Name: oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster
Uploaded: 2018-05-31T14:45:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da un premio strategico dal Wellcome Trust per il centro per l'immunità, infezione ed evoluzione (http://ciie.bio.ed.ac.uk; grant riferimento n ° 095831). PFV era sostenuto da una borsa di studio di Branco Weiss (https://brancoweissfellowship.org/) e Fellowship di un cancelliere (scuola di scienze biologiche, Università di Edimburgo); JASJ è stato sostenuto da un NERC E3 DTP PhD studentship.

1. mantenere le mosche
<ol><li>Mantenere le mosche in fiale di plastica 23 mL contenente 7 mL di mezzo di Lewis appena fatta (modificato dal riferimento31; Tripla 1 L acqua distillata H2O, 6,1 g di agar, 93,6 g zucchero di canna, 68 g di mais, lievito istantaneo 18,7 g, agente anti-fungine di 15 mL Tegosept) in incubatrice a 25 ± 1 ° C, in un h:12 12 h chiaro: scuro ciclo con ~ 60% di umidità. Collegare le fiale con non-assorbente di cotone idrofilo.</li>
	<li>Dopo ogni 14 giorni, trasferimento 20 – 30 adulti ad un nuovo flacone di cibo, con lievito istantaneo, asciutto, aggiunto alla superficie, per 2 – 3 giorni per consentire la deposizione delle uova per verificarsi. Dopo questo periodo di tempo, garantire che le uova sono visibili sulla superficie del cibo. Rimuovere le mosche adulte. Nota: In questo modo mosche nelle fiale come singola generazione, popolazioni di pari età.</li>
	<li>Lasciare le uova a sviluppare. Nota: A 25 ° C, mosche adulte iniziano a eclose da pupe il giorno 11 e continuano nei giorni 12 – 14.</li>
</ol>2. preparare mosche sperimentale
<ol><li>Raccogliere le uova della generazione dei genitori in una gabbia di popolazione/embrione insieme su una piastra di apple-agar 75 mL (1 L triplo distillata H2O, 30 g di agar, 33 g di saccarosio, 330 mL di succo di mela, agente anti-fungine di 7 mL Tegosept) con uno spread di pasta di lievito (lievito secco mix con acqua per ottenere una consistenza simile a burro di arachidi). Aggiungere ovatta impregnati d'acqua alla gabbia per fornire l'umidità. Nota: Per evitare di confondere gli effetti causati da differenze di densità di allevamento larvale, è importante che mosche sperimentale in diversi flaconcini sono allevati in densità simile. Il passo precedente viene eseguito per evitare di confondere gli effetti.</li>
	<li>Incubare per 24 h a 25 ° C in un h 12 h:12 ciclo di luce: buio fino alla deposizione delle uova si è verificato. Se ci sono troppo poche uova dopo 24 h, forniscono un periodo più lungo di assuefazione. Sostituire le piastre di agar a apple e consentire la deposizione delle uova per verificarsi per un ulteriore 24 h.</li>
	<li>Prendere i piatti carichi di uovo apple-agar dalla gabbia della popolazione. Rimuovere la restante pasta di lievito e qualsiasi mosche morte dalla superficie dell'agar.</li>
	<li>Immergere l'agar in 20 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x e staccare delicatamente le uova da apple-agar con un pennello fine. Mentre sospeso in PBS, trasferire le uova a un tubo di centrifuga da 50 mL e lasciare per 5 minuti in modo che depositano le uova sul fondo. Nota: La maggior parte delle uova si trovano sul bordo esterno dell'agar.</li>
	<li>Rimuovere tagliando il fondo 4 mm di un puntale filtrato p1000 e utilizzare la punta della pipetta per disegnare 1 mL di soluzione, prelevati dal fondo della provetta centrifugo 50ml. Questo trasferimento a un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e permettono di riposare. Nota: Quando si pipetta uova, snap-liberare lo stantuffo è più efficiente di una versione dolce.</li>
