Name: quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 44 s
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本研究は、NINR (F32NR013611) から金融サポートを受け取った。さらにお客様し、AnalyzeSkeleton(2D/3D) と FracLac の開発者に感謝したいと思います (アルガンダ ・ カレーラスらや Karperienら、それぞれ) を記載分析不可能なし。

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. 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著者が明らかに何もありません。

ミクログリア細胞生理学および病理学のマイクロ ドメイン内には、細かくチューニングし、微妙な7,14の総損傷8形態2の多様な範囲を表示します。ImageJ プロトコルの使用は、プラットフォームとしてミクログリアの形態の定量化をすべて研究所にアクセスできるように、プラグイン、オープン ソース画像処理ソフト。記述されていたプロトコルは画像処理と解析のこのソフトウェアを使用して焦点を当て、信頼性、妥当性、データ コレクションの整合性は、優れた IHC と顕微鏡によって始まります。このプロトコルを使用してバイナリ、スケルトン、および全体の顕微鏡写真と単一セルのアウトライン表現の向上が、貧しい IHC 染色の場所を取ることができないと低コントラストになる顕微鏡がぼやけて、または画像の歪み。追加の考慮事項としてミクログリアの形態を決定的に変えるごとに区分化する前に、ストレージの中に脳を平らにしないように注意する必要があります。最後に、各実験内、ミクログリアは同じ顕微鏡と同様に、同じスケールを使用して視覚化される必要があります。計測、目標、およびソフトウェアは、同様の目的にもかかわらず異なるサイズの顕微鏡写真の結果、各フレーム内のセルの数と同様、細部が変更された顕微鏡の間で異なります。たとえば、ライカ SPII で 40 × 対物を使用してイメージ買収の結果ほどツァイス 880 を使用してより詳細なデータとセルの数 2 回で。これは、このデータのサンプリングの問題になりますフレーム全体ではなく、単一のセルからセル分岐データにとって特に重要。
一般に、全体の顕微鏡写真を生かしたスケルトン分析 2 つの理由のため単一細胞のフラクタル解析の前に。顕微鏡写真のすべてのセルの決定のセル分枝は急速な単一細胞のフラクタル解析と比較して、時間が重要な場合、スクリーニング ツールとして考慮されるかもしれない。さらに、スケルトン分析中に派生したバイナリ イメージはフラクタル解析の使用します。このイメージを作成すると、一度スケルトン分析結果に影響を与える可能性があります、ユーザー影響を紹介する重要な手順の数があります。ユーザー間のほとんどの変数は、プロトコルの手順ステップ 4.2 (増加のイメージの明るさ)、ステップ (しきい値の決定) 4.5。可能であれば、輝度 (0-255 の間 max または min スライダー) を高めるための最適な数が決定、すべての画像とユーザーの一定に保たれます。画像変動は素晴らしいが、ユーザーは画像によって異なります明るさを代わりに選択できます。また、画像は明るく、コントラストが高い場合、省略できますし、明るさを増加と専門のしきい値フィルターを使用して、しきい値を標準化できます (e.g。、黄) より変数の既定値ではなく。最適化されれば、追加ユーザー影響を最小限にするためにパラメーターを従う必要があります。
ユーザーの変動の例を図 5に示します。ユーザー 1 とユーザー 2 に増加したデータ値、したがってユーザー 1 とユーザー 2 はデータの収集に貢献した場合、変動を増加するでしょう。ユーザー 1 とユーザー 2 のバイナリとスケルトンのイメージの違いの例は色のついた丸 (図 5) で強調表示されます。この場合、両方のユーザーはミクログリアの限られた専門知識を持つ簡潔に訓練を受けた学部生だった正規監督とミクログリア増加プロトコル トレーニング2と共に専門家による指導・助言は、ユーザ間の可変性を減らすことができます。ここで評価されていません、フラクタル解析がユーザ間変動の影響受けにくいバイナリ細胞ミクログリアの図形を決定するしきい値に頼るのではなく、顕微鏡写真から手動で、個別に分離されているため。ただし、すべてのメソッドは、ユーザー間のいくつかの変動を持っています。したがって、単一のユーザー (理想的には、ミクログリア細胞のいくつかの専門知識によって訓練) データセット全体のデータ収集を完了する必要があります。
追加の変更はこのプロトコルを簡単に行うことができ、画質とノイズを低減し、プロセスの接続を確保する取り組みによって異なります。たとえば、コントラストが適切な場合、アンシャープ マスク必要はありませんし、省略することができます。最適化し、画像、実験例、セット全体からデータを収集する前に、コントロールの特定のセットのプロトコルを完了することをお勧めします。明確またはこのプロトコルに記載されたいない画像をシャープに代わりに他の最後に、追加プラグインを使用するようにさせるか、または研ぐ。
このプロトコルの利点は、その普遍的な可用性と適応性です。さらに、AnalyzeSkeleton を使用してセルの結果を評価する方が迅速かつ全体の顕微鏡写真に適用です。多細胞の解析アプローチの利点は単一のセルではなく、地域全体に焦点を当てるです。そのため、画像内のすべてのミクログリアの (エンドポイント ・ プロセスの長さの面で平均分枝を迅速に評価することが可能です。スケルトン分析を提供する複数のセルの解析: 顕微鏡写真からの単一のセルを隔離する必要な時間の投資のためのフラクタル解析を用いた一致ことはできませんセル数の面でデータ サンプリング。スクリーニングの焦点の傷害に近接電波のミクログリアの形態で最適ありますインスタンスになります。1 つの制限は、IHC 顕微鏡写真のスケルトン モデルを作成するフィールド全体イメージのレンダリングがより時間がかかる単一セル方式と比較して完璧ではないです。さらに、領域の分析は状況に適切なミクログリアの形態が大きく異なる同じフィールド内です。最後に、この分析法は細胞数、実験条件が異なる場合がありますパラメーターに依存しています。
フラクタル解析は、単一のセルに実施し、したがってスケルトン分析で得られた平均セル分岐データ出力を補完します。ただしより多くの時間がかかり、この投資は、地形データの広い範囲を得られます。たとえば、細胞の密度、スパン比と真円度データ サイズ、伸長、およびセル アウトラインの形をそれぞれについて説明します。フラクタル次元とベクトルは、それぞれセル複雑さと図形の不均一性をまとめたものです。インタラクティブ マニュアル16で各パラメーターの計算方法とデータがどのように解釈されるかもしれないの詳細な概要を提供し、そのような詳細は、具体的な研究の質問に関連して考慮すべき。生理学的および病理学的条件で発生する可能性があります 2 D ミクログリアの形態の小さな変化を定量化する敏感なツールで説明されているプロトコル結果。堅さ、凸状、フォーム ファクター16,20など追加形態計測学的解析が可能な 3次元形状を生成する場合あります。
プロトコルの開発と適応は継続的かつユーザー駆動です。それは蛍光8からパラフィン埋め込まれた組織に DAB/明視野画像7がまだ拡張されています。これまた、詳細な分析、Imaris など独自のソフトウェアと組み合わせて使用されることができます。このプロトコルさまざまな生理学に適用することができます、ミクログリアに限定されない、任意のセルまたはティッシュ特定のパターンまたは IHC メソッドを使用して識別することができる図形に適用されます。最後に、十分なサンプル サイズを持つ多変量またはクラスター分析に適用できる形態12,21によるとミクログリアを階層化これは、ミクログリアの形態はミクログリアの機能とその周辺への応答の重要な指標として意味のある情報です。ミクログリアの形態学的多様性のための感謝は、拡大と健康と病気の間にニューロン-グリア細胞血管の相互作用を十分に理解することが重要です。この分野の成長は、定量化し、複数の連続変数を用いたミクログリアの形態を要約のよく発達した、使いやすく、再現性のあるプロトコルによって強化されています。

