Name: characterizing dna repair processes at transient and long-lasting double-strand dna breaks by immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2018-06-08T13:30:00
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우리는 조 엘 Sanneman와 박사 Philine Wangemann에 의해 캔자스 주립 대학 대학의 수의학,이 기술을 개발 하기 위해 노력에의 그들의 지원에 대 한 자금 Confocal 현미경 코어의 감사 합니다. pCBASceI 마리아 Jasin (Addgene 플라스 미드 # 26477)에서 선물 했다 30. U2OS 박사-GFP 셀 마리아 Jasin18종류 선물 했다.

제발 참고,이 프로토콜은 작성 된-SceI 인식 사이트18를 포함 하는 U2OS 세포. 셀은 U2OS 필요가 없습니다 하지만-SceI 사이트를 포함 해야 합니다. 프로토콜 조정 (예를 들어, 셀 시드 및 보육 시간) 되도록 할 수 있습니다 사용 하는 세포의 종류에 따라.
1. 정의 DSB 수리 복잡 한 대형의 활동
<ol><li>Confluent 85-90%까지 10cm 조직 문화 접시에 U20S DRGFP 세포를 성장 ...

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA.">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+repair+throughout+the+cell+cycle.">Regulation of DNA repair throughout the cell cycle.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li><li>Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+kinase+as+master+regulator+of+nucleotide+excision+repair+during+S+phase+of+the+cell+cycle.">ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle.</a> Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).</li><li>Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+and+ATR+signaling+at+a+glance.">ATM and ATR signaling at a glance.</a> J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).</li><li>Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+Pathway+Choices+and+Consequences+at+the+Double-Strand+Break.">Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break.</a> Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).</li><li>Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Playing+the+End+Game:+DNA+Double-Strand+Break+Repair+Pathway+Choice.">Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice.</a> Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+BRCA1,+and+the+Choice+between+Recombination+and+End+Joining+at+DNA+Double-Strand+Breaks.">53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks.</a> Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-Dependent+Induction+of+Homologous+Recombination+by+a+Tightly+Regulated+I-SceI+Fusion+Protein.">Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein.</a> PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).</li><li>Brandsma, I., Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+choice+in+DNA+double+strand+break+repair:+observations+of+a+balancing+act.">Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act.</a> Genome Integr. 3, 9 (2012).</li><li>Davis, A. J., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double+strand+break+repair+via+non-homologous+end-joining.">DNA double strand break repair via non-homologous end-joining.</a> Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).</li><li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair.">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).</li><li>Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+BRCA2,+and+Rad51+Operate+in+a+Common+DNA+Damage+Response+Pathway.">BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway.</a> Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).</li><li>D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1:+A+Missing+Link+in+the+Fanconi+Anemia/BRCA+Pathway.">BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway.</a> Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).</li><li>Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+BRCA1+and+BRCA2+and+associated+proteins+in+the+maintenance+of+genomic+stability.">The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability.</a> Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+DNA-PK,+ATM+and+ATR+in+RPA+phosphorylation+and+checkpoint+activation+in+response+to+replication+stress.">Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).</li><li>Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Risk+Alpha+Papillomavirus+Oncogenes+Impair+the+Homologous+Recombination+Pathway.">High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway.</a> J Virol. , (2017).</li><li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells.">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li><li>Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronuclei+in+genotoxicity+assessment:+from+genetics+to+epigenetics+and+beyond.">Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond.</a> Front Genet. 4, (2013).</li><li>Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+repair+of+DNA+damage+and+tumorigenesis:+the+BRCA+connection.">Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection.</a> Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+Disrupt+Homology+Dependent+Double+Strand+Break+Repair+by+Attenuating+BRCA1+and+BRCA2+Expression+and+Foci+Formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation.</a> PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+5+and+8+E6+Abrogate+ATR+Activity+Resulting+in+Increased+Persistence+of+UVB+Induced+DNA+Damage.">HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage.</a> PLoS Pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+&#947;H2AX+Foci+in+Response+to+Ionising+Radiation.">Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation.</a> J Vis Exp. (38), e1957 (2010).</li><li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Microscopy+of+&#947;H2AX+and+53BP1+for+Analyzing+the+Formation+and+Repair+of+DNA+Double-strand+Breaks.">Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks.</a> J Vis Exp. (129), e56617 (2017).</li><li>Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+Phosphorylates+Histone+H2AX+in+Response+to+DNA+Double-strand+Breaks.">ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks.</a> J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).</li><li>Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+high-resolution+imaging+of+Ku+foci+to+decipher+mechanisms+of+DNA+double-strand+break+repair.">A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair.</a> J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).</li><li>Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-BasI+and+I-HmuI:+two+phage+intron-encoded+endonucleases+with+homologous+DNA+recognition+sequences+but+distinct+DNA+specificities.">I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities.</a> J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nat Commun. 6, 10237 (2015).</li><li>Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+engineered+nicking+endonucleases--from+cleavage+mechanism+to+engineering+of+strand-specificity.">Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity.</a> Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).</li></ol>

