Name: protocol to create chronic wounds in diabetic mice
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00
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Gli autori non hanno riconoscimenti.

Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità e il rispetto delle normative federali e la politica e le procedure dell'Università della California sono state approvate dall'Università della California, Riverside IACUC.
1. Animale
<ol><li>Utilizzare diabetico e obesi B6. BKS(D)-Mouse Leprdb/J per il modello di ferita cronica. Le opzioni di acquisto includono eterozigoti per l'allevamento o omozigoti direttamente per esperimenti.</li>
	<li>Alleva maschi e don...

Una volta che le ferite croniche vengono create sui topi, il modello può essere utilizzato per studiare i processi di guarigione delle ferite alterate coinvolti nell'avvio della cronicità. Il modello può anche essere utilizzato per testare l'efficacia di una vasta gamma di sostanze chimiche e farmaci che possono invertire lo sviluppo cronico delle ferite e la guarigione compromessa e portare alla chiusura e alla guarigione delle ferite. È possibile studiare diversi punti temporali dopo l'inizio della cronicità: ...

La guarigione delle ferite comporta complessi processi cellulari e molecolari regolati temporalmente e spazialmente, organizzati in fasi sequenziali e sovrapposte che coinvolgono molti tipi di cellule diverse, tra cui, ma non solo, alla risposta immunitaria e alla vascolare sistema1. Immediatamente dopo che la pelle subisce una lesione, fattori e cellule del sangue si aggregano al sito della ferita e avviano la cascata di coagulazione per formare un coagulo. Dopo l'omeostasi raggiunta, i vasi sanguigni si dilatano per far entrare nel sito della ferita ossigeno, sostanze nutritiche, enzimi, anticorpi e fattori chemiotattici che chemoattrale polimorfonucleociti per eliminare il letto della ferita da detriti estranei e enzimi proteolitici secerneri 2. Le piastrine attivate secernono una varietà di fattori di crescita per stimolare i cheratinociti sul bordo della ferita per epitecarizzare nuovamente l'area ferita. I monociti reclutati nel sito della ferita si differenziano in macrofagi che fagocitosi batteri e neutrofili morti e secernono ulteriori fattori per mantenere i segnali cheratinociti proliferanti e pro-migranti. Nella fase di proliferazione, mentre la riepitelializzazione continua, nuovo tessuto di granulazione composto da fibroblasti, monociti/macrofagi, linfociti e cellule endoteliali continua il processo di ricostruzione2. L'angiogenesi viene stimolata promuovendo la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali, con conseguente sviluppo di nuovi vasi. L'epitelizzazione e il rimodellamento della matrice extracellulare costruiscono una barriera contro l'ambiente. Come la ferita guarisce e tessuto di granulazione si evolve in una cicatrice, l'apoptosi elimina le cellule infiammatorie, fibroblasti, e le cellule endoteliali senza causare ulteriori danni ai tessuti. La resistenza alla tensione del tessuto è esaltata dai fibroblasti che rimodellano vari componenti della matrice extracellulare, come il collagene, in modo che il tessuto appena formato sia quasi forte e flessibile come la pelle non leato2.
Qualsiasi deviazione da questa progressione altamente concertata verso la chiusura delle ferite porta a ferite alterate e/o croniche3. Le ferite croniche sono caratterizzate da un aumento dello stress ossidativo, infiammazione cronica, microvascolatura danneggiata e matrice anormale del collagene nella ferita4. Lo stress ossidativo, soprattutto nella ferita, può ritardare la chiusura della ferita2,5. Quando, nella prima fase di guarigione delle ferite, la fase infiammatoria diventa non regolamentata, il tessuto ospite assume danni estesi a causa di un afflusso continuo di cellule infiammatorie5 che rilasciano enzimi citotossici, un aumento dei radicali liberi di ossigeno, e mediatori infiammatori non regolamentati, con conseguente morte cellulare6,7.