ミクログリアは、脱分岐し、アメーバ形態2 にハイパー分岐と非常に複雑な形態からその範囲可能性の連続体に沿って脳生理学1で変化への迅速かつ多様な形態学的応答を持っています。.ミクログリアは、偏光と棒状の3もなります。ミクログリア細胞分岐は複数のプロセスを持つ複雑な形状としてよく定義されているし、セルごとのエンドポイントの数や細胞プロセスの長さとしてしばしば報告されています。ミクログリアの形態が多様な細胞機能と機能障害の指標として役立つかもしれないミクログリアが細かく連続細胞間クロストークとin vivo運動4,5を介して神経細胞およびグリア細胞の機能に調整されているので脳内。定量的アプローチ (てんかん5,6など微妙な生理学的な摂動で発生する分岐し細胞間の違いを区別するためにこれらの形態学的変化の多様性を十分に説明する必要があります。脳震盪7) (ストローク8) など総損傷に加えて。形態の定量化7,8,9,10、11,12,13,14の使用の増加健康と病気の間にフル ミクログリアの形態の多様性を明らかになります。本研究は ImageJ プラグイン ミクログリアの蛍光または非蛍光性顕微鏡写真からミクログリアの形態を要約する必要の段階的な使用は、免疫組織染色 (IHC) 後固定の齧歯動物のティッシュで取得した情報。
中央ここで説明されている分析手法には、ImageJ プラグイン AnalyzeSkeleton (2 D ・ 3 D)15、乳腺の大型構造物を定量化する 2010年で開発された FracLac16, 2014 年 ImageJ とフラクタル解析を統合するために開発されました。個々 のミクログリア図形を定量化します。これらのプラグインは、全体の顕微鏡写真内ミクログリア分枝の迅速分析または顕微鏡写真内で定義された投資収益率の複数のミクログリアを提供します。この分析は、単独またはフラクタル解析を補完するために使用可能性があります。単一セルのフラクタル解析 (FracLac) は時間の投資が必要ですが、ミクログリアの複雑さ、形状、およびサイズに関する複数の形態の出力を提供します。両方のツール使用は冗長ではありません、分枝はセルの複雑さに相補的な細胞として、データセット12,17内の多様なミクログリアの形態を区別する複数のパラメーターの組み合わせを使用することがあります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">primary antibody anti-IBA1</td>
			<td style="width:173px;">Wako&#160;</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td style="width:167px;">rabbit host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield soft mount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunorResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>donkey host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mL glass vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>UX-08923-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

