Name: label-free neutrophil enrichment from patient-derived airway secretion using closed-loop inertial microfluidics
Uploaded: 2018-06-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von NIH/NIAID (R21AI119042) sowie NIH U24 Probe Sparing-Assay-Programm (U24-AI118656) unterstützt.

Die Musterkollektion wurde von der University of Pittsburgh Institutional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387) genehmigt. Alle Experimente werden unter einen Schrank mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung Biosafety durchgeführt.
1. Gerät Fertigung und weiche Lithographie
Hinweis: Standard weichen Lithographie Techniken15,16 dienten der Microchannel Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erstellen....

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	<li>Hamid, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+sputum+processing+for+cell+counts,+immunocytochemistry+and+in+situ+hybridisation.">Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation.</a> European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).</li><li>van Overveld, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+homogenization+of+induced+sputum+by+dithiothreitol+on+polymorphonuclear+cells.">Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells.</a> J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).</li><li>Qiu, D., Tan, W. 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M., Heidland, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+and+inhibition+of+elastase+release+from+human+neutrophils+dependent+on+the+calcium+messenger+system.">Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system.</a> Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).</li></ol>

Inertial Mikrofluidik lokalisieren Partikel- und Zellen an einer bestimmten seitlichen Position in einem Mikro-Kanal anhand ihrer Größe5,18,19,20. Durch die kombinierte Wirkung des Dekans zu ziehen, Kraft und die trägen Auftriebskraft im gekrümmten Microchannel, große Partikel oder Neutrophilen (> 10 µm) befinden sich in den Kanal und kleine Partikel Schleim Aggregate und Trümmer kleiner...

Da Zellen in einer großen Menge von Schleim in den Atemwegen Sekrete gekapselt sind, hat die funktionelle Beurteilung der Leukozyten durch eine in-vitro- Assay behindert. Dithiothreitol (DTT) ist der häufigste Lyse-Puffer zu distanzieren und homogenisieren Sputum für zytologische Analyse und Erkennung von Mediatoren und bietet gleichzeitig erträglich Lebensfähigkeit der isolierten Zellen1,2. Jedoch kann DVB-t stören Oberfläche-gebundene Antigene der Atemwege Neutrophilen, wodurch die Störung der Neutrophilen Funktion wie z. B. die Elastase und Myeloperoxidase (MPO)2,3. Daher wurden nur wenige Studien der menschlichen Atemwege Neutrophilenzahl Funktion mit peripherem Blut neutrophile durchgeführt, die nicht die physiologischen Eigenschaften der pulmonalen4verraten kann. Unterdessen hat sich träge Mikrofluidik Fortschritte bei der Isolierung von Zellen aus verschiedenen Patienten Biomatrices5,6. Das Gleichgewicht zwischen inertial Aufzug Kräfte und Dean ziehen richtet die Partikel/Zelle gemäß ihrer Größe die markierungsfreie Partikel Trennung7ermöglicht. Unsere Gruppe zuvor führte eine Probe Zubereitungsart für zirkulierenden Tumor Zellen8,9, Krankheitserreger im Blut8, Zellen aus einer Suspension Kultur10,11, 12, und Polymorphkernige Leukozyten (PMNs) von Blut13,14.
Hier stellen wir ein Protokoll um Immunzellen des Patienten Airway Sekrete mit geschlossenen inertial Mikrofluidik für einen nachgeschalteten in-Vitro -Assay, wie der Neutrophilen Elastase (NE)-Test vorzubereiten. Diese Methode bietet hohe Konzentration und Erholung, vor allem wenn es eine deutliche Überschneidung in seitlicher Richtung der Zelle/Teilchen aus dem die Zelle/Partikel des Interesses ist zu entfernen, die häufig in klinischen Proben beobachtet wird. Durch Rezirkulation der inneren Mauer (IW)-große Partikel oder Zellen zurück zu der Eingabe Probenröhrchen, die Partikel oder Zelle-of-Interest-Konzentrate im ursprünglichen Behälter konzentrieren, während Hintergrund Flüssigkeiten mit kleinen Mucin Aggregate durch den Abfall Behälter übergeben. Trotz der heterogenen strömungstechnischen Eigenschaften von klinischen Proben, erholt sich die vorgeschlagene Methode konsequent über 95 % der Neutrophilen aus Atemwege Sekretion Proben, die 1,000-fold verdünnt werden mit einer sauberen Kochsalzlösung (~ 1 mL). Im Gegensatz dazu stellt die Lyse-Methode eine breite Palette von PMNs Verwertungsquoten je nach dem Zustand der Probe. Das vorgeschlagene Protokoll erfasst Leukozyten in gewissem markierungsfreie ohne physikalische oder chemische Unterbrechung, bietet die Möglichkeit, empfindliche Zellen aus klinisch gegen Biometrie mit minimal-invasiven Eingriffen zu ernten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PDMS precursor</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 3.9KG</td>
			<td>10:1 ratio of base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR gravity convection oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414005-128</td>
			<td>PDMS precursor to be cured in 90 deg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-324</td>
			<td>Fabrication of PDMS Supporting layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-core puncher</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHAWB100076</td>
			<td>2mm diameter or other depending on the tubing size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air plasma machine</td>
			<td>Femto Science</td>
			<td>Cute</td>
			<td>Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8221; x 3&#8221; glass slide</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>2195</td>
			<td>To support PDMS device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td>Tubing for microfluidics and peristlatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 inch Luer connector, male</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>PC2 72-1443</td>
			<td>Connector for fluid guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-940</td>
			<td>sample collection &#38; preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-446&#160;</td>
			<td>Buffer solution to dilute sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm</td>
			<td>HALYARD HEALTH</td>
			<td>22113</td>
			<td>Tracheal seceation suction catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe</td>
			<td>BD PosiFlush</td>
			<td>NHRIC: 8290-306547</td>
			<td>For tracheal seceation collection from the patients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurTainer&#8482; III Specimen Containers, 20mL</td>
			<td>Simport</td>
			<td>1176R36</td>
			<td>Sterile sputum (airway secretion) collection container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160; Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok&#160; Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m nylon cell strainer&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>HV-07522-30</td>
			<td>operation of microfluidics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>LSR II flow cytometer</td>
			<td>Quantification of cell recovery ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561927</td>
			<td>Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561864</td>
			<td>Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>Varioskan</td>
			<td>Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>600610</td>
			<td>Neutrophil functionality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres 10.0&#181;m</td>
			<td>PolyScience, Inc.</td>
			<td>18140-2</td>
			<td>Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free neutrophil enrichment from patient-derived airway secretion using closed-loop inertial microfluidics