	<li>Rimuovere tagliando il fondo 4 mm di un puntale filtrato p20. Impostare la pipetta un volume desiderato e disegnare dalla parte inferiore del tubo del microcentrifuge. Nota: Con la pratica, un volume di 5 µ l contiene circa 100 uova.</li>
	<li>Versare le uova raccolte sul cibo e lasciare loro di sviluppare per la quantità di tempo necessaria.</li>
</ol>3. coltura
<ol><li>Per crescere culture p. entomophila e p. aeruginosa , inoculare 10 mL di brodo di Luria-Bertani (LB) con 100 µ l di azione batterica congelate a 30 ° C (p. entomophila) e 37 ° C (p. aeruginosa), rispettivamente. Agitare a 150 giri/min durante la notte. Assicurare che la coltura batterica raggiunge la fase di saturazione.</li>
	<li>Affinché i batteri usati per vaccinare le mosche sono in fase esponenziale e rapidamente la replica, inoculare la cultura durante la notte in una nuova sottocultura, di un volume desiderato, la mattina seguente. Assicurarsi che pre-l'inoculo 10% del volume totale della cultura sottocultura. Nota: Infezione orale richiede alta. Pertanto è necessario crescere un cospicuo volume di coltura batterica, in modo che sufficiente cultura di inoculazione può essere prodotto per la dose desiderata e la dimensione sperimentale. Calcolare quanta sottocultura è necessaria per produrre dosi infettive richieste utilizzando l'equazione MsVs = MioVho, dove M rappresenta una cultura di densità ottica misurata a 600 nm (OD600) valore e V rappresenta la volume. Lettere in pedice si riferiscono se la cultura è usata come una sottocultura (s) o una dose infettiva (i).</li>
	<li>Crescere questa sottocultura in una beuta da 2 L in un volume tale che la superficie di sottocultura cade (al massimo) appena sopra l'inizio della pendenza di pallone. Non riempire oltre questo come esso sarà acrobazia la crescita dei batteri.</li>
	<li>Garantire che i batteri in questa sottocultura sono in fase di crescita esponenziale misurando il OD ogni 30 min. Nota: Ciò si verifica dopo 3 – 5 h, dove la sottocultura raggiunge un OD600 tra 0,6-0,8.</li>
	<li>Versare volumi uguali di questa sottocultura attraverso 50 mL provette da centrifuga e girare la sottocultura a 2.500 x g per 15 min a 4 ° C per appallottolare i batteri. Una volta pellettati, rimuovere e poi girare il surnatante nuovamente alle condizioni di cui sopra per confermare la rimozione della maggior parte dei batteri. Nota: Un pellet di dimensione trascurabile (inferiore a 1 mm in altezza) lo conferma.</li>
	<li>Combinare i pellet batterici dei tubi separati da ri-sospendendoli in 5 mL di surnatante sottocultura e ricombinando queste soluzioni in un tubo singolo 50 mL. Girare questa cultura concentrata a 2.500 x g per 15 min a 4 ° C per appallottolare i batteri.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet finale batteri in soluzione di acqua di saccarosio di 5%. Controllare il diametro esterno e regolare per la dose infettiva desiderata (OD600 = 100 per p. entomophila8 e OD600 = 25 per p. aeruginosa16,28), ri-sospendendo il pellet in 5% soluzione acquosa di saccarosio al volume richiesto. Nota: La quantità di soluzione di acqua di saccarosio di 5% da aggiungere può essere calcolata utilizzando l'equazione nel passaggio 3.2.1 (MsVs = MioVho).</li>
</ol>4. oralmente infettare mosche
