Name: quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ at JoVE.com

מחקר זה קיבל תמיכה כספית מ- NINR (F32NR013611). נשמח עוד יותר להכיר ולהודות המפתחים של AnalyzeSkeleton(2D/3D) ו- FracLac (Arganda-קאררס. et al. , Karperien. et al., בהתאמה) ללא ניתוח הנתונים המתוארים בזאת שלא יהיה אפשרי.

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+microglia:+a+morphological+definition.">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).</li><li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus.">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).</li><li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury.">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion.">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers.">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li><li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+response+to+Alzheimer's+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments.">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li><li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis.">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li><li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study.">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice.">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microglia+activation:+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction.">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).</li><li>. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2014)</li><li>Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractal,+Multifractal,+and+Lacunarity+Analysis+of+Microglia+in+Tissue+Engineering.">Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).</li><li>Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+quantitative+analysis+of+microglial+morphology.">3D quantitative analysis of microglial morphology.</a> available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).</li><li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis.">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מיקרוגלייה התאים מכוילים פיזיולוגיה, פתולוגיה בתוך שלהם המיקרו-המחשבים, להציג מגוון רחב של אפשרויות מורפולוגיות2 עדין7,14 והן פגיעה בוטה8. השימוש ImageJ פרוטוקולים גורם מיקרוגלייה מורפולוגיה כימות נגיש כל המעבדות כפלטפורמה, תוספים בתוכנת עיבוד תמונה פתוח. בעוד הפרוטוקול המתואר ממוקדת עיבוד וניתוח תמונה באמצעות תוכנה זו, מרקם של איסוף נתונים, תוקף ומהימנות מתחיל IHC ומצויין מיקרוסקופ. פרוטוקול זה משמש לשיפור בינארי, שלד וייצוגי חלוקה לרמות של photomicrographs כולו, תאים בודדים אבל לא יכול לקחת את מקומו של צביעת IHC המסכן, מיקרוסקופיה שתוצאתו ניגודיות נמוכה, מטושטש, או עיוות תמונות. כמו שיקול נוסף, חייבים להקפיד לא לשטח על רקמת המוח במהלך האחסון, לפני חלוקתה, אשר באופן בלתי הפיך הפיצולים מיקרוגלייה מורפולוגיה. לבסוף, במסגרת ניסוי, מיקרוגלייה חייב לדימות שימוש באותו הסולם, כמו גם המיקרוסקופ אותו. מכשור, מטרות ותוכנות משתנים בין מיקרוסקופים אשר לגרום photomicrographs בגדלים שונים למרות מטרות דומות, לשנות את הפרטים, כמו גם את מספר התאים בתוך כל מסגרת. לדוגמה, ייבוא תמונות באמצעות מטרה X 40 על SPII לייקה תוצאות מספר כפול של תאים ופחות פרט מאשר רכישה באמצעות של 880 Zeiss. דבר זה חשוב במיוחד עבור תא הסתעפויות נתונים שנאספו מן המסגרת כולה ולא תא בודד, כמו זה הופך להיות עניין של נתוני דגימה.
באופן כללי, ניתוח שלד אשר מנצל את כל photomicrograph מקדים הניתוח פרקטל תא בודד משתי סיבות. הסתעפויות תא הקובע כל התאים photomicrograph היא מהירה כאשר לעומת הניתוח פרקטל תא בודד, עשוי להיחשב ככלי מיון אם הזמן הוא גורם. בנוסף, תמונות בינאריות נגזר במהלך ניתוח שלד משמשים לניתוח פרקטל. ברגע שעברה דימות, ישנם מספר שלבים קריטיים אשר עשויים להשפיע על תוצאות ניתוח שלד ולהציג למשתמש-השפעה. פרוטוקול השלבים ברוב משתנה בין משתמשים שלב 4.2 (הגדלת תמונות בהירות), צעד 4.5 (קביעת הסף). במידת האפשר, מספר של האופטימלית כדי להגדיל את הבהירות (המחוון מקסימום או מינימום בין 0-255) הוא נחוש והחזיק קבועה עבור כל המשתמשים ותמונות. איפה התמונה השתנות גדולה, המשתמש יכול לבחור במקום זאת בהירות כי ישתנה בין תמונות. לחלופין, אם תמונות הינם בהירים והוא ניגודיות גבוהה, ואז הגברת בהירות יכול להיות מושמט, סף יכול להיות מוגדר באמצעות מסנן סף מיוחדים (למשל., הואנג) ולא ברירת המחדל משתנה יותר. ברגע אופטימיזציה, הפרמטרים צריך להיות דבקה על מנת למזער את המשתמש נוספים-השפעה.
