Name: oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster
Uploaded: 2018-05-31T14:45:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une bourse stratégique du Wellcome Trust Centre d’immunité, Infection et d’évolution (http://ciie.bio.ed.ac.uk; subvention Référence no 095831). PVF était soutenue par une bourse Branco Weiss (https://brancoweissfellowship.org/) et Fellowship d’un chancelier (School of Biological Sciences, University of Edinburgh) ; JASJ était soutenue par une bourse d’étude NERC E3 DTP PhD.

1. maintenir les mouches
<ol><li>Maintenir les mouches en flacons de plastique de 23 mL contenant 7 mL de milieu de Lewis fraîchement préparé (modification de référence31; triple 1 L eau distillée H2O, 6,1 g de gélose, 93,6 g cassonade, 68 g de maïs, levure instantanée 18,7 g, agent anti-fongique de Tegosept 15 mL) dans les pépinières d’entreprises à 25 ± 1 ° C, dans un h:12 de 12 h de lumière : obscurité cycle avec environ 60 % d’humidité. Branchez les flacons avec de la laine de coton non absorbants.</li>
	<li>Après tous les 14 jours, transfert adultes de 20 à 30 pour un nouveau flacon de nourriture, avec de la levure instantanée, sec ajouté à la surface, pendant 2 à 3 jours pour permettre la ponte se produise. Après ce laps de temps, veiller à ce que les oeufs sont visibles à la surface de l’aliment. Enlever les mouches adultes. Remarque : Cela empêche les mouches dans les flacons comme seule génération, appariés selon l’âge des populations.</li>
	<li>Laissez les oeufs à développer. NOTE : À 25 ° C, les mouches adultes commencent à eclose de pupe jour 11 et continuent ces jours 12 à 14.</li>
</ol>2. préparer les mouches expérimentales
<ol><li>Recueillir les oeufs de la génération de parent dans une cage de collection population/embryon sur une gélose 75 mL de pommes (1 L triple distillée H2O, 30 g de gélose, 33 g de saccharose, 330 mL de jus de pomme, agent anti-fongique de 7 mL Tegosept) avec un spread de pâte de levure (levure sèche mix avec l’eau à une consistance du beurre d’arachide). Ajouter ouate imbibée d’eau de la cage pour fournir l’humidité. Remarque : Pour éviter les effets causés par les différences dans la densité d’élevage larvaire de confusion, il est important que mouches expérimentales dans différents flacons sont élevés dans des densités similaires. L’étape ci-dessus est effectué pour éviter les effets de confusion.</li>
	<li>Incuber 24 h à 25 ° C dans un 12 h:12 h cycle de lumière : obscurité jusqu'à ce que la ponte a eu lieu. S’il y a trop peu de œufs après 24h, fournissent une plus longue période d’accoutumance. Replacer apple-géloses et laisser la ponte se produise pendant un autre 24 h.</li>
	<li>Prenons oeuf-laden apple-géloses de la cage de la population. Retirez la pâte de levure restante et des mouches mortes de la surface de la gélose.</li>
	<li>Plonger l’agar dans 20 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et dégager délicatement les oeufs de l’apple-agar avec un pinceau fin. En suspension dans du PBS, transférer les oeufs dans un tube à centrifuger 50 mL et laisser pendant 5 min pour les oeufs se déposent au fond. Remarque : La plupart des oeufs sont trouvent sur le bord extérieur de l’agar.</li>
	<li>Supprimer en coupant le fond 4 mm d’un p1000 filtrée de pipette et embout de la pipette pour dessiner 1 mL de solution, prise dans le bas du tube de centrifuger de 50 mL. Ce transfert dans un tube de microtubes de 1,5 mL et autorisez-le à s’installer. Remarque : Lors du pipetage œufs, libérant du composant logiciel enfichable le piston est plus efficace qu’une libération douce.</li>
	<li>Supprimer en coupant le fond 4 mm d’une pointe de pipette filtrée p20. Affectez à la pipette un volume désiré et tirer le bas du tube microcentrifuge. Remarque : Avec la pratique, un volume de 5 µL contient environ 100 oeufs.</li>
