Name: characterizing dna repair processes at transient and long-lasting double-strand dna breaks by immunofluorescence microscopy
Uploaded: 2018-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Vi takker Joel Sanneman og Dr. Philine Wangemann av AC Confocal mikroskopi kjernen, finansiert av den Kansas State University universitet av Veterinary medisin, for deres støtte til innsatsen for å utvikle denne teknikken. pCBASceI var en gave fra Maria Jasin (Addgene plasmider # 26477) 30. U2OS DR-GFP celler var en slags gave Maria Jasin18.

Vær oppmerksom på at denne protokollen er skrevet for U2OS celler med en-SceI anerkjennelse området18. Cellene trenger ikke være U2OS men må inneholde-SceI området. Protokollen må være justert (f.eksantall celler seeded og inkubasjon ganger) avhengig av celler som brukes.
1. definere Kinetics DSB reparasjon komplekse formasjonen
<ol><li>Vokse U20S-DRGFP celler i en 10 cm vev kultur plate til 85-90% confluent.</li>
	<li>Fjern media og ruge ved romtempe...

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA.">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DNA+repair+throughout+the+cell+cycle.">Regulation of DNA repair throughout the cell cycle.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li><li>Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+kinase+as+master+regulator+of+nucleotide+excision+repair+during+S+phase+of+the+cell+cycle.">ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle.</a> Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).</li><li>Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+and+ATR+signaling+at+a+glance.">ATM and ATR signaling at a glance.</a> J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).</li><li>Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+Pathway+Choices+and+Consequences+at+the+Double-Strand+Break.">Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break.</a> Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).</li><li>Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Playing+the+End+Game:+DNA+Double-Strand+Break+Repair+Pathway+Choice.">Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice.</a> Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).</li><li>Daley, J. M., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+BRCA1,+and+the+Choice+between+Recombination+and+End+Joining+at+DNA+Double-Strand+Breaks.">53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks.</a> Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li><li>Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Cycle-Dependent+Induction+of+Homologous+Recombination+by+a+Tightly+Regulated+I-SceI+Fusion+Protein.">Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein.</a> PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).</li><li>Brandsma, I., Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+choice+in+DNA+double+strand+break+repair:+observations+of+a+balancing+act.">Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act.</a> Genome Integr. 3, 9 (2012).</li><li>Davis, A. J., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double+strand+break+repair+via+non-homologous+end-joining.">DNA double strand break repair via non-homologous end-joining.</a> Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).</li><li>Reid, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+dynamics+of+the+nonhomologous+end-joining+machinery+during+DNA+double-strand+break+repair.">Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).</li><li>Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1,+BRCA2,+and+Rad51+Operate+in+a+Common+DNA+Damage+Response+Pathway.">BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway.</a> Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).</li><li>D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1:+A+Missing+Link+in+the+Fanconi+Anemia/BRCA+Pathway.">BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway.</a> Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).</li><li>Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+BRCA1+and+BRCA2+and+associated+proteins+in+the+maintenance+of+genomic+stability.">The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability.</a> Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+DNA-PK,+ATM+and+ATR+in+RPA+phosphorylation+and+checkpoint+activation+in+response+to+replication+stress.">Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).</li><li>Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Risk+Alpha+Papillomavirus+Oncogenes+Impair+the+Homologous+Recombination+Pathway.">High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway.</a> J Virol. , (2017).</li><li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells.">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li><li>Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronuclei+in+genotoxicity+assessment:+from+genetics+to+epigenetics+and+beyond.">Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond.</a> Front Genet. 4, (2013).</li><li>Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+repair+of+DNA+damage+and+tumorigenesis:+the+BRCA+connection.">Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection.</a> Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-HPV+5+and+8+E6+Disrupt+Homology+Dependent+Double+Strand+Break+Repair+by+Attenuating+BRCA1+and+BRCA2+Expression+and+Foci+Formation.">&#946;-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation.</a> PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).</li><li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPV+5+and+8+E6+Abrogate+ATR+Activity+Resulting+in+Increased+Persistence+of+UVB+Induced+DNA+Damage.">HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage.</a> PLoS Pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+&#947;H2AX+Foci+in+Response+to+Ionising+Radiation.">Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation.</a> J Vis Exp. (38), e1957 (2010).</li><li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Microscopy+of+&#947;H2AX+and+53BP1+for+Analyzing+the+Formation+and+Repair+of+DNA+Double-strand+Breaks.">Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks.</a> J Vis Exp. (129), e56617 (2017).</li><li>Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+Phosphorylates+Histone+H2AX+in+Response+to+DNA+Double-strand+Breaks.">ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks.</a> J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).</li><li>Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+high-resolution+imaging+of+Ku+foci+to+decipher+mechanisms+of+DNA+double-strand+break+repair.">A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair.</a> J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).</li><li>Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-BasI+and+I-HmuI:+two+phage+intron-encoded+endonucleases+with+homologous+DNA+recognition+sequences+but+distinct+DNA+specificities.">I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities.</a> J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nat Commun. 6, 10237 (2015).</li><li>Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+engineered+nicking+endonucleases--from+cleavage+mechanism+to+engineering+of+strand-specificity.">Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity.</a> Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).</li></ol>