דוגמה של השתנות המשתמש מוצגת באיור5. ערכי נתונים היו עלה ב משתמש 1 לעומת משתמש 2, ולכן השתנות יהיה גידול אם משתמש 1 ו- 2 משתמש תרם אוסף נתונים. דוגמה של הבדלי משתמש 1 ו- 2 משתמש בינארי ותמונות skeletonized מודגשים על-ידי עיגולים צבעוניים (איור 5). במקרה זה, שני המשתמשים היו מאומנים בקצרה סטודנטים לתואר ראשון עם התמחות מוגבל מיקרוגלייה. פיקוח קבוע והדרכה על ידי מיקרוגלייה מומחה יחד עם פרוטוקול מוגברת הדרכה2 יכול להפחית את ההשתנות הבין-משתמש. אמנם לא העריכו כאן, ניתוח פרקטל הוא פחות להשתנות בין המשתמש כי בינארי תאים מבודדים באופן ידני והן באופן אישי photomicrograph, ולא להסתמך אך ורק על סף כדי לקבוע מיקרוגלייה צורות. עם זאת, כל השיטות יש כמה השתנות בין משתמשים. לכן, משתמש בודד (באופן אידיאלי, מאומנים על ידי כמה מומחיות בתאים מיקרוגלייה) צריך להשלים את איסוף הנתונים עבור כל הנתונים (dataset).
שינויים נוספים יכול להתבצע בקלות על פרוטוקול זה, יהיה תלוי באיכות התמונה, ואת המאמצים לנקוט כדי להפחית את הרעש ולהבטיח תהליך קישוריות. לדוגמה, אם ניגודיות נאותה, לאחר מכן חידוד מסיכה אינה נחוצה, יכול להיות מושמט. . זה חכם למטב ולסיים הפרוטוקול עבור קבוצה ספציפית של תמונות, המקרים ניסיוני והן פקדים, לפני איסוף נתונים מתוך סדרה שלמה. לבסוף, תוספים נוספים עשוי לשמש במקום אחרים כדי להבהיר או חידוד תמונות לא מתוארים פרוטוקול זה כגון להתרחב או חידוד.
היתרונות של פרוטוקול זה הם שלה אוניברסלי זמינות ויכולת הסתגלות. בנוסף, הערכת הסתעפויות התא באמצעות AnalyzeSkeleton הוא החלים photomicrograph שלמה ומהירה. אחד היתרונות של גישה ניתוחית מרובת-תאים הוא המוקד של האזור כולו במקום תאים בודדים. לכן, זה אפשרי להעריך במהירות את הסתעפויות הממוצע (מבחינת נקודות קצה, תהליך האורך) כל מיקרוגלייה בתוך התמונה. ניתוח שלד מספקת ניתוח של תאים מרובים: דגימה נתונים מבחינת מספרי הטלפון הנייד זה לא יכול להיות מתאימים על ידי פרקטל ניתוח בשל ההשקעה הזמן הנדרש כדי לבודד תאים בודדים מ- photomicrographs. מופע איפה זה יכול להיות המתאימה ביותר תהיה הקרנה מיקרוגלייה מורפולוגיות ב proximities כדי פגיעה נקודתית. מגבלה אחת היא עיבוד תמונה כל השדה ליצור מודלים שלד של IHC photomicrographs הוא לא מושלם כאשר לעומת הגישה לתא בודד זמן רב יותר. בנוסף, ניתוח האזור אינו מתאים לנסיבות איפה מיקרוגלייה מורפולוגיות שונים באופן מהותי בתוך אותו שדה. לבסוף, שיטה ניתוח זו היא תלויה ספירת התאים, פרמטר זה עשוי להיות שונה בין תנאי הניסוי.
ניתוח פרקטל מתנהלת על תא בודד ומשלים ולכן התא הממוצע הסתעפויות נתונים הפלט המתבררת מניתוח שלד. למרות הרבה יותר זמן רב, השקעה זו מניבה מגוון רחב של נתונים morphometric. לדוגמה, בתא צפיפות, יחס span, ומתארים מעגליות נתונים הגודל, התארכות, והצורה של החלוקה לרמות תא, בהתאמה. ממד פרקטל, lacunarity לסכם את המורכבות תא והטרוגניות צורה, בהתאמה. סיכום מעמיקה יותר של כיצד מחושב כל פרמטר ולא איך הנתונים עשוי להתפרש ידנית אינטראקטיבי16 ושירות בכזה פירוט צריך להיחשב ביחס שאלת המחקר הספציפי. הפרוטוקול המתואר תוצאות כלי רגיש לכמת שינויים קטנים במורפולוגיות מיקרוגלייה 2D שעלולות להתרחש בתנאים הפיזיולוגיות, פיפטות. ניתוח morphometric נוספים כגון אחידות, קמירות טופס גורם16,20 ייתכן אם יצירת צורות תלת-ממדיות.
פרוטוקול פיתוח והתאמה היא רציפה, המונעת על-ידי המשתמש. זה הוארך פלורסצנטיות8 DAB/בהיר-שדה תמונות7 , אבל עדיין לא הפרפין רקמות מוטבעים. . זה תוספת, זה יכול לשמש בשילוב עם תוכנות קנייניות כמו Imaris לניתוח נוסף. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם למגוון של פיזיולוגיה, אינה מוגבלת מיקרוגלייה אך ניתן להחיל את כל תאים או רקמות עם דפוסי מסוים או צורות הניתנות לזיהוי בשיטות IHC. לבסוף, עם גודל המדגם מספיק, ניתוח multivariate או אשכול ניתן ליישם stratify מיקרוגלייה על פי המורפולוגיה12,21; זהו מידע משמעותי כמו מורפולוגיה מיקרוגלייה הוא מחוון חיוני של פונקציות מיקרוגלייה תגובות על סביבתם. ההערכה על גיוון מורפולוגיות microglial הוא הרחבת וחשוב להבין באופן מלא את האינטראקציות נוירון-עכשיו, דונלד-וסקולרית במהלך מחלה ובריאות. צמיחה בתחום זה מועצמת על ידי פרוטוקולים מפותח, קל לשימוש, לשחזור לכמת ולסכם מורפולוגיה מיקרוגלייה באמצעות משתנים רציפים מרובים.