	<li>Répartir les oeufs prélevés sur les aliments et les laisser se développer pendant le temps nécessaire.</li>
</ol>3. bacterial Culture
<ol><li>Pour faire croître des cultures entomophila P. et P. aeruginosa , ensemencer 10 mL de bouillon Luria-Bertani (LB), avec 100 µL d’un stock de bactéries congelé à 30 ° C (entomophila P.) et 37 ° C (P. aeruginosa), respectivement. Agiter à 150 tr/min pendant la nuit. Veiller à ce que la culture bactérienne atteint la phase de saturation.</li>
	<li>Pour s’assurer que les bactéries utilisées pour inoculer les mouches sont en phase exponentielle et répliquant rapidement, ensemencer la culture d’une nuit ou plus dans une nouvelle sous-culture, d’un volume désiré, le lendemain matin. Veiller à ce que l’inoculum avant est de 10 % du volume total de la culture de la sous-culture. Remarque : L’infection orale nécessite haute. Il est donc nécessaire d’augmenter un volume substantiel de culture bactérienne afin qu’assez de culture inoculation peut être produit pour la dose souhaitée et la dimension expérimentale. Calculer combien sous-culture est nécessaire pour produire les doses infectieuses requises à l’aide de l’équation MsVs = MiVi, où M représente une culture de densité optique mesurée 600 nm (OD600) et V représente sa volume. Subscript lettres font référence à la question de savoir si la culture est utilisée comme une sous-culture (s) ou une dose infectieuse (i).</li>
	<li>Pousser cette sous-culture dans une fiole conique de 2 L dans un volume tel que la surface de la sous-culture tombe (au plus) juste au-dessus du début de la pente de la fiole. Ne dépassez pas cette marque car il va arrêter la croissance des bactéries.</li>
	<li>S’assurer que les bactéries de cette sous-culture sont en phase de croissance exponentielle en mesurant le diamètre extérieur toutes les 30 minutes. Remarque : Cela se produit après 3 à 5 h, où la sous-culture atteint une OD600 entre 0,6 – 0,8.</li>
	<li>Verser les volumes égaux de cette sous-culture à travers 50 mL tubes à centrifuger et faites tourner la sous-culture à 2 500 g pendant 15 min à 4 ° C pour granuler les bactéries. Une fois que granulée, supprimer et puis tourner le surnageant à nouveau aux conditions ci-dessus pour confirmer la suppression de la plupart des bactéries. Remarque : Une pastille de taille négligeable (moins de 1 mm de hauteur) le confirme.</li>
	<li>Combiner les granules bactériennes des tubes séparés par re-leur suspension dans 5 mL du surnageant de sous-culture et recombiner ces solutions dans un tube unique de 50 mL. Faites tourner cette culture concentrée à 2 500 g pendant 15 min à 4 ° C pour granuler les bactéries.</li>
	<li>Retirez le surnageant et Resuspendre le culot de bactéries final dans la solution d’eau de 5 % de sucrose. Vérifier le diamètre extérieur et ajustez la dose infectieuse désirée (OD600 = 100 pour entomophila P.8 et OD600 = 25 pour P. aeruginosa16,28), par re-suspension des granulés dans 5 % solution de saccharose eau au volume nécessaire. Remarque : La quantité de solution d’eau 5 % de sucrose à ajouter peut être calculée à l’aide de l’équation à l’étape 3.2.1 (MsVs MiVi=).</li>
</ol>4. par voie orale qui infectent les mouches
<ol><li>Afin d’assurer une infection buccale, mourir de faim les mouches pendant 2 à 4 heures avant l’exposition aux bactéries en transférant les mouches aux flacons de gélose standard (triple 1 L eau distillée H2O, 20 g de gélose, 84 g cassonade, agent anti-fongique de 7 mL Tegosept).</li>