ミクログリアは脳食脳のホメオスタシスに参加し、疾患、損傷、機能不全のために環境を継続的に調査します。最初のレスポンダーとしてミクログリアは、ニューロンとグリア細胞の機能障害を軽減するために重要な機能を持っているし、この過程で、彼らは広範な形態学的変化を受けます。ミクログリアの形態は唱え分類できます。 または、または、セルの分枝、複雑さ、および図形などのパラメーターを連続変数として定量化することができます。ミクログリアを定量化するためのメソッドは、単一のセルに適用される、ほとんどのテクニック全体の顕微鏡写真で複数のミクログリアに適用されません。このメソッドの目的は、複数を定量化して容易に利用可能な ImageJ プロトコルを使用して単一セル。このプロトコルの手順の概要は、ImageJ プラグインの蛍光および明るいフィールド顕微鏡写真を代表的なバイナリとスケルトンの画像に変換し、それらを分析するをお勧めします AnalyzeSkeleton (2 D ・ 3 D) と FracLac のソフトウェアのプラグインを使用して、データ収集の形態。これらのプラグインの出力は、プロセスのエンドポイント、接合、および長さの複雑さ、セル形状とサイズの記述子の面で細胞の形態をまとめたものです。記載スケルトン分析プロトコルは、FracLac は、相補的な個々 のセル分析を提供に対し全体の顕微鏡写真や利益 (率 ROI) の領域内の複数のミクログリアの地域分析に適して。プロトコルは組み合わせることで、目的、多様なミクログリアの形態の健康と負傷者の脳内に存在間を分類する使用ことができます、敏感で、包括的なアセスメント ツールを提供します。