מיקרוגלייה יש מענה מיידי ומגוון מורפולוגיות כדי שינויים במוח פיזיולוגיה1 לאורך רצף של אפשרויות שנעים בטווח שבין מורפולוגיות hyper-השלכה ומורכבים מאוד ל מורפולוגיות כחוד דה, amoeboid2 . מיקרוגלייה עלול גם להיות מקוטב ו מוט בצורת3. מיקרוגלייה תא הסתעפויות מוגדר בדרך כלל כ צורה מורכבת שיש תהליכים מרובים, לעיתים קרובות המדווח מספר נקודות קצה עבור כל תא והאורך של תהליכים בתא. מאז מיקרוגלייה מכוילים לפונקציה עצביים, גליה עד תא רציפה-תא צולבות לדבר, אין ויוו תנועתיות4,5, מורפולוגיות מיקרוגלייה עשוי לשמש אינדיקטורים של פונקציות מגוונות תא בתפקוד במוח. בגישה הכמותית יש צורך מילים שיכולות לתאר את הגיוון של שינויים אלה מורפולוגיות, כדי להבחין את ההבדלים בין תאים כחוד להתרחש עם לפליטת הפיזיולוגיות עדין (כגון אפילפסיה5,6 זעזוע מוח7) בנוסף לפגיעה ברוטו (כגון קו8). שימוש מוגבר מורפולוגיה כימות7,8,9,10,11,12,13,14 תחשוף את המגוון המלא של מורפולוגיות מיקרוגלייה בזמן מחלה ובריאות. ההווה ללמוד פרטים השימוש stepwise ImageJ תוספים הדרושים לסכם מיקרוגלייה מורפולוגיה של photomicrographs פלורסנט או פלורסנט שאינן של מיקרוגלייה רכשה ברקמת מכרסמים קבוע לאחר אימונוהיסטוכימיה (IHC).
המרכזית של טכניקות ניתוח המתוארים כאן הם ImageJ תוספים AnalyzeSkeleton (דו-ממדי/תלת-ממדי)15, שפותחה בשנת 2010 כדי לכמת את החלב מבנים גדולים, ו FracLac16, שפותחה בשנת 2014 לשלב ImageJ וניתוח פרקטל כדי לכמת צורות מיקרוגלייה בודדים. תוספים אלה מספקים ניתוח מהיר של הסתעפויות מיקרוגלייה בתוך כל photomicrographs או מיקרוגלייה מרובים של רועי מוגדר בתוך photomicrograph. ניתוח זה עשוי לשמש לבד או משלים עם ניתוח פרקטל. הניתוח פרקטל תא בודד (FracLac) דורש השקעה של זמן, אבל מספק במספר יציאות מורפולוגיה בנוגע מיקרוגלייה המורכבות, צורה וגודל. השימוש בשני כלים הוא לא יתיר, כתא הסתעפויות משלים תא המורכבות, השילוב של פרמטרים מרובים עשוי לשמש כדי להבחין בין מורפולוגיות מיקרוגלייה מגוונות בתוך datasets12,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">primary antibody anti-IBA1</td>
			<td style="width:173px;">Wako&#160;</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td style="width:167px;">rabbit host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield soft mount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunorResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>donkey host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mL glass vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>UX-08923-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