	<li>Préparer les flacons d’infection tandis que les mouches sont étant affamés. Faire une cuvette d’infection à Pseudomonas en pipettant : 500 l d’agar de sucre standard dans le couvercle d’un tube d’échantillon de 7 mL et laisser sécher. Placez un disque de papier filtre dans le couvercle et Déposer 100µl de culture bactérienne directement sur des disques filtrants. Pour contrôler les infections, remplacer la culture bactérienne avec le même volume de solution d’eau sucrée 5 % sur le papier filtre.</li>
	<li>Ajouter mouches unique dans le tube échantillon et laisser pendant 18 à 24 h.</li>
	<li>Pour confirmer l’infection orale, première surface-stériliser les mouches immédiatement après l’exposition bactérienne, en les plaçant dans 100 µL d’éthanol à 70 % pour 20 à 30 s. éliminer l’éthanol et ajouter 100 µL de triple de l’eau distillée pour 20 à 30 s avant de retirer l’eau. Ajouter 100 µL de PBS 1 x et homogénéiser la volée.</li>
	<li>Transférer l’homogénat à la ligne supérieure d’une plaque à 96 puits et ajoutez 90 µL de solution 1 PBS x à chaque bien en dessous.</li>
	<li>En série diluer cet échantillon pour distinguer une valeurs de gamme de l’UFC. Prendre 10 µL de l’homogénat dans le puits supérieur et l’ajoute à la bien en dessous. Répétez cette étape avec le deuxième bien, transférer 10 µL à la troisième et ainsi de suite, pour autant des dilutions successives au besoin. Remarque : Il est important que les nouvelles pointes de pipette sont utilisées pour chaque série de dilutions.</li>
	<li>Plaque les dilutions en série sur une plaque de gélose nutritive LB dans 5 gouttes µL, pour que toutes les gouttelettes restent discrètes.</li>
	<li>Incuber les boîtes de gélose LB nuit à 30 ° C et 37 ° C pendant entomophila P. et P. aeruginosa, respectivement et compter UFC visible. NOTE : Tandis que les microbes gut Drosophila nécessitent des conditions de croissance anaérobie distinctes, milieu sélectif, par exemple Pseudomonas Isolation moyenne (PIM), peut servir pour s’assurer que seulement Pseudomonas UFC est comptés.</li>
	<li>Calculer le nombre d’UFC par volée en comptant le nombre de colonies présentes à la dilution en série où 10 – 60 UFC est clairement visibles. Puis multiplier par le facteur de dilution actuel pour calculer le nombre de bactéries par volée.</li>
	<li>Effectuer une analyse statistique. Le cas échéant, transformer l’UFC par mouche à une distribution normale. Cela transformation logarithmique. Une fois transformé, utiliser des modèles linéaires généralisés (MLG)30,31,32 pour tester comment les groupes de traitement diffèrent dans UFC par volée (à l’aide de logiciels statistiques couramment disponibles telles que R33). Remarque : L’homogénat mouche restant peut être utilisé pour la mesure de l’expression des gènes par le biais de l’analyse quantitative de la transcription inverse PCR (RT-qPCR). Fixer l’homogénat dans 50 µL de réactif d’isolement ARN extrait RNA et quantifier des titres de gène immunitaire spécifique par RT-qPCR (voir p. ex., Gupta et Vale16 pour un protocole détaillé). L’expression de la transcription des gènes immunitaires spécifiques devrait être normalisée au niveau de la transcription d’un gène de ménage (p. ex., rp49) et a exprimé comme un pli changent par rapport aux mouches de contrôle à l’aide de la méthode de 2−ΔΔCt 31, 32,33,,34.</li>
</ol>5. enregistrement survie suite à une Infection
<ol><li>Infecter les mouches oralement comme indiqué au point 4.2.</li>
	<li>Transfert des patients infectés ou mouches de contrôle de leurs flacons d’infection respectifs en norme Lewis fioles et garder dans un incubateur à 25 ° C dans un h:12 de 12 h de lumière-obscurité cycle (ou conditions souhaitées). Garder les mouches jusqu'à leur mort.</li>
	<li>Compter le nombre de mouches vivantes ou mortes dans chaque flacon tous les jours ou aussi souvent que nécessaire.</li>
	<li>Transférer les mouches à nouveaux flacons tous les 5 jours pour éviter les mouches se coincés dans les aliments.</li>
