Name: quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ at JoVE.com

تلقت هذه الدراسة دعما ماليا من نينر (F32NR013611). أننا نود أن تقر وشكرا للمطورين من AnalyzeSkeleton(2D/3D) وفراكلاك (كاريراس أرجاندا et al. وكاربيرين et al., على التوالي) دون فيها التحليل الموضحة هنا لن يكون ممكناً.

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+microglia:+a+morphological+definition.">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).</li><li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus.">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).</li><li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury.">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion.">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers.">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li><li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+response+to+Alzheimer's+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments.">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li><li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis.">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li><li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study.">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice.">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microglia+activation:+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction.">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).</li><li>. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2014)</li><li>Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractal,+Multifractal,+and+Lacunarity+Analysis+of+Microglia+in+Tissue+Engineering.">Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).</li><li>Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+quantitative+analysis+of+microglial+morphology.">3D quantitative analysis of microglial morphology.</a> available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).</li><li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis.">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يتم ضبطها بدقة لعلم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض داخل نطاقاتها الصغيرة Microglia الخلايا وعرض مجموعة متنوعة من مورفولوجيس2 في الدقيقة7،14 والضرر الإجمالي8. يجعل استخدام بروتوكولات ImageJ microglia مورفولوجيا الكمي متاحة لجميع المختبرات المنهاج والإضافات صورة المصدر المفتوح برامج معالجة. بينما البروتوكول وصف تركز على معالجة الصور وتحليلها باستخدام هذا البرنامج، تبدأ اتساق جمع البيانات وصحة وموثوقية ممتازة المدينة والفحص المجهري. هذا البروتوكول يستخدم لتحسين ثنائي، والهيكل العظمى، وتمثيلات مخطط photomicrographs كامل والخلايا المفردة، لكن لا يمكن أن تحل محل تلطيخ المدينة الفقيرة والفحص المجهري أن النتائج في التباين المنخفض، واضحة، أو تشويه الصور. كدراسة إضافية، يجب الحرص لا لشد أنسجة المخ أثناء التخزين، قبل تمزيقها، مما يغير مورفولوجيا microglia لا رجعة فيه. وأخيراً، داخل كل تجربة، microglia يجب تصويرها استخدام نفس النطاق، فضلا عن المجهر نفسه. الأجهزة، والأهداف والبرامج تختلف بين المجاهر الذي سينتج photomicrographs الحجم مختلفة على الرغم من الأهداف المماثلة وتغيير التفاصيل فضلا عن عدد الخلايا داخل كل إطار. على سبيل المثال، يؤدي استخدام هدفا X 40 في SPII إيكا الحصول على الصور مرتين العدد من الخلايا وأقل تفصيل من اقتناء استخدام 880 زايس. وهذا أهمية خاصة بالنسبة للخلية تفرع البيانات المجمعة من كامل الإطار بدلاً من خلية واحدة، كهذا يصبح مسألة أخذ عينات البيانات.
وبصفة عامة، تحليل هيكل عظمى الذي يستخدم الصورة المجهرية كامل يسبق التحليل النمطي هندسي متكرر خلية مفردة لسببين. تحديد الخلية تشعبت من كافة الخلايا الموجودة في الصورة المجهرية يتم بسرعة عند مقارنة بالتحليل النمطي هندسي متكرر خلية واحدة فقط ويمكن اعتبارها كأداة لفحص إذا كان الوقت عامل. وبالإضافة إلى ذلك، تستخدم صور ثنائية مستمدة من خلال تحليل هيكل عظمى للتحليل النمطي هندسي متكرر. مجرد تصويرها، هناك عدد من الخطوات الهامة التي قد تؤثر على نتائج تحليل هيكل عظمى وإدخال المستخدم-التأثير. الخطوات البروتوكول غير متغير معظم بين المستخدمين هي خطوة 4.2 (زيادة سطوع الصورة) والخطوة 4.5 (تحديد العتبة). حيثما أمكن، مصممة عدد أمثل لزيادة السطوع (max أو min شريط التمرير بين 0-255) وعقد ثابت لجميع الصور والمستخدمين. حيث تقلب الصورة كبيرة، يمكن للمستخدم اختيار سطوع التي تتنوع بين الصور بدلاً من ذلك. بدلاً من ذلك، إذا كانت صور مشرقة وعالية التباين، ثم زيادة السطوع ويمكن إهماله والعتبة يمكن أن تكون موحدة باستخدام عامل تصفية عتبة تخصص (مثلاً.، هوانغ) بدلاً من القيمة الافتراضية أكثر من متغير. مجرد الأمثل، ينبغي التقيد بالمعلمات للتقليل من تأثير المستخدم الإضافية.
