ण, बरकरार आंत्र तहखाना (तारक) सफलतापूर्वक आंत के प्रत्येक पाश से अलग किया गया । के रूप में की उंमीद है, और अधिक गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त समय अंक से तहखाने अक्सर टूट रहे थे (f; टुकड़ा) और तहखाना अंश अधिक पृष्ठभूमि सेलुलर मलबे निहित है जब उन है कि कोई या हल्के नुकसान गुजरा की तुलना में । १०० µm स्केल बार । मैं Ischemia = । <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> चित्र 5 : आंत्र स्टेम सेल विकास के समय पाठ्यक्रम छोटी आंत के कोरोनरी छोरों से अलगाव के बाद । जब सामांय आंत्र तहखाना संस्कृति में चढ़ाया गया, enterospheres 24-48 ज के भीतर का गठन किया । गंभीर कोरोनरी क्षति (3 और 4 एच) के साथ, तहखाने जीवित हैं, लेकिन शुरू में बहुत छोटे क्षेत्रों के रूप में । द्वारा 72-120 ज, enteroids स्पष्ट केंद्रीय लुमेन और नवोदित संरचनाओं के साथ और अधिक जटिल हो जाते हैं । 20 µm स्केल बार जब तक ध्यान नहीं दिया । <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>वृद्धि कारक</td>
			<td>मंदक</td>
			<td>शेयर एकाग्रता</td>
			<td>स्टॉक कमजोर पड़ने</td>
			<td>काम कमजोर पड़ने</td>
		</tr>
<tr>
<td>आर-Spondin</td>
			<td>Pbs</td>
			<td>100X</td>
			<td>१०० µ g/ml</td>
			<td>1 µ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>नोगिन</td>
			<td>दप/0.1% BSA</td>
			<td>1000X</td>
			<td>१०० µ g/ml</td>
			<td>१०० एनजी/</td>
		</tr>
<tr>
<td>Egf</td>
			<td>10 मिमी एसिटिक एसिड</td>
			<td>10, 000X</td>
			<td>५०० µ g/ml</td>
			<td>५० एनजी/</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>1000X</td>
			<td>५०० µ m</td>
			<td>५०० एनएम</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>3000X</td>
			<td>30 एमएम</td>
			<td>१० µ मी</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sw</td>
			<td>1000X</td>
			<td>1 मीटर</td>
			<td>1 मिमी</td>
		</tr>
<tr>
<td>गैस्ट्रीन</td>
			<td>Pbs</td>
			<td>10, 000X</td>
			<td>१०० µ m</td>
			<td>10 एनएम</td>
		</tr>
<tr>
<td>वाई-२७६३२</td>
			<td>Pbs</td>
			<td>1000X</td>
			<td>10 एमएम</td>
			<td>१० µ मी</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10, 000X</td>
			<td>5 मिमी</td>
			<td>०.५ µ m</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>Pbs</td>
			<td>1000X</td>
			<td>२.५ एमएम</td>
			<td>२.५ µ m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>Pbs</td>
			<td>2000X</td>
			<td>२०० µ g/ml</td>
			<td>१०० एनजी/</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: वृद्धि कारक एजेंट तालिका. विकास फैक्टर स्टॉक समाधान और काम इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया समाधान का सारांश ।

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Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

इस प्रोटोकॉल पाठकों को सफलतापूर्वक खंड आंत्र ischemia के एक सुअर का मॉडल स्थापित करने के लिए और बाद में अलग और संस्कृति आंत्र स्टेम चोट निंनलिखित उपकला मरंमत के अध्ययन के लिए कोशिकाओं को सक्षम करेगा ।

आंत्र स्टेम सेल अलगाव और संस्कृति के एक सुअर का मॉडल में फॉल्ट छोटे आंत्र Ischemia

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

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