	<li>Présenter ces données sous forme de courbes de survie de Kaplan-Meier (KM) ou moyenne ± écart type survie proportionnelle parcelles. Pour analyser l’effet de plusieurs facteurs ou leurs interactions respectifs entre eux utilisez un logiciel de statistiques (par exemple, le package « survie » dans R33) pour exécuter une analyse de survie tels que les risques proportionnels de Cox modèle35.</li>
</ol>6. mesure de la charge bactérienne
<ol><li>Au point de temps désiré, transférer une seule mouche infectée dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL.</li>
	<li>Surface de stériliser les mouches comme indiqué au point 4.4.</li>
	<li>Homogénéiser la mouche et de quantifier la charge bactérienne en utilisant le protocole décrit dans les étapes 4,5 – 4.10.</li>
</ol>7. mesurer l’excrétion bactérienne
<ol><li>Mesurer l’effusion aux côtés de la charge interne.</li>
	<li>Après l’infection, transfert unique mouches à tubes de microcentrifuge de 1,5 mL contenant environ 50 µL de milieu de Lewis pendant 24 h.</li>
	<li>Enlever les mouches pour la mesure de la charge interne (voir étape 6) et laver les tubes avec 100 µL de PBS 1 x au vortex fortement pendant 3 s.</li>
	<li>Mesurer l’UFC dans ce lavage par ensemencement sur gélose nutritive LB utilisent le même protocole, tel que décrit dans les étapes 4,6 – 4,8.</li>
	<li>Après l’infection, transfert unique mouches à tubes de microcentrifuge de 1,5 mL contenant environ 50 µL de milieu de Lewis pendant 24 h.</li>
	<li>Transférer les mouches dans de nouveaux tubes de microcentrifuge contenant environ 50 µL de milieu de Lewis pour un autre 24 h. lavage des tubes contaminés avec 100 µL de PBS 1 x au vortex lourdement pour 3 s.</li>
	<li>Mesurer l’UFC dans ce lavage par ensemencement sur gélose nutritive LB utilisent le même protocole décrit dans les étapes 4,6 – 4,8.</li>
	<li>Répétez les points 7.2 et 7.3 et record mortalité mouche à chaque transfert.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffmann, J. 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Nous présentons un protocole pour infecter les d. melanogaster fiable oralement avec des bactéries pathogènes. Nous nous concentrons sur P. aeruginosa et P. entomophila, mais ce protocole peut facilement être adapté pour permettre l’infection d’autres espèces bactériennes, par exemple, Serratia marcescens7. Principaux aspects du présent protocole peut varier entre espèces bactériennes. Par conséquent, la dose infectieuse plus efficace, virulence correspondante et la susceptibilité de génotype hôte devraient tous considérer et idéalement testées dans des études pilotes. Exposant les mouches pour des cultures bactériennes d’une gamme de densités optiques et mesurer leur dose infectieuse et leur survie est un bon point de départ lorsque vous travaillez avec nouvelles espèces bactériennes ou lignes de mouche.
Étapes du protocole tels que volent famine avant repas et re-suspension bactériennes granulés dans une solution de 5 % de saccharose sont monnaie courante dans l’infection par voie orale et accroître la fiabilité d’une infection bactérienne au cours de l’exposition7,8, 9 , 10. Cependant, il est important de noter que pendant l’exposition, les mouches vivent essentiellement sur une surface de culture bactérienne. En train de marcher sur cette culture, bactéries vont se loger sur la surface de la mouche, surtout sur la cuticule ou autour des soies24. Ces bactéries épicuticulaires, ne reflètent pas une infection entérique réussie mais serait encore détectée par l’homogénéisation mouche et le placage. Pour réduire le risque de faux positifs, il est essentiel de surface de stériliser les mouches par immersion dans l’éthanol à 70 % jusqu'à 1 min.
