Name: protocol to create chronic wounds in diabetic mice
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00
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作者没有承认。

所有实验均按照联邦法规完成，加州大学加州大学河滨分校IACUC批准了相关政策和程序。
1. 动物
<ol><li>使用糖尿病和肥胖的B6。BKS（D）-用于慢性伤口模型的Leprdb/J小鼠。购买选项包括用于繁殖的异质动物或直接用于实验的同源物。</li>
	<li>繁殖异质动物雄性和雌性，以产生后代。统计上，只有四分之一的垃圾会长成糖尿病和肥胖症（db/db-/-）。</...

一旦在小鼠身上形成慢性伤口，该模型可用于研究慢性开始过程中受损的伤口愈合过程。该模型还可用于测试各种化学品和药物的疗效，这些化学物质和药物可以逆转慢性伤口发育和受损愈合，并导致伤口闭合和愈合。可以研究慢性发病后的不同时间点：例如，在慢性早期发病后受伤的第1-5天，以及20天及以后的全身性慢性伤口。
慢性伤口模型也是研究伤口愈合和并发...

伤口愈合涉及复杂的细胞和分子过程，这些过程在时间和空间上受到调节，在顺序和重叠阶段组织，涉及许多不同的细胞类型，包括但不限于免疫反应和血管系统1.皮肤受伤后，因子和血细胞立即聚集到伤口部位，并启动凝血级联形成血块。平衡后，血管分裂，让进入伤口部位的氧气、营养物质、酶、抗体和化学因子，使多态细胞清除伤口床的异物碎片，并分泌蛋白解酶2.激活的血小板分泌各种生长因子，以刺激伤口边缘的角蛋白细胞，使受伤区域重新上皮。被招募到伤口部位的单核细胞分化成巨噬细胞，其中噬菌体和死中性粒细胞和分泌其他因素，以保持角蛋白细胞增殖和亲迁移信号。在增殖阶段，在继续再上皮化的同时，由成纤维细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞组成的新的造粒组织继续重建过程2。血管生成通过促进内皮细胞增殖和迁移来刺激，导致新的血管发育。细胞外基质的分体化和改造为环境设置了屏障。当伤口愈合和造粒组织演变为疤痕时，凋亡可消除炎症细胞、成纤维细胞和内皮细胞，而不会造成额外的组织损伤。成纤维细胞重塑细胞外基质的各种成分（如胶原蛋白）增强了组织的拉伸强度，使新形成的组织几乎与未受伤的皮肤2一样强壮和灵活。
任何偏离这种高度协调的进展到伤口关闭导致受损和/或慢性伤口3。慢性伤口的特点是氧化应激增加，慢性炎症，微血管受损，伤口中胶原蛋白基质异常。氧化应激，特别是在伤口，可以延迟伤口封闭2，5。当伤口愈合的第一阶段，炎症阶段变得不受管制时，宿主组织由于炎症细胞5的不断涌入而承担广泛的损害，释放细胞毒性酶，自由氧基增加，以及不受监管的炎症介质，导致细胞死亡6，7。
在这个破坏性的微环境中，生物膜形成细菌利用宿主营养物质，导致宿主组织2的损害。这些生物膜难以控制和去除，因为由蛋白质、DNA、RNA 和多糖组成的水合物细胞外聚合物物质使体内的细菌能够对传统抗生素疗法具有耐受性，并避开宿主的先天和适应性免疫反应2，8，9。
研究慢性伤口至关重要，因为它们影响650万人，仅在美国每年就花费400亿美元。糖尿病患者增加了患慢性伤口的风险，需要截肢以遏制感染的传播。这些患者在截肢后5年内有50%的死亡风险，这归因于糖尿病11的病理生理学机制。宿主的免疫系统和伤口愈合中的微生物群之间的关系是正在进行的研究的一个重要课题，因为慢性伤口的后果，如果得不到解决，包括截肢和死亡12。
尽管在了解慢性伤口如何发展人类方面已经投入了大量精力，但慢性伤口是如何形成的，为什么形成，目前还不清楚。研究受损愈合机制的实验很难在人类身上进行，伤口愈合专家只能看到慢性伤口患者已经达到慢性数周到数月。因此，专家无法研究哪些过程出错，导致伤口发展成慢性2。缺乏能够概括人类慢性创伤复杂性的动物模型。直到我们的模型被开发，没有慢性伤口研究模型存在。
慢性伤口模型是在瘦素受体（db/db-/--）13中发生突变的小鼠身上开发的。这些小鼠肥胖，糖尿病，有损伤愈合，但不开发慢性伤口14。血糖水平平均在200毫克/分升左右，但可以高达400毫克/分升15。当伤口组织中高水平的氧化应激（OS）在伤伤后立即诱发时，伤口就变成慢性16。db/db-/-伤口在20天内被认为是慢性的，并且保持开放60天或更长时间。细菌产生的生物膜在伤人后三天开始发育;成熟的生物膜在伤后20天可见，并持续到伤口关闭。我们在这些小鼠中发现的生物膜形成细菌也存在于人类糖尿病慢性伤口中。
氧化应激是通过两种抗氧化酶抑制剂，即催化酶和谷胱甘肽过氧化物酶来治疗伤口，这两种酶具有分解过氧化氢的能力。过氧化氢是一种活性氧，通过蛋白质、脂质和DNA的氧化会导致细胞损伤。催化过氧化氢分解成危害较少的化学物质氧和水。3-Amino-1，2，4-triazole （ATZ） 通过专门和共价地结合酶的活性中心来抑制催化酶，使其17、18、19起灭活。ATZ一直被用来研究氧化应激在体外和体内通过抑制催化酶20，21，22，23，24的影响。谷胱甘肽过氧化物酶通过抗氧化剂谷胱甘肽催化过氧化氢的减少，是保护细胞免受氧化应激的重要酶25。Mercaptosuccinic酸（MSA）通过与酸醇酶的selenocystein活性位点结合来抑制谷胱甘肽过氧化物酶，使其26日失活。MSA已用于研究氧化应激在体外和体内以及20，27，28的影响。
这种新型慢性伤口模型是一个强大的研究模型，因为它与人类糖尿病慢性伤口观察到的许多相同特征相同，包括由于OS增加引起的长期炎症和皮肤微生物群形成的天然生物膜。伤口有损皮肤-表皮相互作用，异常基质沉积，血管生成不良和血管受损。雄性小鼠和雌性小鼠都会出现慢性伤口，因此两性都可用于研究慢性伤口。因此，慢性伤口模型可以大大有助于促进对此类伤口如何开始的基本理解。使用这种慢性伤口模型可以回答有关如何通过受损伤口愈合的生理学和宿主的微生物群的贡献来启动/实现慢性的基本问题。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:795px;" width="794">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">B6.BKS(D)-Leprdb/J&#160;</td>
			<td style="width:176px;">The Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:107px;">00697</td>
			<td style="width:204px;">Homozygotes and heterozygotes available&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin</td>
			<td style="width:176px;">Nair</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">a chemical depilatory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Buprenex (buprenorphine HCl)</td>
			<td style="width:176px;">Henry Stein Animal Health</td>
			<td style="width:107px;">059122</td>
			<td style="width:204px;">0.3 mg/ml, Class 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)</td>
			<td style="width:176px;">TCI</td>
			<td style="width:107px;">A0432</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mercaptosuccinic acid (MSA)</td>
			<td style="width:176px;">Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">88460</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">autoclave steriled</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:176px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:107px;">029405</td>
			<td style="width:204px;">NDC 11695-6776-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Oxygen</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">Tank must be compatible with vaporizing system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Isoflurane vaporizer</td>
			<td style="width:176px;">JA Baulch &#38; Associates&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Wahl hair clipper</td>
			<td style="width:176px;">Wahl</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">Lithium Ion Pro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Acu Punch 7mm skin biopsy punches</td>
			<td style="width:176px;">Acuderm Inc.</td>
			<td style="width:107px;">P750</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Tegaderm&#160;</td>
			<td style="width:176px;">3M</td>
			<td style="width:107px;">Ref: 1624W</td>
			<td style="width:204px;">Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Heating pad</td>
			<td style="width:176px;">Conair</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">Moist Dry Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:176px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">329461</td>
			<td style="width:204px;">0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Tweezers</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sharp surgical scissors</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Thin metal spatula</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Tubing</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mouse nose cone</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Gloves</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">small plastic containers</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol to create chronic wounds in diabetic mice

