Name: light-sheet microscopy for three-dimensional visualization of human immune cells
Uploaded: 2018-06-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells at JoVE.com

Wij danken het Instituut voor klinische Hemostaseology en transfusiegeneeskunde voor het verstrekken van bloed van de donor; Carmen Hässig en Cora Hoxha voor uitstekende technische hulp. Wij danken Jens Rettig (Universiteit van Saarland) voor de gewijzigde pMAX vector, Roland Wedlich-Söldner (Universiteit van Münster) voor de originele constructie van de LifeAct-Ruby en Christian Junker (Universiteit van Saarland) voor het genereren van de LifeAct-mEGFP-constructie. Dit project werd gefinancierd door Sonderforschungsbereich 1027 (project A2 BQ) en 894 (project A1 M.H.). De licht-blad Microscoop werd gefinancierd door DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Onderzoek uitgevoerd voor deze studie met de menselijk materiaal (leukocyte reductie systeem chambers van menselijk bloeddonoren) is geautoriseerd door de lokale ethische Commissie (verklaring van 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) en de desbetreffende richtsnoeren volgt.
1. bereiding van geneutraliseerde collageen-oplossing (500 µL)
<ol><li>Breng 400 µL van gekoeld collageen stockoplossing (10.4 mg/mL) tot een steriele 1,5 mL koker onder de motorkap van cel cultuur. Voeg langza...

<ol>
	<li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensions+in+cell+migration.">Dimensions in cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).</li><li>Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+migration,+search+strategies+and+mechanisms.">T cell migration, search strategies and mechanisms.</a> Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).</li><li>Entschladen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+of+human+cell+migration.">Analysis methods of human cell migration.</a> Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).</li><li>Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+cell+survival+factor.">The extracellular matrix as a cell survival factor.</a> Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+cell+migration:+a+multiscale+tuning+model.">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems:+advantages+and+applications.">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).</li><li>Fang, Y., Eglen, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Cultures+in+Drug+Discovery+and+Development.">Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development.</a> SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).</li><li>Schoppmeyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+profilin+1+is+a+negative+regulator+of+CTL+mediated+cell-killing+and+migration.">Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration.</a> Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging.">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bystander+cells+enhance+NK+cytotoxic+efficiency+by+reducing+search+time.">Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time.</a> Sci Rep. 7, 44357 (2017).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+leading+edge+of+three-dimensional+cell+migration.">At the leading edge of three-dimensional cell migration.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).</li><li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer).">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer).</a> Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro.">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).</li><li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models.">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Verveer, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+imaging+of+large+specimens+with+light+sheet-based+microscopy.">High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy.</a> Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li></ol>

Meeste in vitro tests worden uitgevoerd op een 2D oppervlak, bijvoorbeeld in celkweek platen, petrischalen of op coverslips, terwijl in vivo cellen, met name de immuuncellen, meestal een 3D communicatie ervaren. Opkomende bewijs toont aan dat migratiepatronen van immune cellen tussen 2D en 3D scenario's17 verschillen. Bovendien zijn de expressieprofielen van tumorcellen ook verschillend in 2D - en 3D-gekweekte weefsels18,19</su...