<ol><li>Per garantire l'infezione orale, morire di fame le mosche per 2 – 4 h prima dell'esposizione ai batteri trasferendo le mosche per flaconi standard agar (Tripla 1 L acqua distillata H2O, 20 g di agar, 84 g zucchero di canna, 7ml Tegosept agente anti-fungine).</li>
	<li>Preparare i flaconcini di infezione mentre mosche sono essere affamati. Trasformare il coperchio di una provetta 7 mL una fiala di infezione di Pseudomonas di pipettaggio 500 µ l di agar standard zucchero e lasciarlo asciugare. Collocare un disco di carta da filtro nel coperchio e pipettare 100 µ l di coltura batterica direttamente sul disco filtro. Per le infezioni di controllo, è necessario sostituire la coltura batterica con lo stesso volume di soluzione di acqua 5% saccarosio su carta da filtro.</li>
	<li>Aggiungere mosche singole provetta del campione e lasciare per 18 – 24 h.</li>
	<li>Per confermare l'infezione orale, prima superficie-sterilizzare le mosche immediatamente dopo l'esposizione batterica, ponendoli in 100 µ l di etanolo al 70% per 20 – 30 s. rimuovere l'etanolo e aggiungere 100 µ l di triple distillata acqua per 20 – 30 secondi prima di rimuovere l'acqua. Aggiungere 100 µ l di PBS 1X e omogeneizzare al volo.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato alla riga superiore di una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 90 µ l di 1X PBS ogni ben di sotto.</li>
	<li>Diluire in serie questo esempio per distinguere un valori di intervallo di CFU. Prendere 10 µ l di omogenato nel pozzo superiore e aggiungere questo ben di sotto. Ripetere questo passaggio con il secondo bene, trasferire 10 µ l per il terzo e così via, per diluizioni seriali come molti come richiesto. Nota: È importante che i nuovi puntali vengono utilizzati per ogni serie di diluizioni.</li>
	<li>Piastra le diluizioni seriali su una piastra di agar nutriente LB in 5 µ l gocce, affinché che tutte le goccioline rimangono discrete.</li>
	<li>Incubare le piastre di Agar LB durante la notte a 30 ° C e 37 ° C per p. entomophila e p. aeruginosa, rispettivamente e contare CFUs visibile. Nota: Mentre microbi dell'intestino della drosofila richiedono condizioni di crescita anaerobica distinti, terreno selettivo, ad esempio Pseudomonas isolamento medio (PIM), può essere utilizzato per assicurarsi che solo Pseudomonas CFUs sono contati.</li>
	<li>Calcolare il numero di CFU per volare contando il numero di colonie presenti alla diluizione seriale dove 10 – 60 CFUs sono chiaramente visibili. Quindi moltiplicare per il fattore di diluizione presente per calcolare il numero di batteri per volare.</li>
	<li>Effettuare analisi statistiche. Ove necessario, trasformare il CFUs per volare su una distribuzione normale. Fare questo registro-trasformazione. Una volta trasformato, è possibile utilizzare modelli lineari generalizzati (GLMs)30,31,32 per verificare come i gruppi di trattamento differiscono in CFUs al volo (utilizzando pacchetti comunemente disponibili software statistici come R33). Nota: Il restante omogeneato Vola può essere utilizzato per misurare l'espressione genica attraverso l'analisi di PCR (RT-qPCR) trascrizione d'inversione quantitativa. Difficoltà l'omogeneizzato in 50 µ l di reagente di isolamento del RNA, estrarre RNA e quantificare i titoli specifici geni immuni da RT-qPCR (Vedi ad es., Gupta e Vale16 per un protocollo dettagliato). L'espressione delle trascrizioni del gene immune specifico dovrebbe essere normalizzato per i livelli di trascrizione di un gene housekeeping (cioè, rp49) ed espresso come una piega cambia rispetto al controllo mosche utilizzando il metodo 2−ΔΔCt 31, 32,33,34.</li>