慢性伤口的发展，由于在一个或多个复杂的细胞和分子过程中涉及适当的愈合有缺陷的调节。仅在美国，它们就影响 650 万人，每年成本为 400 亿英镑。尽管在了解慢性伤口如何发展人类方面已经投入了大量精力，但基本问题仍未得到解答。最近，我们开发了一种新的小鼠模型，用于具有许多人类慢性伤口特征的糖尿病慢性伤口。使用db/db-/-小鼠，我们可以在伤人后立即在伤口组织中诱导高水平的氧化应激（OS），使用与抗氧化酶催化酶特有的抑制剂的一次性治疗，从而产生慢性伤口。谷胱甘肽过氧化物酶。这些伤口具有高水平的操作系统，自然发展生物膜，在治疗后20天内完全慢性，可以保持开放超过60天。这种新颖的模型具有人类糖尿病慢性伤口的许多特征，因此可以大大有助于促进对伤口如何成为慢性的基本理解。这是一个重大突破，因为人类慢性伤口给患者带来严重的疼痛和痛苦，如果得不到解决，则导致截肢。此外，这些伤口非常昂贵和费时治疗，并导致患者个人收入重大损失。通过使用我们的慢性伤口模型，这一研究领域的进步可以显著改善数百万在这种衰弱条件下受苦的人的医疗保健。在这个协议中，我们非常详细地描述了导致急性伤口成为慢性伤口的程序，这是以前没有做过的。

图5描述了一个伤口的例子，即没有治疗抑制剂进入伤口闭合状态，而治疗抑制剂的伤口则走向慢性。透明敷料留在慢性伤口上，以便可以看到生物膜和液体积累。
慢性伤口启动发生在不到6小时，伤口边缘明显改变从氧化应激。这种伤口边缘的组织学证据表明，组织是坏死的，不会参与伤口愈合。伤口中...