Lorsqu’on examine les taux d’excrétion bactériennes, infection orale est indispensable. Le nombre d’agents pathogènes, qu'une multitude de rejets dans l’environnement est souvent difficile à mesurer et la charge interne est souvent prise comme un proxy pour la sévérité de l’infection et donc de transmission26,27. Charge bactérienne aux côtés d’excrétion bactérienne permet un examen de la relation entre ces deux éléments importants de maladie gravité et propagation38. Une des limites de la méthode présentée sont que doser la charge bactérienne interne de mouches exige échantillonnage destructeur. Il est donc difficile d’enquêter sur des tendances longitudinales de croissance de l’agent pathogène et la clairance au sein d’un même individu. Toutefois, il est possible de contourner cette limitation de façon destructive des cohortes de prélèvement d’échantillons d’individus à différents stades de l’infection, sous l’hypothèse que la charge moyenne de microbe dans chaque cohorte reflète la dynamique longitudinale pathogène au sein de tous les individuel. Excrétion bactérienne ne souffre pas des mêmes limitations et nous offrent des exemples de comment excrétion peut être quantifiée dans un échantillon transversal, ou longitudinal pour étudier comment effusion change au cours d’un individu au fil du temps.
Nombre de traits hôte et du pathogène établissent conjointement une propension de l’individu pour transmettre la maladie25,26,,39. Tandis que l’importance de ces traits susceptibles varie selon les systèmes hôte-pathogène, le taux d’excrétion est probablement un facteur déterminant de la transmission fécale-orale. La capacité de mesurer l’excrétion bactérienne s’ouvre à l’occasion de tester cette hypothèse. Ayant qualifié la dynamique de l’hôte-pathogène dans un panneau désiré de lignes mouches, expérimentateurs pourraient oralement infecter des individus et placez-les aux côtés des hôtes infectés, sensibles au cours de leur période infectieuse. Ces mouches « destinataires » pourraient alors être dosés pour charge bactérienne interne à divers moments comme un moyen de mesurer directement la transmission.

La mouche à fruit (également connu sous le nom la mouche du vinaigre), d. melanogaster, a été largement utilisée comme un organisme modèle pour les maladies infectieuses et immunitaires contre une variété de pathogènes1,2. Ce travail a offert des connaissances fondamentales sur les conséquences physiologiques de l’infection et a été également pionnier en démêler les voies moléculaires qui sous-tendent le système immunitaire contre les infections bactériennes, fongiques et virales parasitoïde, hôte. Cette connaissance n’est pas seulement utile pour comprendre la réponse immunitaire innée d’insectes et autres invertébrés, mais parce que beaucoup d'entre les mécanismes immunitaires sont conservés évolutionnaires entre les insectes et les mammifères, Drosophila a également stimulé la découverte des principaux mécanismes immunitaires chez les mammifères, y compris les humains,3.
Plupart des travaux sur la drosophile et immunitaires a mis l’accent sur les infections systémiques, à l’aide de méthodes d’inoculation qui livrent des pathogènes directement dans le corps de l’insecte par piqûre ou injection4,5,6. L’avantage de ces méthodes en permettant la livraison d’une dose infectieuse contrôlée est claire et pris en charge par un grand nombre de travaux sur les infections systémiques. Cependant, beaucoup de bactéries pathogènes naturels de d. melanogaster sont acquis en se nourrissant sur la décomposition des matières organiques où immunocompétence intestinale joue un rôle significatif à l’hôte la défense7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. les expériences qui emploient des infections systémiques contourner ces défenses et, par conséquent, fournir une image complètement différente de comment les insectes Mont les défenses contre les agents pathogènes naturels. Ceci est particulièrement important si le but du travail est de tester des prédictions sur l’écologie et l’évolution de l’infection, où l’utilisation d’agents pathogènes naturels et les voies d’infection sont important16,17. Des travaux récents a mis en évidence comment l’itinéraire emprunté par des agents pathogènes sensiblement affecte la maladie issue18,19, suscite les voies immunitaires distinctes20,21, peuvent de déterminer l’effet protecteur du hérité des endosymbiontes16et peut même jouer un rôle important dans l’évolution de l’hôte défenses17.