מיקרוגלייה הם phagocytes המוח להשתתף המוח הומאוסטזיס, סקר ללא הרף סביבתם בתפקוד, פגיעה של המחלה. כמו המגיבים הראשונים, מיקרוגלייה יש תפקידים חשובים כדי להמתיק בתפקוד הנוירון, עכשיו, דונלד, בתהליך זה, הם עוברים מגוון רחב של שינויים מורפולוגיות. מיקרוגלייה מורפולוגיות יכולים להיות מסווגים descriptively או, לחלופין, ניתן לכמת כמשתנה רציף עבור פרמטרים כגון הסתעפויות תא, המורכבות צורה. בעוד שיטות לכימות מיקרוגלייה מוחלים על תאים בודדים, כמה טכניקות חלות מיקרוגלייה מרובים ב- photomicrograph כולו. מטרת שיטה זו היא לכמת מרובות, תאים בודדים באמצעות פרוטוקולי ImageJ זמינים. פרוטוקול זה הוא סיכום של הפעולות ImageJ תוספים מומלץ להמיר photomicrographs פלורסצנטיות, בהיר-שדה להחליפן בתמונות בינאריות, skeletonized, לנתח אותם באמצעות תוספים התוכנה AnalyzeSkeleton (דו-ממדי/תלת-ממדי) ו- FracLac עבור איסוף נתונים מורפולוגיה. התוצרים של התוספים האלה לסכם תא מורפולוגיה מבחינת תהליך נקודות קצה, צמתים, ואת אורך וכן המורכבות, תא צורה, גודל מתארי. פרוטוקול ניתוח שלד המתוארים בזאת היא מתאימה עבור ניתוח האזורי של מיקרוגלייה מרובות בתוך כל photomicrograph או אזור בעל עניין (ROI) בעוד FracLac מספק ניתוח משלימים תא בודד. הפרוטוקול משולב, מספק של המטרה, כלי להערכת רגיש, ומקיף זה יכול לשמש כדי stratify בין מיקרוגלייה מגוונות מורפולוגיות במוח נפגע ובריאה.