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Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

慢性伤口是从糖尿病小鼠模型上的急性伤口发展，通过在全厚皮伤后诱导高水平的氧化应激。伤口用催化酶和谷胱甘肽过氧化物酶抑制剂进行治疗，导致皮肤微生物群中细菌的愈合和生物膜发育受损。

在糖尿病小鼠中创建慢性伤口的协议

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

这种小鼠模型可以帮助回答伤口慢性医学领域的问题。这个模型的主要优点是，小鼠的慢性伤口模仿人类慢性伤口的许多方面。首先，将鼠标放在干净的表面上，然后通过捏住其尾部的底座将其固定到位。然后准备剪发器，并准备快速拉开它们，如果鼠标做任何突然的动作。剃整个背部从脖子到尾巴，包括所有在尾巴周围。轻轻运行刀片对头发生长的方向，以最有效的切割。不要将剪子压入皮肤深处，因为这可能擦伤或割伤。接下来，为应用脱毛化妆水。用水浸纸巾润湿皮肤，防止化学灼伤。轻轻按压，用足够的压力将剪下来的头发弄湿在皮肤上。然后，当皮肤湿润时，将一小块脱毛化妆水到剃光区域 15 到 20 秒。应用后，让化妆水皮肤反应20至45秒。在冲洗化妆水之前，轻轻擦去化妆水位置的一些检查反应。如果皮肤是粉红色和无毛的，反应是完整的。然后，抓住鼠标洗掉它。用非多管用的手用拇指向下按其尾巴的底座对手掌，并关闭其他手指。然后用老鼠的鼻子向上和远离水，让水流过动物的背部。然后迅速，但轻轻地，用另一只手揉鼠标的背面，洗去化妆水。取出所有脱毛霜后，用纸巾擦干皮肤。重要的是不要将化妆水应用于耳朵、尾巴或脸部附近的任何地方。如果发生这种情况，请立即用湿毛巾化妆水擦拭，然后将水流过鼠标，以防止损坏这些区域。如果使用奶油后发现任何深色斑块，请将面霜重新应用到这些区域。在整个实验过程中，皮肤的深色斑块会长得更快。因此，必要时每三到五天剪一次头发。一两个不在伤口场的补丁是可以接受的，但如果鼠标的背面有更多的暗斑，不要使用它作为慢性伤口模型。去除头发后，将鼠标单独放在一天内，然后受伤，因为皮肤会太敏感，从脱毛化妆水。手术前30分钟，在无菌PBS中注射120微升丁丙诺啡。此过程的所有卷都假定为 60 克鼠标。手术前20分钟，在无菌PBS中用480微升的 ATZ 微升注射。分割腹部两侧的体积。管理 ATZ 后，将鼠标放在加热垫顶部的小塑料容器中，直到手术开始。用纸巾盖住小容器，以帮助控制热量。老鼠在温暖时应该冷静下来。确认麻醉状态后，继续受伤。要开始伤害程序，用 70% 乙醇喷洒化学擦拭，以擦拭鼠标的背部以清洁伤口位点和皮肤表面。不要过度擦拭，否则会有杀死皮肤上存在的细菌的风险。慢性伤口模型的成功依赖于非无菌条件。这些老鼠不是无细菌的，它们被安置在传统的维他体内。存在于皮肤上的细菌微生物群对于在抗氧化酶抑制剂治疗后开始和发育慢性伤口至关重要。现在想想伤口的位置。理想情况下，使用鼠标的后侧居中，远离皮肤的暗斑。现在，在 30 到 45 秒内执行修整程序。首先轻轻按压七毫米皮肤活检冲孔到所需的伤口位点，并扭转冲孔周围只是足够深，留下的印象是冲孔。然后，用钳子拉起冲孔的中心，用手术剪刀沿着轮廓切割，以切除轮廓的皮肤。完成后，用半块透明薄膜敷料牢牢盖住伤口。在受伤后10分钟内，在无菌PBS中涂抹60微升的MSA等分，将 MSA 顶点沉积在伤口上。手术后6小时后，再给丁丙诺啡施用。可根据需要给予额外的剂量。慢性伤口启动发生在不到六个小时，伤口边缘明显改变从氧化应激。慢性伤口是保持开放的伤口，与最初的伤口相比扩大，并含有生物膜。20天后，伤口完全慢性。控制伤口地点的生物膜形成细菌包括伪多莫纳斯白化病、肠杆菌以及各种葡萄球菌和皮质细菌。这些细菌也存在于人类慢性伤口中。看完这段视频后，你应该对如何在小鼠中制造慢性伤口有一个很好的理解。一旦你建立了这些慢性伤口，然后你可以使用它们来调查许多细胞分子机制涉及启动伤口慢性。

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