Name: light-sheet microscopy for three-dimensional visualization of human immune cells
Uploaded: 2018-06-13T13:30:00
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Wir danken dem Institut für klinische Hemostaseology und Transfusionsmedizin für die Bereitstellung von Spenderblut; Carmen Hässig und Cora Hoxha für ausgezeichnete technische Hilfe. Wir danken Jens Rettig (Universität des Saarlandes) für den modifizierten pMAX-Vektor, Roland Wedlich-Söldner (Universität Münster) für das original LifeAct-Ruby-Konstrukt und Christian Junker (Universität des Saarlandes) zur Erzeugung der LifeAct-mEGFP-Konstrukt. Dieses Projekt wurde gefördert vom Sonderforschungsbereich 1027 (Projekt A2, B.Q.) und 894 (Projekt A1, m.h.). Das Licht-Blatt-Mikroskop wurde finanziert durch die DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Für diese Studie mit Menschenmaterial (Leukozyten Reduktion System Kammern von menschlichen Blutspendern) durchgeführten Forschungsarbeiten ist berechtigt, von der lokalen Ethikkommission (Erklärung von 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) und folgt den entsprechenden Richtlinien.
1. Vorbereitung des neutralisierten Kollagen Lösung (500 µL)
<ol><li>Übertragen Sie 400 µL der Stammlösung gekühlte Kollagen (10,4 mg/mL) auf eine sterile 1,5 mL-Tube unter der Haube Zelle Kultur....

<ol>
	<li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensions+in+cell+migration.">Dimensions in cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).</li><li>Krummel, M. 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J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+leading+edge+of+three-dimensional+cell+migration.">At the leading edge of three-dimensional cell migration.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).</li><li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer).">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer).</a> Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro.">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).</li><li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models.">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Verveer, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+imaging+of+large+specimens+with+light+sheet-based+microscopy.">High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy.</a> Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li></ol>

Die meisten in-vitro- Tests sind auf einer 2D Oberfläche, zum Beispiel in Petrischalen Zellkultur Platten oder auf Deckgläsern, durchgeführt, während in Vivo Zellen, vor allem Immunzellen, vor allem eine 3D Mikroumgebung erleben. Anzeichen dafür zeigt, dass Migrationsmuster von Immunzellen zwischen 2D und 3D Szenarien17unterscheiden. Die expressionsprofile von Tumorzellen unterscheiden sich darüber hinaus auch in 2D und 3D kultiviert Gewebe18,</...

Die meisten wissen über Migration Zellen stammt aus 2D Experimente1,2,3, die sind in der Regel in einem Glas oder Kunststoff-Oberfläche der Kultur/Bildgebung durchgeführt Gericht. Eine physiologische Szenario erfordert jedoch in den meisten Fällen eine 3D Mikroumgebung, in denen die extrazelluläre Matrix (ECM) eine entscheidende Rolle spielt. ECM bietet die 3D-Struktur ätherischen um richtige Zellmorphologie beizubehalten nicht nur, sondern bietet auch überleben Signale oder direktionale Hinweise für eine optimale Funktion von vielen Zellen4,5 . Daher muss eine 3D-Umgebung Zellfunktionen und Verhalten in einem Umfeld besser reflektieren die physiologischen Zusammenhang besser zu identifizieren.
Im menschlichen Körper üben die meisten Zellen vor allem Immunzellen, ihre Funktionen unter einem 3D Szenario. Zum Beispiel aktivierte T-Zellen patrouillieren Gewebe auf der Suche nach Zielzellen, naive T-Zellen durchwandern Lymphknoten auf der Suche nach ihrem cognate Antigen-präsentierenden Zellen während, die Migrationsmodus und Maschinen an die entsprechenden extrazelluläre angepasst sind Umwelt,3,6,7. Das 3D Kollagen-Gel wurde weithin als ein etabliertes und gut charakterisierten 3D Zelle Kultur System8,9,10eingesetzt worden. Unsere bisherige Arbeit zeigt, dass die primären menschliche Lymphozyten sind sehr mobil und mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von rund 4,8 µm/min in einem 0,25 % Kollagen-basierten Matrix11zu migrieren. Neuordnung des Zytoskeletts spielt eine Schlüsselrolle in der Zelle Migration12. Sammeln Beweise zeigt, dass Lymphozyten gelten nicht nur einen einzigen Modus der Migration noch können zwischen bestimmten Migrationsverhalten in Abhängigkeit von der Lage, Mikroumgebung, Zytokine, chemotaktische Gradienten und extrazelluläre welche Melodie Signale die Wanderungsverhalten in unterschiedlicher Weise 3.
Immunzellen Funktionen und Verhalten, z. B. Migration, Vorwölbung Bildung oder vesikulärer Transport zuverlässig zu analysieren ist es von großem Vorteil in der Lage sein, Bilder in relativ großen Mengen 3D in einer schnellen und zuverlässigen Art und Weise zu erwerben. Für 3D-Bildgebung bietet die neu entwickelte Licht-Blatt-Mikroskopie-Technologie (auch bezeichnet als einziges Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie) eine zufrieden stellende Lösung13,14. Während imaging Acquisition, wird eine statische Licht Dünnblech generiert, um die Probe beleuchten. Auf diese Weise auf die Fokusebene kann großflächig gleichzeitig beleuchtet werden, ohne die Zellen außerhalb der Ebene. Diese Funktion ermöglicht eine hohe Geschwindigkeit mit einem drastisch reduzierten Bleichen und Photozytotoxizität. In diesem Artikel beschreiben wir wie primäre menschliche Immunzellen mit Licht-Blatt Mikroskopie zu visualisieren und analysieren Sie die Migration in einem Szenario mit 3D.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibricol, bovine collagen solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>&#160;#5133-20ML</td>
			<td>Collagen matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M NaOH Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1091381000</td>
			<td>for neutralizing Fibricol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low melting agarose</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>32821-10GM</td>
			<td>Sample preparation in low c[Col]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11348D</td>
			<td>Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11132D</td>
			<td>Activation of CTL populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant interleukin-2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC0023</td>
			<td>Stimulation of cultured CTL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary solution kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-30XX</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-PFN1 antibody, rabbit, IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124904</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A22284</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Fluorescent cell label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-250mL</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>018774</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Dulbecco&#39;s phopsphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat &#945; Rabbit 568, IgG, rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HeraSafe KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator HERACell 150i&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418 and 5452</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-444, 89079-436, 89079-452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>&#160;62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries 50 &#181;L</td>
			<td>VWR (Brand)</td>
			<td>613-3373</td>
			<td>Zeiss LSFM sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger for capillaries</td>
			<td>VWR (Brand)</td>
			<td>BRND701934</td>
			<td>&#34;Stamps with Teflon tip&#34; LSFM sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MColorPhast pH stips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1095430001</td>
			<td>to test pH of neutralized Fibricol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Plastipak 1mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z230723&#160;ALDRICH</td>
			<td>Alternative sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)</td>
			<td>Play-Doh</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris file converter</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>available at http://www.bitplane.com&#160;</td>
			<td>Convert imaging files to Imaris file format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>available at http://www.bitplane.com&#160;</td>
			<td>Analysis of 3D and 4D imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet microscopy for three-dimensional visualization of human immune cells