הפרוטוקולים ניתוח מורפולוגיה מיקרוגלייה המתוארים בזאת סיכום השלבים מסייעת עיבוד פלורסנט, photomicrographs DAB לניתוח morphometric. שלבים אלה מסוכמים באופן חזותי באיור 2, איור 3. מטרת השלבים היא ליצור נציג בינארי, skeletonized תמונת מודלים כראוי את photomicrograph המקורי כך הנתונים שהצטברו תקפים. לאחר יישום פרוטוקול, התוסף AnalyzeSkeleton תוצאות תמונה מתויגת שלד שממנו מספר נקודות הקצה וענף (כלומר., תהליכים) lengthcan ניתן לסכם מתוך קבצי הפלט המתקבל. נקודות קצה ונתונים אורך תהליך משמשים לאחר מכן כדי להעריך את היקף מיקרוגלייה הסתעפויות photomicrograph או ROI. איור 4 מסכם את הנתונים המתקבלים (נקודות קצה/התא ואת התהליך אורך/תא) שנאסף עם ובלי ליישום פרוטוקול. בעוד מגמות דומות קיימות, הנתונים מסוכם ב איור 4F הפכפך יותר מאלו של איור 4E. בנוסף, נתונים אלה ממחישים לרגישות מוגברת כדי לזהות הבדלים בין קבוצות כאשר הפרוטוקול מוחל. לבסוף, יש לנקוט לגבי השתנות בין המשתמש ביישום של הפרוטוקול. כזה ההבדלים מסוכמים על-ידי איור 5 איפה מאותה ערכת נתונים נותחה על ידי שני משתמשים עצמאית יישום פרוטוקול זהה כפי שסוכם לעיל.
מורפולוגיה נוספים הנתונים נאספים של תאים בודדים מבודד את תמונות בינאריות שנוצרו במהלך היישום פרוטוקול. השלבים פרוטוקול לנתח מיקרוגלייה מורפולוגיה לפני ושימוש התוסף FracLac מסוכמות באיור 6. אנו להמחיש את זה ניתוח שני שציווית (איור 6A), נפגע רקמות (איור 6B). להחליפן בתמונות של בינארי, המחולקת לרמות, קמורה הול/לבצע עיגול, ודוגמאות בתיבה ספירה עבור כל תא ניתח עם ללא הפרוטוקול יישום מוצגים באיור 6C–פ תמונות אלה מסייעים להמחיש את מקורותיה של הבדלים בנתוני מורפולוגיה אשר מסוכמות באיור 6G.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> איור 1. איורים של skeletonized מיקרוגלייה עם סומא מעגלית (שיוצרת) לעומת של מקור יחיד (אופטימלי) וראשה הכיסוי המתאים בין התא skeletonized את photomicrograph המקורי- סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> באיור 2. פרוטוקול ליישום פלורסנט photomicrographs. איורים של פרוטוקול שלד ניתוח המוחל על photomicrograph פלורסנט עם תא אחד נחתך כדי להציג פרטים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> איור 3. פרוטוקול ליישום DAB המוארים-שדה photomicrographs. איורים של פרוטוקול שלד ניתוח המוחלים על photomicrograph DAB בהיר-שדה עם תא בודד שנחתכו להראות פרטים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> באיור 4. ניתוח נתונים עם ובלי ליישום פרוטוקול. (א) photomicrograph דוגמה של פלורסנט IHC ותא החתוכה המתאים התיבה הצהובה (B). דוגמה בינארי ותמונות skeletonized עם (C) ללא (ד) פרוטוקול חלה כמתואר. נתוני סיכום של מיקרוגלייה נקודות קצה/התא ואת התהליך אורך/תא שציווית (לבן) נפגע רקמות בקליפת המוח (אפור) עם (E), בלי (F) מיושם הפרוטוקול. ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t של סטודנט ו- n = 3, * * מציין p < 0.01. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> איור 5. ההבדלים משתמש ביישום פרוטוקול. דוגמה של המרה המקורי התמונה ואת פרוטוקול לתמונות בינארי, שלד על-ידי המשתמש 1 ו- 2 משתמש. ההבדלים בין שתי תמונות מסומנים עם התאמה עיגולים צבעוניים. תרשימי סיכום מיקרוגלייה נקודות קצה/התא ואת התהליך אורך תא נתונים באזורים במוח שציווית ונפצעו על-ידי המשתמש 1 ו- 2 משתמש. ניתוח סטטיסטי ANOVA, דוגמת גודל הוא n = 3; p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> איור 6. ניתוח פרקטל עם ובלי ליישום פרוטוקול. דוגמה photomicrographs החתוכה של מיקרוגלייה שציווית (A), קליפת פצוע (B) המתאימים בינארי (C), ותמונות חלוקה לרמות (D) כתוצאה עם וללא פרוטוקול מוחל. המשויך קמור (כחול), התוחם את מעגל (ורוד) עבור צורות חלוקה לרמות מתאימות (E) משמשים לחישוב הצורה צפיפות, span יחס ולאחר מעגליות (G). תיבת לספור שיטת מאויר באיורים (F), השתמשו פרקטל ממד (DB), lacunarity (λ) חישובים (G). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ at JoVE.com

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

מיקרוגלייה הם תאים חיסוניים המוח כי סקר ולהגיב המוח שינו פיסיולוגיה באמצעות שינויים מורפולוגיות אשר עשויים להעריך באופן כמותי. זה מתאר פרוטוקול ImageJ מבוסס פרוטוקול ניתוח כדי לייצג מיקרוגלייה מורפולוגיה רציפה לנתונים על פי מדדים כגון הסתעפויות תא, המורכבות צורה.

לכימות מיקרוגלייה מורפולוגיה של Photomicrographs של אימונוהיסטוכימיה מוכן רקמות באמצעות ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

המחשה מורפולוגיה באמצעות לוציפר ביוטופזיס צהוב

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...