DNA의 분석 손상 수리 일반적 이며 이중 가닥 DNA 틈의 수리 구체적으로 연구의 활성 영역 그 결과 기본적인 생물학6,20tumorigenesis 범위 때문에. 이 원고 세부 사항 정확 하 게 dissects 시간 기대,이 방법을 통해 DSBs 해상도 RAD51 및 γ-H2AX 단백질의 기여 하는 방식 명료 DSBs14수리 단백질의 추가 기능을 사용할 수 있습니다. 복구 활동의 비교와, ...

매일, 모든 세포는 인체에는 약된 10, 000으로 포 격 된다 DNA 장애1. 이 생존의 위협을 셀 뿐만 아니라 돌연변이, 발암에 대 한 위험에서 우리를 박 았 죽음. 게놈 충실도 보호 하기 위해 포유류 세포는 복잡 한 일련의 단백질 연결 및 수정 된 DNA 손상 응답 하 진화 했다. 이 응답은 여러 통로, DNA 손상 응답 (DDR)2,3로 총칭으로 구성 됩니다. DNA 병 변, 일시적으로 그리고 공간 조정에 DNA 수 선 단백질의 축적은 DDR에 의하여 이루어져 있다. DDR 자주 전파 또는 손상 된 DNA2,,45의 복제 하는 동안 발생할 수 있는 손상의 강화를 피하기 위해 세포 주기 검거를 유도 합니다. 차례 차례로, 그것은 또한 수리 완료 된 후 복구 단지를 분리 하 여 세포 주기 검거를 세포 생존에 필요한.
DNA 손상의 다양 한 종류 중에서 DSBs는 가장 해로운. DSBs 복구 실패 염색체 재배열 또는 전체 염색체 팔의 손실과 같은 대규모 삭제 될 수 있습니다. DSBs 수리 두 경로6,,78으로 분할 된다. 동종 재결합 (HR) 필요 자매 염색체 DNA 템플렛으로 사용 하 여 따라서 늦은 S와 G2/M 단계의 세포 주기9,10로 제한 됩니다. 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 이러한 제한에는 없습니다 하지만 DSBs11,12복구 때 작은 삭제를 발생할 수 있습니다.
DSB 특히 수리와 DDR 일반적 조사의 활성 영역이 있습니다. 편리 하 게 분리 된 경로에 조직 되 고에 불구 하 고 중복의 큰 거래가 이다. 실제로, 많은 단백질 (BRCA1, BRCA2, 그리고 예를 들어 복잡 한 RPA) 여러 경로13,14,,1516에서 포함 된다. 한 통로 의해 병 변의 수리는 다른 통로14에 의해 복구 해야 하는 중간 손상으로 이어질 수 있습니다. 필요한 시간의 정확한 금액에 대 한 올바른 위치에 올바른 단백질 보충의 그들의 복잡 한 작업을 함께 이러한 통로의 하나는 다중 계층 규제 프로세스를 필요 합니다.
최근 보고서는 수리 복잡 한 형성, 해상도 및 지역화 각각 별도로 수 장애인된17으로 DDR의 복잡 한을 강조 한다. 다음과 같은 프로토콜의 전반적인 목표는 DSB를 복구 하는 세포의 능력이 결정적으로 부. 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여, 손상의 사이트에서 수리 단백질의 축적 DSBs의 유도 따라 대표적인 시간 지점에서 구상 될 수 있다.
이 기술은 일반적으로 사용 되는 방법에 몇 가지 장점이 있습니다. 자주, 수리 한 번 포인트에서 조사 하 고 어셈블리의 동적 과정과 수리 단지의 분리를 나타내는 능력입니다. 전체 해상도로 초기 활성화에서 복구의 전체 범위를 관찰 하면 수리에서 지연 완전 한 금지로 오인 하지. 반대로, 그것은 했다 응답을 비활성화 수 있는 수리 응답의 감 응 작용 정상 또는 과도 한 정품 인증으로 오인 하지 보장 합니다.
그러나 지연된 단백질 복잡 한 형성 및 복구 단백질의 잘못 지역화, 수 없습니다 명확 하 게 구별 될이 방식으로. 확인 하려면 복구 단백질 대 잘못 지역화 된 그들의 지 방화에 지연, "오랫동안" DSB 세포질 DNA의 효소 분열을 통해 도입 수 있습니다. 결과 병 변 수리는, 뚜렷한 큰 핵 수리 초점 고 모집에서 시간 제한을 제거 때마다 recut 이다. 이 드문 절단 endonuclease (예를 들어, SceI) 오랫동안 DSB를 유발을 사용 하 여 기존 접근 방식을 수정 하 여 구현할 수 있습니다. DSBs의 장 수는 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 애매 수리 단백질의 시각화 수 있습니다. 또한 향상 된 풍부는 탐지 항 체 품질, 덜 공부 단백질 DNA 복구에 영향을 미치고로 식별 하는 경우 도움이 될 수 있는 기능에에서 제한에 의해 방해 된다 때 시각화를 향상 수 있습니다.
특히, 우리는 무료 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)에 대 한 명시적인 지침을 제공합니다. 이미지 분석, DNA 손상 복구를 심문을 열고 주요 금융 장벽을 제거 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12mm Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P96-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AX Alexa488</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>05-636-AF488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rad51 (D4B10)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8875S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-formats plugin for ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI Expression Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish- Insta Dri</td>
			<td>Sally and Hansen</td>
			<td>Clearly Quick (103)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing dna repair processes at transient and long-lasting double-strand dna breaks by immunofluorescence microscopy