ويرد مثال لتقلب المستخدم في الشكل 5. زادت قيم البيانات في المستخدم 1 مقابل 2 المستخدم وذلك ستتم زيادة تقلب إذا كان المستخدم 1 والمستخدم 2 أسهم في جمع البيانات. هي أبرز مثال على الاختلافات في المستخدم 1 والمستخدم 2 ثنائي والعظمية صور دوائر ملونة (الشكل 5). وفي هذه الحالة، كان كلا المستخدمين الطلبة الجامعيين بإيجاز المدربين ذوي الخبرة المحدودة في ميكروجليا. المراقبة العادية والتوجيه قبل microglia خبراء جنبا إلى جنب مع بروتوكول زيادة التدريب2 يمكن أن تقلل من التباين بين المستخدم. على الرغم من عدم تقييم هنا، التحليل النمطي هندسي متكرر أقل عرضه للتقلب بين المستخدم لأن الخلايا ثنائي يتم يدوياً وفردياً معزولاً عن الصورة المجهرية بدلاً من الاعتماد فقط على مستوى العتبة لتحديد الأشكال microglia. ومع ذلك، تمتلك كافة أساليب بعض التباين بين المستخدمين. لذلك، مستخدم واحد (ومن الناحية المثالية، المدربين ببعض الخبرة في الخلايا microglia) ينبغي الانتهاء من جمع البيانات مجموعة البيانات كاملة.
تعديلات إضافية يمكن بسهولة جعل هذا البروتوكول، وسوف يعتمد على جودة الصورة، والجهود المبذولة للحد من الضوضاء، وضمان عملية الاتصال. على سبيل المثال، إذا كان التباين كافية، ثم الاستبدال غير ضروري ويمكن إهماله. فمن الحكمة أن الأمثل ووضع الصيغة النهائية للبروتوكول الخاص بمجموعة محددة من الصور والحالات التجريبية والضوابط، قبل جمع البيانات من مجموعة كاملة. أخيرا، يمكن استخدام ملحقات إضافية بدلاً من الآخرين لتوضيح أو شحذ الصور التي لم توصف في هذا البروتوكول مثل تمدد أو التوضيح.
مزايا لهذا البروتوكول هي التوفر العالمي والقدرة على التكيف. وباﻹضافة إلى ذلك، تقييم التبعات الخلية باستخدام أناليزيسكيليتون بسرعة وتنطبق الصورة المجهرية كامل. هناك فائدة نهج تحليل متعددة الخلايا هو التركيز على منطقة بأكملها بدلاً من خلايا مفردة. ولذلك، من الممكن لتقييم التبعات متوسط (من حيث نقاط النهاية وطول العملية) لجميع ميكروجليا داخل الصورة بسرعة. تحليل هيكل عظمى ويقدم تحليلاً لخلايا متعددة: عينة بيانات من حيث عدد الخلايا التي لا يمكن أن يقابله التحليل النمطي هندسي متكرر بسبب استثمار الوقت المطلوب لعزل الخلايا المفردة من photomicrographs. مثيل حيث هذا قد يكون من الأنسب سيكون في فحص مورفولوجيس microglia في التقارب لإصابة في تنسيق. حد واحد تقديم صورة الحقل بالكامل لإنشاء نماذج عظمى من المدينة photomicrographs ناقصة بالمقارنة مع نهج وحيد الخلية أكثر استهلاكاً للوقت. وباﻹضافة إلى ذلك، تحليلاً لمنطقة ليست ملائمة للظروف حيث مورفولوجيس microglia تختلف جذريا ضمن الحقل نفسه. وأخيراً، يعد هذا الأسلوب تحليل اعتماداً على عدد الخلايا، معلمة التي قد تختلف بين الظروف التجريبية.
التحليل النمطي هندسي متكرر في خلية واحدة ويكمل ذلك تشعبت خلية متوسط بيانات الإخراج الناتجة عن تحليل هيكل عظمى. على الرغم من أن أكثر وقتاً طويلاً، وهذا الاستثمار غلة طائفة واسعة من البيانات شكلي. على سبيل المثال، الخلية الكثافة، نسبة الامتداد، والتدوير بيانات تصف حجم واستطالة، وشكل مخطط الخلية، على التوالي. البعد كسورية ولاكوناريتي تلخيص تعقيد الخلية وعدم التجانس في الشكل، على التوالي. ويرد موجز أكثر تعمقاً لكيفية حساب كل معلمة، وكيف يمكن تفسير البيانات في دليل تفاعلي16 وينبغي النظر في مثل هذه التفاصيل فيما يتعلق بمسألة إجراء بحوث محددة. ويؤدي البروتوكول وصف أدوات حساسة لقياس التغييرات الصغيرة في 2D microglia مورفولوجيس التي قد تحدث في الظروف الفسيولوجية وباثولوجي. تحليل شكلي إضافية مثل الصلابة والتحدب، وشكل عامل16،20 قد يكون ممكناً إذا كان توليد الأشكال ثلاثية الأبعاد.
تطوير البروتوكول والتكيف المستمر ويحركها المستخدم. قد مددت من الأسفار8 للبث الإذاعي الرقمي ومشرق-الميدان الصور7 ولكن ليس بعد البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج. علاوة على ذلك، يمكن استخدامه بالتزامن مع البرمجيات الاحتكارية مثل إيماريس لتحليل إضافي. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من علم وظائف الأعضاء ولا يقتصر على microglia ولكن يمكن تطبيقها على أي خلية أو نسيج مع أنماط معينة أو الأشكال التي يمكن تحديدها باستخدام طرق المدينة. أخيرا، مع حجم عينة كافية، يمكن تطبيقها على تحليل متعدد المتغيرات أو الكتلة على التجهيزة microglia وفقا مورفولوجية12،21؛ هذه معلومات ذات مغزى حيث مورفولوجيا microglia مؤشر حيوي وظائف microglia والردود على البيئة المحيطة بهم. تقدير للتنوع مورفولوجك microglial الآخذة في التوسع وهامة فهم التفاعلات الأوعية الدموية العصبية-إطلاق كامل أثناء الصحة والمرض. ويتعزز النمو في هذا المجال عن طريق بروتوكولات متطورة وسهلة الاستخدام، واستنساخه التحديد الكمي وتلخيص مورفولوجيا microglia استخدام عدة متغيرات مستمرة.