Atemwege Sekrete enthalten eine große Anzahl von immunvermittelte Zellen, z. B.Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten, die als eine wichtige Ressource verwendet werden können, um eine Vielzahl von Lungenerkrankungen, sowohl für Forschung und klinische Zwecke zu bewerten. Aufgrund der heterogenen und Viskose von Patienten Schleim ist jedoch derzeit keine zuverlässige Dissoziation-Methode, die die Host Immunzellen in die Patienten Airway-Sekretion nicht schadet. In dieser Studie stellen wir eine Probe Vorbereitung Methode, die trägen Mikrofluidik immun Beurteilung des Patienten verwendet. Unabhängig von den heterogenen strömungstechnischen Eigenschaften der klinischen Proben, die vorgeschlagene Methode erholt mehr als 95 % der Neutrophilen Atemwege Sekretion Proben, die 1,000-fold verdünnt werden mit Milliliter sauber Kochsalzlösung. Durch Rezirkulation konzentrierte Ausgabedatenstrom Erstmuster-Reservoir, sind eine hohe Konzentration, die Wiederherstellung und die Reinheit der Immunzellen zur Verfügung gestellt; Rezirkulation gilt einen Kompromiss für den Einzel-Lauf Spritze ansässige Betrieb des inertialen Mikrofluidik. Der geschlossene Betrieb der Spirale Mikrofluidik bietet Leukozyten ohne physikalische oder chemische Störungen, wie Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) zeigt-induzierte sortierte neutrophile Elastase Freilassung.

Wir erreichten transparentere immun-Zellsuspensionen mit beiden DVB-t-Mucolysis und Mikrofluidik Dissoziation (Abb. 3A). Mikrofluidik Dissoziation gesammelt 4,40 x 105 PMNs im Durchschnitt (2,1 x 104 bis 5,60 x 105 PMNs n = 6) von den Atemweg Sekretion Proben 1,000-fold verdünnt (50 mL Gesamtvolumen) in 1 mL Suspension sauber. Im Vergleich zu dem ursprünglichen Verdünnungsmittel, 94,0 % PMNs (CD66b+/CD45+</s...

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Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

In dieser Forschung zeigen wir markierungsfreie Neutrophilenzahl Trennverfahren von klinischen Atemwege Sekrete mit geschlossenen Regelkreis der Spirale inertial Mikrofluidik. Die vorgeschlagene Methode würde die klinische in-vitro- Tests für verschiedene Erkrankungen der Atemwege zu erweitern.

Markierungsfreie Neutrophilenzahl Anreicherung von Patienten abgeleitet Airway-Sekretion mit Closed-Loop Inertial Mikrofluidik

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Der Nachweis von Human-Leukozyten-Antigen Biomarkern bei Brustkrebs Verwendung Markierungsfreie Biosensorik

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Markierungsfreie Identifikation von Lymphozyten-Subtypen mit dreidimensionale Quantitative Phase Bildgebung und maschinelles lernen

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...