ミクログリアの形態分析のプロトコルに記載は、蛍光のおよび形態計測学的解析のための軽打の顕微鏡写真の処理に役立つ手順をまとめたものです。これらの手順を図 2に視覚的にまとめますと図 3。これらの手順の目標は、蓄積されたデータが有効になるよう適切に元の顕微鏡写真をモデル化する代表的なバイナリと白骨イメージを作成することです。プロトコル アプリケーション後 AnalyzeSkeleton プラグインの結果からタグ付けのスケルトン画像エンドポイントや支店の数 (すなわち。、プロセス) でできた金管楽器は、結果として得られる出力ファイルから要約します。エンドポイント ・ プロセスの長さデータは、顕微鏡写真や投資収益率のミクログリア分枝の程度を推定する使用されます。図 4は、プロトコル アプリケーションと収集結果のデータ (エンドポイント/セルとプロセスの長さ/セル) をまとめたものです。同様の傾向が存在する図 4 階に集約されたデータは図 4Eに比べて変化が少ないです。これらのデータが、プロトコルが適用されたときのグループ間の違いを検出する感度の向上を説明するさらに、します。最後に、ケアは、プロトコルのアプリケーションにおけるユーザ間変動に関する取られなければなりません。図 5上述と同じプロトコルを適用する 2 つの独立したユーザーが同じデータ セットを行ったによってこのような違いをまとめます。
その他の形態のデータは、プロトコルの適用時に作成されたバイナリ イメージから分離された単一のセルから収集されます。前にミクログリアの形態および図 6に FracLac プラグインをまとめてを使用して分析するプロトコル手順。我々 は両方無傷 (図 6 a) でこの分析を説明し、(図 6 b) 組織を負傷しました。バイナリ、アウトライン、ハル/カプセル化円、およびボックスのカウント例で各セルを分析し、図 6-f.に表示されますアプリケーション プロトコルを使用せずに凸の代表的な画像これらのイメージは、図 6に示す形態データの相違の起源を説明するために役立ちます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> 図 1。(最適な) 単一の起源相馬と白骨細胞と元の顕微鏡写真の対応するオーバーレイ (準) 円形相馬と白骨ミクログリアのイラスト。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> 図 2。蛍光顕微鏡写真にアプリケーションをプロトコルします。詳細を表示する単一細胞の蛍光顕微鏡写真に適用されるスケルトン分析プロトコルのイラストをトリミングしました。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> 図 3。明視野 DAB にプロトコル アプリケーション顕微鏡写真。トリミングの詳細を表示する単一のセルに明視野軽打の顕微鏡写真に適用されるスケルトン分析プロトコルのイラスト。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> 図 4。データ分析とプロトコル アプリケーションなし。(A) (B) で黄色い箱に対応する蛍光 IHC とトリミングの例の顕微鏡写真。例のバイナリと白骨画像 (C) および (D) に従って適用プロトコルなし。ミクログリア エンドポイント/セルとプロセスの長さ/セルの集計データ (白) を無傷し、プロトコルの適用なし (F) (E) (グレー) 大脳皮質組織を負傷しました。スチューデント t 検定と n を使用して統計分析、3 を = * * p < 0.01 を表します。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> 図 5。プロトコルのアプリケーションとユーザーの違い。ユーザー 1 とユーザー 2 がバイナリとスケルトンの画像にオリジナル画像とプロトコル変換の例です。色のついた丸が一致する 2 つの画像間の相違点がハイライトされます。ユーザー 1 とユーザー 2 が無傷と負傷者の脳領域におけるミクログリア エンドポイント/セルとプロセスの長さ/セルのデータの概要のグラフ。統計分析分散分析とサンプル サイズが n = 3;p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> 図 6。フラクタル解析プロトコル アプリケーションと。無傷 (A) と (C) 対応するバイナリおよび適用プロトコルと結果概要 (D) 画像で負傷した (B) 皮質におけるミクログリアのトリミングの顕微鏡写真の例です。関連付けられている凸型ハル (青) と対応するアウトライン図形 (E) (ピンク) サークル囲む形密度計算、比率、および真円度 (G) にまたがるされます。ボックスカウンティング法は (F) に示す、フラクタル次元 (D ・B) とベクトル (λ) 計算 (G) に使用します。スケール バー = 10 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

ミクログリアは、調査、定量的評価されるかもしれない形態の変化によって変えられた脳生理学に反応する脳の免疫細胞です。このプロトコルの概要、ImageJ ベースのセル分枝、複雑さ、および図形などによると継続的なデータとしてミクログリアの形態を表す解析プロトコル。

免疫組織化学準備 ImageJ を用いた組織の顕微鏡写真からミクログリアの形態の定量化

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

L-ロイシンメチルエステルを使用した小脳顆粒細胞培養物からのミクログリアの選択的枯渇

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

ルシファー黄イオン球形成を用いてアストロサイト形態を可視化

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...