In questo microambiente distruttivo, i batteri che formano biofilm sfruttano i nutrienti dell'ospite e contribuiscono al danno del tessuto ospite2. Questi biofilm sono difficili da controllare e rimuovere perché le sostanze polimeriche extracellulari idratate composte da proteine, DNA, RNA e polisaccaridi consentono ai batteri ospitati all'interno di essere tolleranti alle terapie antibiotiche convenzionali ed eludere il risposta immunitaria innata e adattativa dell'ospite2,8,9.
Studiare le ferite croniche è fondamentale perché hanno un impatto su 6,5 milioni di dollari di persone ed costano 40 miliardi di dollari all'anno solo negli Stati Uniti10. I pazienti con diabete hanno aumentato i rischi per lo sviluppo di ferite croniche che richiedono amputazioni per contenere la diffusione dell'infezione. Questi pazienti hanno un rischio di mortalità del 50% entro 5 anni dall'amputazione attribuita al meccanismo di fisiopatologia del diabete11. La relazione tra il sistema immunitario dell'ospite e il microbioma nella guarigione delle ferite è un argomento vitale della ricerca in corso perché le conseguenze delle ferite croniche, se irrisolte, includono l'amputazione e la morte12.
Anche se uno sforzo significativo è stato investito nella comprensione di come si sviluppano le ferite croniche negli esseri umani, non è ancora chiaro come e perché si formano le ferite croniche. Gli esperimenti per studiare i meccanismi di guarigione alterata sono difficili da condurre negli esseri umani, e gli specialisti di guarigione delle ferite vedono solo i pazienti con ferite croniche che hanno già raggiunto la cronicità per settimane o mesi. Così, gli specialisti non sono in grado di studiare quali processi sono andati male che portano la ferita a svilupparsi per diventare cronica2. Mancano modelli animali che riassumono la complessità delle ferite croniche umane. Fino a quando non è stato sviluppato il nostro modello, non esisteva alcun modello per gli studi sulle ferite croniche.
Il modello della ferita cronica è stato sviluppato nei topi che hanno una mutazione nel recettore della leptina (db/db-/-)13. Questi topi sono obesi, diabetici e hanno problemi di guarigione ma non sviluppano ferite croniche14. Livelli di glucosio nel sangue media intorno 200 mg/dL, ma può essere alto come 400 mg/dL15. Quando alti livelli di stress ossidativo (OS) nel tessuto della ferita vengono indotti immediatamente dopo la ferita, la ferita diventa cronica16. Le ferite db/db-/- sono considerate croniche entro 20 giorni e rimangono aperte per 60 giorni o più. I biofilm prodotti dai batteri possono essere visti in via di sviluppo a partire da tre giorni dopo la ferita; un biofilm maturo può essere visto 20 giorni dopo il ferimento e persiste fino alla chiusura della ferita. I batteri che formano i biofilm che troviamo in questi topi si trovano anche nelle ferite croniche diabetiche umane.
Lo stress ossidativo è indotto dal trattamento delle ferite con due inibitori di enzimi antiossidanti, catalasi e glutathione perossidasi, due enzimi con la capacità di abbattere il perossido di idrogeno. Il perossido di idrogeno è una specie reattiva di ossigeno e può causare danni cellulari attraverso l'ossidazione di proteine, lipidi e DNA. Catalase catalizza la decomposizione del perossido di idrogeno in ossigeno e acqua chimici meno nocivi. 3-Amino-1,2,4-triazole (TT) inibisce la catalasi legando specificamente e covalentmente al centro attivo dell'enzima, inattivandolo17,18,19. L'ATA è stato utilizzato per studiare gli effetti dello stress ossidativo sia in vitro che in vivo attraverso l'inibizione della catalise20,21,22,23,24. Glutathione perossidase catalizza la riduzione del perossido di idrogeno attraverso l'antiossidante, glutathione, ed è un enzima importante che protegge la cellula contro lo stress ossidativo25. L'acido mercaptosuccinico (MSA) inibisce la glutathione peroxidasi legandosi al sito attivo selenocisteine dell'enzima con tiol, inattivandolo26. MSA è stato utilizzato per studiare gli effetti dello stress ossidativo in vitro e in vivo così come20,27,28.