Analyse av DNA skade reparasjon generelt og reparasjon av double-strandet DNA bryter er spesielt et aktivt område av forskning fordi dens konsekvenser span tumorigenesis til grunnleggende biologi6,20. Dette manuskriptet detaljer en tilnærming som nøyaktig dissekerer bidrag av RAD51 og den ble-H2AX proteiner til løsning av DSBs gjennom HR. gleder, denne metoden kan brukes til å belyse tilleggsfunksjoner reparasjon proteiner DSBs14. Sam...

Hver dag, hver eneste celle i kroppen er bombardert med en anslagsvis 10.000 DNA lesjoner1. Denne eksistensiell trussel setter oss i fare for mutasjoner, oncogenesis samt celle død. For å beskytte genomet gjengivelse, pattedyrceller utviklet seg for å svare på DNA skade med en kompleks serie av protein foreninger og modifikasjoner. Dette svaret er organisert i flere veier, kollektivt kjent som DNA skade svar (DDR)2,3. DDR består av akkumulering av DNA reparasjon proteiner på DNA lesjoner, koordinert både timelig og romlig. DDR induserer ofte celle syklus arrestasjon å unngå overføring eller intensivering av skader som kan oppstå under replikering av skadet DNA2,4,5. Igjen, er det også nødvendig for mobilnettet levedyktigheten til deaktivere celle syklus arrestasjon ved å oppheve tilknytning av reparasjon komplekser etter reparasjon er fullført.
Blant de ulike typene DNA skade er DSBs den mest skadelige. Unnlatelse av å reparere DSBs kan medføre kromosom rearrangements eller store slettinger slik som tap av hele kromosom våpen. Reparasjon av DSBs er delt i to veier6,7,8. Homologe rekombinasjon (HR) krever en søster kromosom bruke som DNA mal og dermed er begrenset til sene S og G2/M faser av cellen syklus9,10. Non-homologe slutten med (NHEJ) har ikke disse restriksjonene, men kan forårsake små slettinger når du reparerer DSBs11,12.
DSB reparere spesielt og DDR er generelt aktive områder for undersøkelse. Til tross for organisert i beleilig atskilt veier, er det mye redundans. Faktisk er mange proteiner (BRCA1, BRCA2 og RPA komplekse for eksempel) involvert i flere veier13,14,15,16. Reparasjon av en leksjonen av en sti, kan føre til en skade mellomliggende som må repareres av en annen sti14. Intertwining av disse veiene, kombinert med deres komplekse oppgaven med å rekruttere høyre proteiner til riktig sted for den nøyaktige mengden tid nødvendig krever en fleretasjes regulatoriske prosessen.
En fersk rapport Høydepunkter vanskelighetene med DDR ved å demonstrere at reparasjon komplekse formasjon, oppløsning og lokalisering hver separat kan nedsatt17. Det overordnede målet med følgende protokollen er å dissekere definitivt evne til celler å reparere DSB. Bruker immunofluorescence mikroskopi, kan akkumulering av reparasjon proteiner ved skade visualiseres på representant tid points etter induksjon av DSBs.
Denne teknikken har flere fordeler til brukte tilnærminger. Ofte er reparasjon undersøkt på ett tidspunkt og stand til dynamisk prosess av forsamlingen og av reparasjon komplekser. Observere hele spekteret av reparasjon av første aktivering i full oppløsning sikrer at en forsinkelse i reparasjon ikke er feilidentifisert som fullstendig hemming. Omvendt, sikrer at induksjon av en reparasjon svar som ikke kan deaktivere sa svar ikke er feilidentifisert som normal eller overdreven aktivering.
Forsinket protein kompleks dannelse og MIS-lokalisering av reparasjon proteiner, men kan ikke entydig skilles med denne tilnærmingen. For å avgjøre hvis reparasjon proteiner er mis lokaliserte versus forsinket i deres lokalisering, kan et "langvarig" DSB bli introdusert gjennom enzymatisk spalting av mobilnettet DNA. Den resulterende lesjonen er snitte hver gang det er reparert, noe som resulterer i forskjellige store kjernefysiske reparasjon fokus og fjerne timelige begrensning fra rekruttering. Dette kan oppnås ved å endre den eksisterende tilnærmingen med bruk av en sjelden kutte endonuclease (f.eks, SceI) å indusere en langvarig DSB. Levetiden til DSBs muliggjør visualisering av unnvikende reparasjon proteiner ved immunofluorescence mikroskopi. Forbedret overflod kan også forbedre effekten når gjenkjenning hindret av begrensning i antistoff kvaliteten, en funksjon som kan være nyttig når mindre studert proteiner er identifisert som har innvirkning på DNA-reparasjon.
Spesielt gi vi klare instrukser for en gratis bilde behandling og analyse programvare (f.eksImageJ). Dette fjerner en stor økonomisk barriere i bildeanalyse, åpne avhør av DNA skade reparasjon for et bredere publikum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12mm Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom plate</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P96-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-H2AX Alexa488</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>05-636-AF488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rad51 (D4B10)&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>8875S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-formats plugin for ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;A-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>216763-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I-SceI Expression Vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>26477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish- Insta Dri</td>
			<td>Sally and Hansen</td>
			<td>Clearly Quick (103)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboFect Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing dna repair processes at transient and long-lasting double-strand dna breaks by immunofluorescence microscopy