Microglia قد استجابة فورية ومتنوعة مورفولوجك إلى تغييرات في الدماغ الفيزيولوجيا1 على طول سلسلة متصلة إمكانيات التي تتراوح من مورفولوجيس فرط تشعبت ومعقدة للغاية لإزالة متشعب واميبيه مورفولوجيس2 . وقد يصبح Microglia الاستقطاب وعلى شكل قضيب3. تشعبت خلية Microglia عموما يعرف بأنه شكل تعقيداً وجود عمليات متعددة وغالباً ما تبلغ عن عدد نقاط النهاية كل خلية وطول عمليات الخلية. منذ microglia يتم ضبطها بدقة للدالة الدبقية والخلايا العصبية من خلال خلية-خلية مستمر عبر الحديث و في فيفو حركية4،5، مورفولوجيس microglia قد تخدم كمؤشرات لوظائف الخلية المتنوعة وأوجه الخلل في الدماغ. نهج كمي ضروري لوصف تنوع هذه التغييرات مورفولوجك على نحو كاف والتمييز بين الاختلافات بين الخلايا متشعب التي تحدث مع خفية الاضطرابات الفسيولوجية (مثل الصرع5،6 وارتجاج في الدماغ7) بالإضافة إلى الإصابات الجسيمة (مثل8من السكتة الدماغية). زيادة استخدام مورفولوجيا الكمي7،،من89،10،11،12،13،14 وسوف تكشف عن التنوع الكامل مورفولوجيس microglia أثناء الصحة والمرض. تفاصيل الدراسة الحالية استخدام التدرجي ImageJ الإضافات اللازمة لتلخيص مورفولوجيا microglia من photomicrographs الفلورية أو غير الفلورية من microglia المكتسبة في أنسجة القوارض الثابتة بعد إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة).
المركزية لتحليل الأساليب الموصوفة هنا ImageJ الإضافات أناليزيسكيليتون (2D/3D)15، نمواً في عام 2010 لتحديد هياكل الثديية الكبيرة، وفراكلاك16، وضعت في عام 2014 دمج التحليل إيماجيج والنمطي هندسي متكرر إلى تحديد حجم الأشكال microglia الفردية. هذه الإضافات توفير إجراء تحليل سريع تشعبت microglia داخل أسرة photomicrographs أو microglia متعددة من عائد محدد داخل الصورة المجهرية. يمكن استخدام هذا التحليل وحدها أو يكمل التحليل النمطي هندسي متكرر. التحليل النمطي هندسي متكرر خلية واحدة (فراكلاك) يتطلب استثماراً للوقت ولكن يوفر نواتج مورفولوجيا متعددة فيما يتعلق بتعقيد ميكروجليا والشكل والحجم. استخدام كل أدوات ليست زائدة عن الحاجة، كخلية تشعبت مكملة إلى تعقيد الخلية، ويمكن استخدام مزيج معلمات متعددة للتمييز بين مورفولوجيس microglia المتنوعة داخل مجموعات البيانات12،17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">primary antibody anti-IBA1</td>
			<td style="width:173px;">Wako&#160;</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td style="width:167px;">rabbit host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield soft mount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunorResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>donkey host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mL glass vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>UX-08923-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