Questo nuovo modello di ferite croniche è un modello potente da studiare perché condivide molte delle stesse caratteristiche osservate nelle ferite croniche diabetiche umane, tra cui l'infiammazione prolungata da un aumento del sistema operativo e la formazione di biofilm naturale dal microbioma cutaneo. Le ferite hanno alterate l'interazione dermicaia, deposizione anomala di matrice, scarsa angiogenesi e vascolatura danneggiata. Le ferite croniche si svilupperanno sia nei topi maschi che in quella femminile, quindi entrambi i sessi possono essere utilizzati per studiare le ferite croniche. Pertanto, il modello di ferita cronica può contribuire in modo significativo a far progredire la comprensione fondamentale di come iniziano tali ferite. L'utilizzo di questo modello di ferita cronica può fornire risposte a domande fondamentali su come la cronicità viene iniziata / ottenuta attraverso i contributi della fisiologia della guarigione alterata delle ferite e del microbioma dell'ospite.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:795px;" width="794">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">B6.BKS(D)-Leprdb/J&#160;</td>
			<td style="width:176px;">The Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:107px;">00697</td>
			<td style="width:204px;">Homozygotes and heterozygotes available&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin</td>
			<td style="width:176px;">Nair</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">a chemical depilatory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Buprenex (buprenorphine HCl)</td>
			<td style="width:176px;">Henry Stein Animal Health</td>
			<td style="width:107px;">059122</td>
			<td style="width:204px;">0.3 mg/ml, Class 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)</td>
			<td style="width:176px;">TCI</td>
			<td style="width:107px;">A0432</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mercaptosuccinic acid (MSA)</td>
			<td style="width:176px;">Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">88460</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Phosphate buffer solution (PBS)</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">autoclave steriled</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:176px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:107px;">029405</td>
			<td style="width:204px;">NDC 11695-6776-2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Oxygen</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">Tank must be compatible with vaporizing system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Isoflurane vaporizer</td>
			<td style="width:176px;">JA Baulch &#38; Associates&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Wahl hair clipper</td>
			<td style="width:176px;">Wahl</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">Lithium Ion Pro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Acu Punch 7mm skin biopsy punches</td>
			<td style="width:176px;">Acuderm Inc.</td>
			<td style="width:107px;">P750</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Tegaderm&#160;</td>
			<td style="width:176px;">3M</td>
			<td style="width:107px;">Ref: 1624W</td>
			<td style="width:204px;">Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Heating pad</td>
			<td style="width:176px;">Conair</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;">Moist Dry Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:308px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:176px;">BD</td>
			<td style="width:107px;">329461</td>
			<td style="width:204px;">0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2&#34;)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Tweezers</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sharp surgical scissors</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Thin metal spatula</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Tubing</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mouse nose cone</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Gloves</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">small plastic containers</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol to create chronic wounds in diabetic mice