Une autre raison d’employer les voies orale d’infection, c’est qu’il permet l’étude de la variation dans la transmission d’agents pathogènes en mesurant l’excrétion bactérienne au cours de l’excrétion fécale après infection orale22,23, 24. comprendre les sources d’hétérogénéité d’hôte dans la transmission de la maladie est difficile dans les populations naturelles25,26, mais mesurer des composants de transmission, comme pathogène effusion, sous contrôlées en laboratoire conditions offre une solution de rechange utile27. En alimentation mouches bactéries et mesure bactériens excrétion sous une variété de contextes environnementaux et génétiques dans des conditions expérimentales contrôlées, il est possible d’identifier les sources de variations de la transmission entre hôtes.
Ici, les auteurs décrivent un protocole pour infecter les d. melanogaster oralement avec des bactéries pathogènes et pour quantifier la croissance bactérienne et l’excrétion qui suit (Figure 1). Nous décrivons ce protocole sur deux bactéries Pseudomonas : une souche virulente de l’agent pathogène opportuniste de P. aeruginosa (PA14) et une souche moins virulente du naturel voler pathogène entomophila P.. Pseudomonas sont des bactéries Gram-négatives communes avec une vaste gamme d’hôtes, qui infecte des insectes, des nématodes, des plantes et des vertébrés et sont retrouvent dans la plupart des environnements4,6. Une infection entérique de la drosophile par P. aeruginosa et P. entomophila résultats en pathologie à l’épithélium intestinal12,13,14,15, 28. Alors que nous nous concentrons sur ces deux bactéries pathogènes, les méthodes décrites ici peuvent en principe être appliqués à toute bactérie pathogène d’intérêt avec des modifications mineures. Suite à une exposition par voie orale, nous mesurer la survie après l’infection et la charge de microbe à mouches individuels et les microbes viables versé dans l’environnement, exprimée en unités (UFC) formant des colonies. Enfin, parce que l’immunocompétence gut résulte d’une combinaison de la barrière épithéliale et réponses humorales, nous mesurons également la survie des lignes mouches où ces défenses sont perturbées. Plus précisément, Drosocrystallin (Dcy) mutants ont démontré antérieurement plus susceptibles à une infection bactérienne par voie orale en raison d’une matrice péritrophique appauvri dans le tube digestif29. Nous mesurons également la survie dans un mutant de Relish (Rel) dont il est fait obstacle de la production de peptides antimicrobiens contre les bactéries Gram-négatives via l’IMD pathway30.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vials</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>58.490</td>
			<td>Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Agar, ash 2.0-4.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown sugar</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>66032</td>
			<td>Light brown soft sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize</td>
			<td>Dove&#39;s Farm</td>
			<td></td>
			<td>Organic maize flour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermipan yeast</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>96360</td>
			<td>Dry, instant yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5501</td>
			<td>&#62;=99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Sucrose BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>15788517</td>
			<td>X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50ml)</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>210261</td>
			<td>Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (0.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.699</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (1.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>20821.33</td>
			<td>ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Conical Flask</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>214-0038</td>
			<td>Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>1001-020</td>
			<td>Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou sample container</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>129A</td>
			<td>7ml polystyrene sample container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17208</td>
			<td>Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>BP1426</td>
			<td>Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Embryo Collection Cages</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>59-101</td>
			<td>Flystuff- fits 100mm petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>353072</td>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>12649595</td>