In Vivo, Aktivierung, Verbreitung und Funktion von Immunzellen, die alle auftreten in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung, z. B. in Lymphknoten oder Gewebe. Up to Date verlassen sich die meisten in-vitro- Systeme auf zweidimensionale (2D) Oberflächen, wie z. B. Zellkultur Platten oder Deckgläsern. Um optimal mimischen physiologischen Bedingungen in Vitroverwenden wir eine einfache 3D Kollagen-Matrix. Kollagen gehört zu den wichtigsten Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) und wurde häufig verwendet, um 3D Matrizen darstellen. Für 3D-Bildgebung, wird die neu entwickelte Licht-Blatt-Mikroskopie-Technik (auch bezeichnet als einziges Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie) mit hoher Geschwindigkeit, große Eindringtiefe, geringe Bleichen und Photozytotoxizität gekennzeichnet. Darüber hinaus ist Licht-Blatt Mikroskopie besonders vorteilhaft für Langzeitmessungen. Hier beschreiben wir einer optimierten Protokoll zum Einrichten und Verarbeiten von menschlichen Immunzellen, z.B. primären menschlichen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und natürlichen Killer (NK) Zellen in der 3D Kollagenmatrix für die Verwendung mit der Licht-Blatt-Mikroskopie für live Cell Imaging und feste Proben. Das Verfahren zur Bildaufnahme und Analyse der Zellwanderung werden vorgestellt. Ein besonderer Schwerpunkt ist gegeben, markieren Sie wichtige Schritte und Faktoren für die Probenvorbereitung und Analyse der Daten. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in einer 3D Kollagenmatrix eingesetzt werden und beschränkt sich nicht auf Immunzellen.

Protrusion Formation während der T-Zell-Migration ist ein sehr dynamischer Prozess, der Aktin angewiesen ist. Um Vorsprung Bildung der primären menschlichen CTL zu visualisieren, transfizierten wir vorübergehend ein mEGFP verschmolzen Protein Aktin-Zytoskeletts in CTL wie beschrieben vor11beschriften. Einen Tag nach Transfektion, wurden die Zellen in der Kollagenmatrix eingebettet. Bild-Stacks erworben wurden alle 40 s mit einer Schrittweite von 1 µm bei 37 ° ...

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Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

Licht-Blatt-Mikroskopie zur dreidimensionalen Visualisierung der menschlichen Immunzellen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um Immunzellen, eingebettet in eine dreidimensionale (3D) Kollagen-Matrix mit Licht-Blatt Mikroskopie zu visualisieren. Dieses Protokoll arbeitet auch wie Zellwanderung in 3D zu verfolgen. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in der 3D Matrix eingesetzt werden.

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Seven Steps to Stellate Cells

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

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Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

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Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie

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Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

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Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

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