هي Microglia البالعات الدماغ التي تشارك في التوازن الدماغ ومسح بيئتها للخلل والإصابات والأمراض بشكل مستمر. كأول المستجيبين، microglia وظائف مهمة للتخفيف من حدة الخلل في الخلايا العصبية وإطلاق، وفي هذه العملية، فإنها تمر بمجموعة واسعة من التغييرات مورفولوجك. مورفولوجيس Microglia ويمكن تصنيف صفيا، أو بدلاً من ذلك، يمكن قياسها كمياً كمتغير مستمر للمعلمات مثل الخلية تشعبت والتعقيد، والشكل. بينما يتم تطبيق أساليب لقياس ميكروجليا للخلايا المفردة، تطبيق بعض التقنيات microglia متعددة في الصورة المجهرية كامل. والغرض من هذا الأسلوب لقياس متعددة وخلايا مفردة باستخدام بروتوكولات ImageJ متوفرة بسهولة. هذا البروتوكول موجز للخطوات والإضافات إيماجيج الموصى بها لتحويل الصور الثنائية والعظمية الممثل photomicrographs الأسفار ومشرق الميدان وتحليلها باستخدام برامج الإضافات أناليزيسكيليتون (2D/3D) وفراكلاك لجمع البيانات مورفولوجيا. تلخيص نواتج هذه الإضافات مورفولوجيا الخلايا من حيث نقاط النهاية عملية وتقاطعات، وطول فضلا عن التعقيد وشكل الخلية وواصفات حجم. بروتوكول تحليل هيكل عظمى الموضحة هنا أيضا مناسبة لإجراء تحليل إقليمي ل microglia متعددة داخل أسرة الصورة المجهرية أو المنطقة ذات الاهتمام (ROI) بينما فراكلاك يقدم تحليلاً خلية فردية متكاملة. ويوفر البروتوكول جنبا إلى جنب، موضوعي وأداة التقييم الحساسة، والشاملة التي يمكن استخدامها التجهيزة بين مورفولوجيس microglia المتنوعة الموجودة في الدماغ صحية والجرحى.