			<td>Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>CHE2068</td>
			<td>Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- non absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABL</td>
			<td>Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABS</td>
			<td>BP small quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator</td>
			<td>Gallenkamp</td>
			<td>INR-200-010V</td>
			<td>220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70&#186;C. Shaking frequency: 0...400 rpm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbance Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>ELx808&#8482; Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen 5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392304</td>
			<td>Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Plus Real Time qPCR System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Software 2.3</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Statistical Software</td>
			<td>https://cran.r-project.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741015</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741065</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741045</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>774288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>739288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>740288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster

La drosophile Drosophila melanogaster est l’un des meilleurs systèmes de modèle mis au point d’infection et immunité innée. Alors que la plupart des travaux a porté sur les infections systémiques, il y a eu une recrudescence d’intérêt pour les mécanismes de l’immunocompétence intestin aux agents pathogènes, qui exigent des méthodes d’infecter oralement les mouches. Nous présentons ici un protocole afin d’exposer oralement les mouches individuels à un pathogène opportuniste bactérien (Pseudomonas aeruginosa) et un pathogène bactérien naturel de d. melanogaster (Pseudomonas entomophila). Le but du présent protocole est de fournir une méthode robuste pour exposer les mouches mâles et femelles à ces agents pathogènes. Nous fournissons des résultats représentatifs phénotypes de survie et microbe charges bactériennes mue, qui sont pertinentes pour l’étude de l’hétérogénéité dans la transmission d’agents pathogènes. Enfin, nous confirmons que des mutants Dcy (manque la matrice protectrice péritrophique dans l’épithélium du tube digestif) et savourer des mutants (manque une voie fonctionnelle déficit immunitaire (IMD)), montrent une susceptibilité accrue à une infection bactérienne par voie orale. Le présent protocole, par conséquent, décrit une méthode robuste pour infecter des mouches à l’aide de l’infection, qui peut être étendue à l’étude d’une variété génétique et environnementale de sources de variation des résultats infection intestinale et transmission bactérienne par voie orale.

Nous présentons ici les résultats illustratifs des expériences où d. melanogaster a été infectés par voie orale par P. aeruginosa ou P. entomophila. La figure 2 illustre l’infection orale réussie de mouches après une période d’exposition de 12 h ou 24h à cultures bactériennes de OD600 = 25 et 100 pour P. aeruginosa (Figure 2 a) et P. entomophila (Figure 2 b " C), respectivement. Figure 2 b illustre l’importance d’une culture plus concentrée P. entomophila, montré l’augmentation de la charge bactérienne lorsque les mouches sont exposés à des cultures bactériennes de densité optique supérieure. Mouches Oregon R (OreR) mâles et femelles clairement infection à P. aeruginosa au même rythme (Figure 3) et de produire le même nombre de P. aeruginosa UFC (Figure 4 a). Lors infectés par P. entomophila cependant, les mouches mâles et femelles de OreR diffèrent dans le nombre de remise de bactéries, d’une manière qui change au fil du temps (Figure 4 b). Les mâles et les femelles meurent P. aeruginosa (Figure 5 a) et P. entomophila (Figure 5 b) à des vitesses différentes. Nous voyons aussi que les mutants Dcy (qui n’ont pas la matrice protectrice péritrophique dans l’épithélium du tube digestif) et les mutants de Relish (qui n’ont pas une voie fonctionnelle de système immunitaire IMD), montrent une diminution de survie suite entomophila P. et P. aeruginosa infection orale (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble schématique des protocoles pour mesurer la survie, excrétion et interne charge bactérienne suivant l’infection orale chez Drosophila melanogaster. Une illustration des 3 expériences possibles suite à l’infection orale de d. melanogaster. Mesurer la « survie » en transférant des mouches