Meeste kennis over het migreren van cellen afkomstig van 2D experimenten1,2,3, die normaal gesproken worden uitgevoerd in een glas of plastic oppervlak voor een cultuur/imaging schotel. Een fysiologische scenario vereist echter, in de meeste gevallen een 3D communicatie, die de extracellulaire matrix (ECM) een beslissende rol speelt. ECM biedt niet alleen de 3D structuur essentieel belang zijn voor het handhaven van de juiste cel morfologie maar biedt ook overleving signalen of directionele signalen voor een optimale werking van veel cellen4,5 . Daarom moet een 3D-omgeving beter identificeren cellulaire functies en het gedrag in een omgeving die beter als gevolg van de fysiologische context.
In het menselijk lichaam oefenen de meeste cellen vooral immune cellen, hun functies in een 3D-scenario. Bijvoorbeeld, geactiveerde T-cellen patrouille op zoek naar doelcellen weefsels, naïef T cellen migreren door lymfklieren in zoektocht naar hun cognaat antigeen-presenteren cellen waarin de migratiemodus en machines aangepast aan de overeenkomstige extracellulaire zijn milieu3,6,7. De 3D collageen gel is wijd verbeid gebruikt als een gevestigde en goed gekarakteriseerd 3D cel cultuur systeem8,9,10. Onze vorige werk blijkt dat primaire menselijke lymfocyten uiterst mobiel zijn en op een gemiddelde snelheid van ongeveer 4,8 µm/min bij een 0,25% collageen gebaseerde matrix11migreren. Omlegging van cytoskelet speelt een sleutelrol in de cel migratie12. Het vergaren van bewijsmateriaal blijkt dat lymfocyten geldt niet slechts een enkele soort migratie nog kunnen schakelen tussen bepaalde migratie gedrag afhankelijk van de locatie, de communicatie, de cytokines, de Chemotactische hellingen, en extracellulaire welke melodie signalen de trekgedrag in verschillende manieren 3.
Om betrouwbaar te analyseren immuun cel functies en gedrag, bijvoorbeeld migratie, uitsteeksel vorming of vesiculaire vervoer, is het van groot voordeel te kunnen verwerven in relatief grote volumes van de 3D beelden op een snelle en betrouwbare manier. Voor 3D-beeldbewerking biedt de technologie van de onlangs ontwikkelde licht vel microscopie (ook enkel vliegtuig verlichting microscopie genoemd) een bevredigende oplossing13,14. Tijdens het imaging overname, is een dunne statisch licht blad gegenereerd om te verlichten van het monster. Op deze manier, op het vlak van de focus, kan een groot gebied gelijktijdig zonder de cellen uit het vliegtuig worden verlicht. Deze eigenschap laat een hoge acquisitie snelheid met een drastisch verminderde bleken en fototoxiciteit. In dit artikel beschrijven we hoe te visualiseren van primaire menselijke immune cellen met behulp van licht vel microscopie en hoe te analyseren van de migratie in een 3D-scenario.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibricol, bovine collagen solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>&#160;#5133-20ML</td>
			<td>Collagen matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M NaOH Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1091381000</td>
			<td>for neutralizing Fibricol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low melting agarose</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>32821-10GM</td>
			<td>Sample preparation in low c[Col]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11348D</td>
			<td>Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11132D</td>
			<td>Activation of CTL populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant interleukin-2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC0023</td>
			<td>Stimulation of cultured CTL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary solution kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-30XX</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-PFN1 antibody, rabbit, IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124904</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A22284</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Fluorescent cell label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-250mL</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>018774</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Dulbecco&#39;s phopsphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat &#945; Rabbit 568, IgG, rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HeraSafe KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator HERACell 150i&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418 and 5452</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-444, 89079-436, 89079-452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>&#160;62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries 50 &#181;L</td>
			<td>VWR (Brand)</td>
			<td>613-3373</td>
			<td>Zeiss LSFM sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger for capillaries</td>
			<td>VWR (Brand)</td>
			<td>BRND701934</td>
			<td>&#34;Stamps with Teflon tip&#34; LSFM sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MColorPhast pH stips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1095430001</td>
			<td>to test pH of neutralized Fibricol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Plastipak 1mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z230723&#160;ALDRICH</td>
			<td>Alternative sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)</td>
			<td>Play-Doh</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris file converter</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>available at http://www.bitplane.com&#160;</td>
			<td>Convert imaging files to Imaris file format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>available at http://www.bitplane.com&#160;</td>
			<td>Analysis of 3D and 4D imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet microscopy for three-dimensional visualization of human immune cells

In vivo, activering, proliferatie en functie van alle immuuncellen optreden in een driedimensionale (3D) omgeving, bijvoorbeeld in de lymfeklieren of weefsels. Up to date afhankelijk meeste in vitro systemen van tweedimensionale (2D) oppervlakken, bijvoorbeeld cel-cultuur platen of coverslips. Optimaal mimic fysiologische omstandigheden in vitrogebruiken we een eenvoudige 3D collageen-matrix. Collageen is een van de belangrijkste componenten van de extracellulaire matrix (ECM) en is wijd verbeid gebruikt voor het vormen van 3D-matrices. Voor 3D-beeldbewerking, wordt de technologie van de onlangs ontwikkelde licht vel microscopie (ook enkel vliegtuig verlichting microscopie genoemd) gekenmerkt met de overname van de hoge snelheid, grote indringingsdiepte, lage bleken en fototoxiciteit. Licht vel microscopie is bovendien bijzonder voordelige voor lange termijn meting. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol hoe te zetten en behandelen van menselijke immune cellen, bijvoorbeeld primaire menselijke cytotoxische T-lymfocyten (CTL) en natural killer (NK) cellen in de matrix van de 3D collageen voor gebruik met de licht-blad microscopie voor levende cellen beeldvorming en vaste monsters. De procedure voor Beeldacquisitie en analyse van cel migratie worden gepresenteerd. Een bijzondere aandacht is besteed aan het wijzen op kritische stappen en factoren voor de bereiding van de monsters en data-analyse. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in een matrix van 3D collageen en is niet beperkt tot immune cellen.

Uitsteeksel formatie tijdens T-cel migratie is een uiterst dynamisch proces, dat actine afhankelijk is. Om te visualiseren uitsteeksel vorming van primaire menselijke CTL, transfected we Transient een mEGFP gesmolten eiwit om het cytoskelet actine in CTL zoals beschreven voor11van een label. Een dag na de transfectie, werden de cellen ingesloten in de collageen-matrix. Afbeeldingsstapels werden verworven elke 40 s met een stap grootte van 1 µm bij 37 ° C met behu...

Watch this Scientific Journal Video about Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells at JoVE.com

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van immune cellen die zijn ingesloten in een matrix van de driedimensionale (3D) collageen met behulp van licht vel microscopie. Dit protocol wordt ook ingegaan hoe bijhouden van cel migratie in 3D. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in de 3D-matrix.

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Visualisatie van de immunologische Synapse door Dual Color Time-gated stimulated emission depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Een semi-automatische Aanpak Voorbereiding Antibody Cocktails voor Immunophenotypic Analyse van de humane perifere bloed

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...