</ol>5. registrazione sopravvivenza dopo l'infezione
<ol><li>Infettare mosche oralmente come descritto al punto 4.2.</li>
	<li>Trasferire gli infetti o controllo mosche da loro fiale rispettivi infezione in standard Lewis fiale e mantenere in un incubatore a 25 ° C in un h 12 h:12 chiaro-scuro del ciclo (o desiderato condizioni). Tenere mosche finché siano morti.</li>
	<li>Contare il numero di mosche vivi o morti in ogni fiala ogni giorno, o come spesso come richiesto.</li>
	<li>Trasferire le mosche a new Fiale ogni 5 giorni per evitare le mosche conficcate nel cibo.</li>
	<li>Media ± SE sopravvivenza proporzionale plottaggi o presentare questi dati come curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier (KM). Per analizzare l'effetto di diversi fattori e/o i loro rispettivi interazioni uno con l'altro utilizzare un pacchetto statistico (ad esempio, il pacchetto "sopravvivenza" in R33) per eseguire un'analisi di sopravvivenza come il rischi proporzionali di Cox modello35.</li>
</ol>6. misurazione della carica batterica
<ol><li>Al punto di tempo desiderato, è possibile trasferire una singola Mosca infettata ad un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL.</li>
	<li>Superficie sterilizzare le mosche come descritto al punto 4.4.</li>
	<li>Omogeneizzare al volo e quantificare la carica batterica utilizzando il protocollo descritto nei passaggi 4.5 – 4,10.</li>
</ol>7. misurare spargimento batterico
<ol><li>Misurare lo spargimento a fianco del carico interno.</li>
	<li>Dopo l'infezione, trasferimento singoli mosche per microcentrifuga da 1,5 mL contenente ~ 50 µ l di terreno di Lewis per 24 h.</li>
	<li>Rimuovere le mosche per la misura di carico interno (Vedi punto 6) e lavare le provette con 100 µ l di PBS 1X nel Vortex pesantemente per 3 s.</li>
	<li>Misurare il CFUs in questo lavaggio di placcatura su agar nutriente LB usando lo stesso protocollo, come descritto nei passaggi 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Dopo l'infezione, trasferimento singoli mosche per microcentrifuga da 1,5 mL contenente ~ 50 µ l di terreno di Lewis per 24 h.</li>
	<li>Trasferire le mosche in nuove provette microcentrifuga contenente ~ 50 µ l di terreno di Lewis per un ulteriore 24 h. lavare le provette contaminate con 100 µ l di PBS 1X nel Vortex pesantemente per 3 s.</li>
	<li>Misurare il CFUs in questo lavaggio di placcatura su agar nutriente LB usando lo stesso protocollo descritto nei passaggi 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Ripetere i punti 7.2 e 7.3 e registrare la mortalità vola ogni trasferimento.</li>
</ol>

<ol>
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Vi presentiamo un protocollo per infettare in modo affidabile oralmente d. melanogaster con agenti patogeni batterici. Ci concentriamo su p. aeruginosa e p. entomophila, ma questo protocollo può essere facilmente adattato per consentire l'infezione di altre specie batteriche, per esempio, i marcescens del Serratia7. Gli aspetti chiave del presente protocollo varierà tra specie batteriche. Conseguenza, la dose infettiva più efficiente, virulenza corrispondente e suscettibilità genotipo dell'ospite dovrebbero tutti essere considerati e idealmente testati in studi pilota. Esponendo le mosche a colture batteriche di una gamma di densità ottica e misura loro dose infettiva e la sopravvivenza è un punto di partenza appropriato quando si lavora con nuove specie batteriche o fili di Mosca.