unique à flacons et en enregistrant leur durée de vie infectée. Mesurer le « délestage » en transférant les mouches unique à tubes de microcentrifuge de 1,5 mL avec 50 µL de milieu de Lewis dans le bouchon. Après 24h dans le tube, retirer la mouche et le vortex le tube avec 100 µL de solution 1 PBS x. Retirez et blanc sur plaque de cette solution sur gélose nutritive LB pour calculer la réduction bactérienne. Mesurer l’effusion dans la même volée longitudinalement, transfert de mouches à tubes fraîches avec moyen de Lewis dans le capuchon après 24 h et en lavant et en plaquant le tube maintenant contaminé. « Charge interne » d’une mouche peut être mesurée en prenant un infecté fly, surface stériliser et il l’homogénéisation avant électrodéposition enfin l’homogénat sur gélose nutritive LB. Cela peut être effectuée que le rejet a été mesurée pour calculer comment la « charge interne » et délestage corrélat. L’illustration de mouche utilisée dans cette figure a été initialement dessinée par B. Nuhanen36. Les auteurs ont modifié pour accompagner la courbe exemple Kaplan-Meier qui provient de Wikimedia Commons,37. Toutes les autres illustrations sont originales. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> Figure 2 : dose infectieuse des bactéries suite à une infection par voie orale. (A) la dose infectieuse de mâle et femelle Oregon-R vole après une exposition à une culture P. aeruginosa (OD600 = 25) pendant 12 h. La moyenne et SE ont été calculés de 3 mâles et 3 femelles. (B) la dose infectieuse des croisements femelles de type sauvage après une exposition à l’un des quatre cultures entomophila P. (OD600 = 100, 75, 50 et 25) ou contrôler la solution de saccharose de 5 % pendant 24 h. La différence statistique de (F3,76 = 18.567, p < 0,001) dans la dose infectieuse entre les traitements de l’exposition est dénotée par différentes lettres au-dessus des barres. Les moyennes ont été calculées de 5 mouches pour l' OD600 = 0 dose et 18-20 pour toutes les autres doses. (C) la dose infectieuse de mâle et femelle Oregon-R vole après une exposition à la culture P. entomophila (OD600 = 100) pendant 24 h. La moyenne et SE ont été calculés de 20 garçons et 20 filles. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> Figure 3 : Charge d’interne de P. aeruginosa chez les mouches après infection par voie orale. Moyenne ± écart type charge bactérienne des mâle et femelle Oregon-R vole après l’infection orale avec P. aeruginosa (OD600 = 25) jusqu'à post-infection 168 h. La moyenne et SE de chaque point dans le temps sont calculés à partir de 3 personnes. Charge bactérienne interne une mouche modifie considérablement au fil du temps (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> Figure 4 : Bacterial rejet suite à une infection par voie orale. (A) de P. aeruginosa répandu par les mouches mêmes utilisés sur la Figure 3, jusqu'à à l’infection après 120 h. La moyenne et SE ont été calculés de 3 mâles et 3 femelles. (B) P. entomophila répandu par les mâle et femelle Oregon-R vole après l’infection orale avec P. entomophila (OD600 = 100) jusqu'à post-infection 120 h. La moyenne et SE ont été calculés de 34 hommes et 38 femmes. Pour P. aeruginosa et P. entomophila, le nombre d’UFC hangar une mouche change considérablement au fil du temps (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> Figure 5 : survie des mouches suite à une infection bactérienne orale. Courbes de survie de Kaplan-Meier (KM) (A) Oregon-R mâle et femelle vole après l’infection orale avec P. aeruginosa (OD600 = 25) ou 5 % de sucrose solution de contrôle. La courbe de survie KM a été calculée à partir de 4 flacons de 20 mouches par groupe de traitement. (B) OreR mâle et femelle vole après infection orale avec P. entomophila (OD600 = 100). La courbe de survie KM a été calculée à partir de 4 mouches de contrôle unique et 34 mouches infectées pour les mâles et les femelles. (C) mutants immunitaires : Dcy (Drosocrystallin-péritrophique mutant de matrice) et Rel (mutant Relish-IMD), exposés à P. entomophila (Pe), de P. aeruginosa (Pa14) ou une solution de saccharose de 5 % de contrôle. Tous les groupes d’infectés meurent nettement plus vite que le contrôle vole (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Ce protocole décrit les méthodes à exposer oralement et à infecter la drosophile Drosophila melanogaster avec des bactéries pathogènes et de mesurer le nombre de bactéries infectieuses hangar suite à une infection intestinale. Nous décrivons plus l’effet des mutants immunitaires sur la mouche survie suite à une infection bactérienne par voie orale.

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