مورفولوجيا microglia تحليل البروتوكولات المبينة في هذا التقرير تلخيص خطوات مفيدة في معالجة الفلورسنت والدأب photomicrographs لتحليل شكلي. هذه الخطوات هي تلخيص بصريا في الشكل 2 ، و الشكل 3. والهدف من هذه الخطوات هو خلق صورة ثنائية والعظمية ممثل نماذج الصورة المجهرية الأصلي على نحو مناسب مثل أن تكون البيانات المتراكمة سارية المفعول. بعد تطبيق البروتوكول، فإن البرنامج المساعد أناليزيسكيليتون النتائج في صورة هيكل عظمى المعلمة التي عدد نقاط النهاية وفرع (أي.، وعملية) ويمكن تلخيص لينجثكان من ملفات الإخراج الناتجة. ثم يتم استخدام بيانات طول العملية ونقاط النهاية لتقدير مدى تشعبها microglia في الصورة المجهرية أو العائد على الاستثمار. الشكل 4 يلخص البيانات الناتجة (النهاية/الخلية وعملية الطول/خلية) التي تم جمعها مع أو بدون تطبيق البروتوكول. على الرغم من وجود اتجاهات مماثلة، هي البيانات الملخصة في 4F الشكل المتغير أقل من تلك الموجودة في الشكل 4E. بالإضافة إلى ذلك، توضح هذه البيانات زيادة الحساسية للكشف عن الاختلافات بين المجموعات عند تطبيق البروتوكول. وأخيراً، يجب الحرص فيما يتعلق بالتباين بين المستخدم في تطبيق البروتوكول. ويرد مثل هذه الاختلافات ب الشكل 5 حيث نفس مجموعة البيانات تم تحليلها من قبل اثنين من المستخدمين مستقل تطبيق بروتوكولا متطابقة على النحو الموجز أعلاه.
يتم جمع البيانات مورفولوجيا إضافية من خلايا مفردة معزولة عن الصور الثنائية التي تم إنشاؤها أثناء تطبيق البروتوكول. خطوات بروتوكول تحليل مورفولوجيا microglia قبل واستخدام البرنامج المساعد فراكلاك-ويرد في الشكل 6. يمكننا توضيح هذا التحليل في كلا يصب (الشكل 6A) وإصابة الأنسجة (الشكل 6B). صور الممثل ثنائي، أوجز، محدب هال/تغليف دائرة، وأمثلة العد مربع لكل خلية وحلل مع ودون البروتوكول التطبيق تظهر في الشكل 6–ف. هذه الصور التي تساعد على توضيح منشأ الاختلافات في البيانات مورفولوجيا الذي يرد في الشكل 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> رقم 1. الرسوم توضيحية microglia العظمية مع سوما دائرية (الأمثل) مقابل من أصل واحد سوما (أمثل) وتراكب المقابلة بين الخلية العظمية والصورة المجهرية الأصلي- شريط المقياس = 10 ميكرون. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> رقم 2. بروتوكول التطبيق إلى photomicrographs نيون. الرسوم التوضيحية "تحليل هيكل عظمى" البروتوكول تنطبق الصورة المجهرية فلورسنت مع خلية واحدة اقتصاص لإظهار التفاصيل. شريط المقياس = 10 ميكرون. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> الشكل 3. تطبيق البروتوكول إلى الدأب مشرق الميدانية photomicrographs. الرسوم التوضيحية لبروتوكول "تحليل هيكل عظمى" تطبيق الصورة المجهرية دأب مشرق حقل مع خلية واحدة اقتصاص لإظهار التفاصيل. شريط المقياس = 10 ميكرون. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> الشكل 4. تحليل البيانات مع أو بدون تطبيق البروتوكول. (أ) الصورة المجهرية مثال المدينة الفلورسنت واقتصاص الخلية المقابلة للمربع الأصفر في (ب). الصور الثنائية والعظمية مثلاً مع (ج) ودون (د) البروتوكول تطبيقها كما هو موضح. بيانات موجزة microglia نقاط النهاية/الخلية وعملية الطول/خلية في يصب (أبيض) وإصابة الأنسجة القشرية (رمادي) مع (ه) ودون (و) تطبيق البروتوكول. التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t للطالب و n = 3، * * يدل ف < 0.01. شريط المقياس = 10 ميكرون. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> الرقم 5. الاختلافات المستخدم مع بروتوكول التطبيق. مثال تحويل الصورة والبروتوكول الأصلي إلى صور ثنائية وهيكل عظمى من المستخدم 1 والمستخدم 2. يتم إبراز الفروق بين الصورتين مع مطابقة دوائر ملونة. الرسوم البيانية لملخص لبيانات الطول/خلية النهاية/الخلية وعملية microglia في مناطق الدماغ يصب والمصابين من قبل المستخدم 1 والمستخدم 2. التحليل الإحصائي ANOVA وعينه هو حجم n = 3؛ ف < 0.05، * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001. شريط المقياس = 10 ميكرون. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> الشكل 6. التحليل النمطي هندسي متكرر مع أو بدون تطبيق البروتوكول. مثال لاقتصاص photomicrographs من microglia في يصب (A) والجرحى (ب) اللحاء مع ثنائي المقابلة (ج)، والصور مخطط (د) التي تنتج مع أو بدون تطبيق البروتوكول. هال محدب المرتبطة بها (أزرق) وأرفق بها دائرة (الوردي) للأشكال مخطط المطابق (ه) تستخدم لحساب كثافة الشكل، وتغطي نسبة، والتدوير (ز). مربع عد الأسلوب المبين في (و)، وتستخدم للبعد كسورية (دب) وحسابات لاكوناريتي (λ) (ز). شريط المقياس = 10 ميكرون. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ at JoVE.com