Le ferite croniche si sviluppano a seguito di una regolazione difettosa in uno o più processi cellulari e molecolari complessi coinvolti in una corretta guarigione. Hanno un impatto sulle persone di 6,5 milioni di dollari e costano 40 miliardi di dollari all'anno solo negli Stati Uniti. Anche se è stato investito uno sforzo significativo per capire come si sviluppano le ferite croniche negli esseri umani, le domande fondamentali rimangono senza risposta. Recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo modello murino per le ferite croniche diabetiche che hanno molte caratteristiche delle ferite croniche umane. Utilizzando topi db/db-/-, possiamo generare ferite croniche inducendo alti livelli di stress ossidativo (OS) nel tessuto della ferita immediatamente dopo la ferita, utilizzando un trattamento una tantum con inibitori specifici per gli enzimi antiossidanti catalasi e perossidasi glutathione. Queste ferite hanno alti livelli di OS, sviluppano biofilm naturalmente, diventano completamente croniche entro 20 giorni dal trattamento e possono rimanere aperte per più di 60 giorni. Questo nuovo modello ha molte caratteristiche delle ferite croniche diabetiche negli esseri umani e quindi può contribuire in modo significativo ad far progredire la comprensione fondamentale di come le ferite diventano croniche. Questo è un importante passo avanti perché le ferite croniche negli esseri umani causano dolore significativo e angoscia ai pazienti e provocano l'amputazione se irrisolto. Inoltre, queste ferite sono molto costose e dispendiose in termini di tempo per il trattamento e portano a una significativa perdita di reddito personale per i pazienti. I progressi in questo campo di studio attraverso l'uso del nostro modello di ferita cronica possono migliorare significativamente l'assistenza sanitaria per milioni di persone che soffrono in questa condizione debilitante. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio la procedura per far sì che le ferite acute diventino croniche, cosa che non è mai stata fatta prima.