더블-좌초 틈 (DSBs) DNA의 복구는 매우 조정된 과정, 형성 및 다중 단백질 수리 단지의 해상도 필요로. 이 프로세스는 협회를 홍보 하는 단백질의 무수 한와이 병 변이 단백질의 분열에 의해 통제 된다. 단백질의 광대 한 도서관의 기능 화면 수행 하는 능력에 큰 부분에 감사 합니다, 이중 가닥 DNA 틈 수리에 필요한 유전자의 큰 감사 이다. 종종 녹아웃 또는 화학 억제 물 스크린 DSB 수리에 필요한 단백질에 대 한 표식으로 증가 독성을 사용 하 여 복구 프로세스에 관련 된 단백질을 식별 합니다. 하지만 게놈 충실도 유지에 관련 된 식별 소설 세포질 단백질에 대 한 유용한 기능 분석 관심사의 단백질 지역화, 형성, 또는 수리 복합물의 해결책을 촉진 하는 여부의 결정을 필요로 합니다.
수리 단백질의 축적 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 고유 핵 foci로 쉽게 감지 수 있습니다. 따라서, 협회 및 DNA 손상의 사이트에이 단백질의 분열 이중 가닥 DNA 틈의 유도 후 이러한 핵 foci 대표 간격으로 관찰 하 여 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 또한 수리 결함 수리에서 불완전 지연으로 동시에 발생 하지 않습니다 경우 잘못 지역화 된 복구 요소 단백질를 식별할 수 있습니다. 이 시나리오에서는 긴-지속 이중 가닥 DNA 휴식 했다 효소에 대 한 인식 사이트 세포 게놈으로 통합 되어 셀에 드문 절단 endonuclease (예를 들어, SceI)으로 표현 하 여 설계 수 있다. 결과 병 변 특히 충실 한 수리 효소의 인식 사이트, 분열의 또 다른 라운드를 메시지를 다시 것입니다 해결 하기 어렵다. 그 결과, 수리의 속도에 차이 제거 됩니다. 수리 단지 형성 하지는 경우 지역화 장애가 되어 있다. 이 프로토콜 수리 단백질 지 방화 뿐만 아니라 복구 속도 론 변경 내용을 식별 하는 데 필요한 방법론을 설명 합니다.

그림 1 은 맥시 마/foci 정량화 ImageJ를 사용 하 여에 대 한 올바른 잡음 차별의 선택을 묘사 한다. DAPI의 병합 된 이미지 및 복구 단백질의 왼쪽된 패널에 있습니다. 그림 1A 90의 잡음 차별 보여준다 고 foci의 정확한 수를 표시 합니다. 핵 가장자리 (분홍색 화살표 표시)와 포커스 (노란색 화살표가 그려져) 핵 외부에 정량화 하는 동?...

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Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

소변 샘플에서 셀 무료 DNA 무결성 분석

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

연구

암 연구학

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...