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

ميكروجليا هي الخلايا المناعية الدماغ أن الدراسات الاستقصائية والرد على فسيولوجيا الدماغ غيرت من خلال تغييرات السمات التي يمكن تقييمها كمياً. هذه الخطوط العريضة للبروتوكول ImageJ على أساس تحليل بروتوكول لتمثيل مورفولوجيا microglia كبيانات مستمرة وفقا لمقاييس مثل الخلية تشعبت والتعقيد، والشكل.

التحديد الكمي مورفولوجية Microglia من Photomicrographs Immunohistochemistry استعداد النسيج باستخدام إيماجيج

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

التمهيدي لالمناعية على نسيج Cryosectioned دماغ الفئران: مثال تلطيخ لالدبقية الصغيرة والخلايا العصبية

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

استنفاد الانتقائي للالدبقية الصغيرة من مخيخي الحبيبة الثقافات الخلية باستخدام L-ليسين استر الميثيل

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

وغير المباشرة العصبية نجمية Coculture الفحص: هناك<em&gt; في المختبر</em&gt; مجموعة المتابعة للتحقيق مفصل من التفاعلات العصبية، الدبقية

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

العزلة وثقافة Microglia القوارض تعزيز دينامية تتفرع مورفولوجيا في المتوسط خالية من المصل

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

التحديد الكمي للتوزيع غير متجانسة من البروتين متشابك في الدماغ الماوس استخدام الفلورة

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...