La figura 5 illustra un esempio di una ferita senza trattamento degli inibitori che progrediscono verso la chiusura della ferita e una ferita con trattamento degli inibitori che progrediscono verso la cronicità. La medicazione trasparente è stata lasciata in posizione sulla ferita cronica in modo da poter vedere il biofilm e l'accumulo di liquidi.
L'avvio cronico della ferita avviene in meno di 6 ...

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Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Le ferite croniche sono sviluppate da ferite acute su un modello di topo diabetico inducendo alti livelli di stress ossidativo dopo una ferita cutanea a tutto spessore. La ferita viene trattata con inibitori per catalasi e glutathione peroxidasi, con conseguente alterazione della guarigione e sviluppo di biofilm da parte di batteri presenti nel microbioma cutaneo.

Protocollo per creare ferite croniche nei topi diabetici

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Questo modello di topo può aiutare a rispondere alle domande nel campo medico della cronicità delle ferite. Il principale vantaggio di questo modello è che le ferite croniche nei topi imitano molti aspetti delle ferite croniche negli esseri umani. Per iniziare, posizionare il mouse su una superficie pulita e tenerlo in posizione pizzicando la base della coda.Quindi preparare le tosaerba ed essere pronti a tirarle via rapidamente se il mouse fa movimenti improvvisi. Radere l'intera schiena dal collo alla coda, anche intorno alla coda. Corri leggermente la lama contro la direzione di crescita dei capelli per il taglio più efficiente.Non premere i tosaerba in profondità nella pelle in quanto ciò può lividi o tagliare. Quindi, preparare la pelle per un'applicazione di lozione depilatoria. Inumidire la pelle con un tovagliolo di carta imbevuto d'acqua per prevenire ustioni chimiche.Premere leggermente con sufficiente pressione per bagnare i capelli tagliati contro la pelle. Quindi, mentre la pelle è bagnata, strofina una piccola bambola di lozione depilatoria nella regione rasata per 15-20 secondi. Una volta applicata, lasciare che la lozione reagisca con la pelle per 20-45 secondi.Prima di risciacquare la lozione, pulire leggermente alcune lozioni in varie posizioni per controllare la reazione. Se la pelle è rosa e senza peli, la reazione è completa. Quindi, afferrare il mouse per lavarlo via.Usando la mano non dominante con il pollice premere verso il basso la base della coda contro il palmo della mano e chiudere le altre dita. Quindi, con il naso del topo su e lontano dall'acqua, lascia che l'acqua passi sopra la schiena dell'animale. Quindi rapidamente, ma delicatamente, strofinare la parte posteriore del mouse con l'altra mano per lavare via la lozione.Dopo aver rimosso tutta la crema depilatoria, asciugare la pelle con un tovagliolo di carta. È importante non applicare lozione alle orecchie, alla coda o in qualsiasi punto vicino al viso. Se ciò dovesse accadere, pulire immediatamente la lozione con un asciugamano bagnato e quindi far passare l'acqua sul mouse per evitare danni a queste aree.Se dopo aver usato la crema vengono notate macchie scure, riapplicare la crema a quelle aree. Le macchie scure della pelle cresceranno i capelli più velocemente per tutta la durata dell'esperimento. Quindi taglia i capelli corti ogni tre o cinque giorni quando necessario.Un cerotto o due che non si trovano sopra il sito di wounding è accettabile, ma se la parte posteriore del mouse ha più macchie scure, non usarla per il modello di ferita cronica. Dopo aver rimosso i capelli, ospitare il topo da solo per almeno un giorno prima di ferire perché la pelle sarà troppo sensibile dalla lozione depilatoria. 30 minuti prima dell'intervento, iniettare al topo 120 microlitri di buprenorfina intraperitonealmente in PBS sterile.Tutti i volumi di questa procedura assumono un mouse da 60 grammi. 20 minuti prima dell'intervento, iniettare il mouse con 480 microlitri di ATZ intraperitonealmente in PBS sterile. Dividere il volume su entrambi i lati dell'addome.Dopo aver somministrato l'ATZ, posizionare il mouse in un piccolo contenitore di plastica sopra un riscaldante caldo fino all'inizio dell'intervento chirurgico. Coprire il piccolo contenitore con un tovagliolo di carta per aiutare a contenere il calore. Il topo dovrebbe calmarsi mentre si riscalda.Dopo aver confermato uno stato anestetizzato, procedere con il mento. Per iniziare la procedura di wounding, spruzzare una salvietta chem con 70%etanolo per pulire la parte posteriore del mouse per pulire il sito della ferita e la superficie della pelle. Non pulire eccessivamente o ci sarà il rischio di uccidere i batteri presenti sulla pelle.Il successo del modello di ferita cronica si basa su condizioni non sterili. Questi topi non sono privo di germi e sono alloggiati in un vivaio convenzionale. Il microbioma batterico che risiede sulla pelle è fondamentale per il successivo inizio e sviluppo di ferite croniche al momento del trattamento con inibitori degli enzimi antiossidanti.Ora considera dove si trova la ferita. Idealmente, utilizzare il lato dorsale del mouse centrato e lontano da macchie scure di pelle. Ora esegui la procedura di mento del mento in 30-45 secondi.Prima premi leggermente un pugno di biopsia cutanea di sette millimetri sul sito della ferita desiderato e ruota il pugno abbastanza in profondità da lasciare un'impressione del pugno. Quindi asportare la pelle delineata tirando su il centro del pugno con una pinzetta e tagliando lungo il contorno con forbici chirurgiche. Una volta completata, coprire saldamente la ferita con mezzo pezzo di medicazione trasparente del film.Entro 10 minuti dal mento, applicare un'aliquota di 60 microliter di MSA in PBS sterile e depositare MSA localmente sulla ferita. Più tardi, sei ore dopo l'intervento chirurgico, somministrare un altro fa di buprenorfina. Dosi supplementari possono essere somministrate se necessario.L'iniziazione cronica della ferita avviene in meno di sei ore e il margine della ferita viene visibilmente alterato dallo stress ossidativo. Una ferita cronica è una ferita che rimane aperta, allargata rispetto alla ferita iniziale e contiene biofilm. Dopo 20 giorni, la ferita è in piena cronicità.I batteri che formano biofilm che dominano il sito della ferita includono Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae e varie specie di Staphylococcus e Corynebacterium. Questi batteri si trovano anche nelle ferite croniche umane. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come creare ferite croniche nei topi.Una volta stabilite queste ferite croniche, è possibile utilizzarle per indagare molti dei meccanismi molecolari cellulari coinvolti nell'inizio della cronicità delle ferite.

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