Reparasjon av double-strandet bryter (DSBs) i DNA er en svært koordinert prosess, nødvendiggjør dannelse og oppløsning av flere protein reparasjon komplekser. Denne prosessen er regulert av en myriade av proteiner som fremmer foreningen og tilknytningene til proteiner til disse lesjoner. Takk inne stor del å utføre funksjonelle skjermer av et stort bibliotek med proteiner, det er en større forståelse av genene nødvendig for dobbel-strand DNA pause reparasjon. Ofte knockout eller kjemiske hemmer skjermer identifisere proteiner involvert i reparasjon prosesser ved hjelp av økt toksisitet som en markør for et protein som er nødvendig for DSB reparasjon. Men nyttig for identifisere romanen mobilnettet proteiner involvert i vedlikehold genomet gjengivelse, krever funksjonsanalyse fastsettelse av om protein rundt fremmer lokalisering, formasjon eller oppløsning av reparasjon komplekser.
Akkumulering av reparasjon proteiner kan lett oppdaget som tydelig kjernefysiske foci av immunofluorescence mikroskopi. Dermed kan association og tilknytningene til disse proteinene på steder av DNA skade nås ved å observere disse kjernefysiske foci representant mellomrom etter induksjon av dobbel-strand DNA bryter. Denne tilnærmingen kan også identifisere mis lokaliserte reparasjon faktor proteiner, hvis reparer feil ikke forekommer samtidig med ufullstendig forsinkelser i reparasjon. I dette scenariet, kan lang-varer dobbel-strand DNA bryter bli konstruert ved å uttrykke en sjelden kutte endonuclease (f.eks, SceI) i celler der webområdet anerkjennelse for sa enzymet er blitt integrert i mobilnettet genomet. Den resulterende lesjonen er spesielt vanskelig å løse som trofast reparasjon vil gjeninnføre enzymets anerkjennelse webområdet, å spørre en annen runde cleavage. Som et resultat, elimineres forskjeller i the kinetics av reparasjon. Hvis reparer komplekser ikke er dannet, har lokalisering blitt hindret. Denne protokollen beskriver metodene må identifisere endringer i reparasjon kinetics samt reparasjon protein lokalisering.

Figur 1 viser valg av riktig diskriminering for maxima/foci kvantifisering bruker ImageJ. Flettede bilder av DAPI og reparasjon protein av interesse er på venstre side. Figur 1A viser en støy diskriminering av 90 og markerer riktig antall foci. Kjerner på kanten (avbildet med en rosa pilen) og foci utenfor kjerner (avbildet med en gul pil) telles ikke under kvantifiseringen. Figur 1B viser en lav ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy at JoVE.com

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Reparasjon av dobbel-strand DNA bryter er en dynamisk prosess, krever ikke bare dannelsen av reparasjon komplekser pauser, men også deres oppløsning etter lesjonen er adressert. Her, bruker vi immunofluorescence mikroskopi forbigående og langvarig double-strandet pausene som et verktøy for å analysere denne genomet vedlikehold mekanismen.

Karakterisere DNA reparasjon prosesser på forbigående og lang-varer dobbel-strand DNA bryter av Immunofluorescence mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Cell-Free DNA Integrity Analysis i Urinprøver

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Bruk av Laser mikro-bestråling for undersøkelse av enkelt og dobbelt Strand pause reparasjon i pattedyrceller

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluere In Vitro DNA skade bruk av Comet analysen

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence mikroskopi γH2AX og 53BP1 for å analysere dannelse og reparasjon av DNA dobbel-strand bryter

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakteristikk av tumorceller bruke en medisinsk ledning for å fange sirkulerende kreftceller: en 3D tilnærming basert på Immunofluorescence og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Evaluering av kolorektal kreftrisiko og prevalens ved deteksjon av avføring DNA-integritet

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Påvisning og overvåking av tumor assosiert sirkulerende DNA i pasient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Avbildning av DNA-skade og reparasjon av foci i humane tykktarmskreftceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Påvisning av cellefritt DNA i blodplasmaprøver av kreftpasienter

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...