Procedura di protocollo come vola fame prima dell'alimentazione e pellet ri-sospensione batterica in soluzione di 5% di saccarosio sono comuni nell'infezione orale e aumentare l'affidabilità dell'infezione batterica durante l'esposizione7,8, 9 , 10. Tuttavia, è importante notare che durante l'esposizione, mosche vivono essenzialmente su una superficie di coltura batterica. Nel processo di camminare su questa cultura, batteri saranno diventato depositati sulla superficie della Mosca, soprattutto sulla cuticola o intorno le setole24. Questi batteri epicuticolari, non riflettono un infezione enterica successo ma sarebbe ancora rilevato dall'omogeneizzazione volare e placcatura. Per ridurre la possibilità di falsi positivi, è essenziale alla superficie sterilizzare mosche attraverso immersione in etanolo al 70% per fino a 1 min.
Quando considerando tassi di spargimento batterici, infezione orale è essenziale. Il numero di agenti patogeni che un host rilascia nell'ambiente è spesso difficile da misurare e il carico interno è preso spesso come un proxy per la severità dell'infezione e, pertanto, trasmissione26,27. Misurazione della carica batterica al fianco di spargimento batterico permette un esame del rapporto tra queste due componenti importanti della malattia gravità e diffusione38. Una limitazione del metodo presentato è che diluire la carica batterica interna di mosche richiede campionamento distruttivo. Questo rende difficile indagare la longitudinale tendenze di sviluppo del patogeno e sdoganamento all'interno dell'individuo stesso. Tuttavia, è possibile superare questa limitazione di coorti di campionamento in maniera distruttiva degli individui nelle diverse fasi dell'infezione, sotto l'ipotesi che il carico medio microbo in ogni gruppo riflette le dinamiche di agente patogeno longitudinale all'interno di qualsiasi dato individuali. Spargimento batterico non soffre le stesse limitazioni, e offriamo esempi di come lo spargimento può essere quantificato in un campione rappresentativo, o longitudinalmente per indagare come spargimento cambia all'interno di un individuo nel tempo.
Molti tratti di ospite e patogeno determinano congiuntamente la propensione di un individuo per trasmettere la malattia25,26,39. Mentre il significato di questi tratti probabili varia tra i sistemi ospite-patogeno, spargimento è probabilmente un elemento determinante della trasmissione fecale-orale. La capacità di misurare lo spargimento batterico si apre la possibilità di testare questa ipotesi. Avendo caratterizzato dinamiche di ospite-patogeno in un pannello desiderato di volare linee, sperimentatori potrebbero oralmente infettare gli individui e metterli insieme a padroni di casa non infetti, suscettibile durante i loro periodi infettivi. Queste mosche 'destinatari' potrebbero quindi essere analizzate per interno carico batterico a vari intervalli di tempo come un modo di misurare direttamente la trasmissione.

La Mosca della frutta (anche conosciuto come il fly di aceto), d. melanogaster, è stato ampiamente utilizzata come organismo modello per l'infezione e immunità contro una varietà di agenti patogeni1,2. Questo lavoro ha offerto intuizioni fondamentali le conseguenze fisiologiche di infezione e fu anche pioniere nel dipanare i meccanismi molecolari sottostanti la risposta immunitaria contro le infezioni batteriche, fungine e virali parassitoide. Questa conoscenza non è solo utile per capire la risposta immunitaria innata di insetti e altri invertebrati, ma perché molti dei meccanismi immuni sono evolutivamente conservate tra insetti e mammiferi, Drosophila ha anche stimolato la scoperta dei principali meccanismi immuni nei mammiferi, compreso gli esseri umani3.
Maggior parte del lavoro su Drosophila infezione e immunità ha incentrato sulle infezioni sistemiche, utilizzando metodi di inoculazione che consegno patogeni direttamente nel corpo dell'insetto di pizzicore o iniezione4,5,6. Il vantaggio di questi metodi nel permettere la consegna di una dose infettiva controllata è chiaro e supportato da un grande corpo di lavoro su infezioni sistemiche. Tuttavia, molti agenti patogeni batterici naturali di d. melanogaster sono stati acquisiti tramite alimentazione sulla decomposizione di materia organica dove l'immunocompetenza intestino svolge un ruolo significativo in host difesa7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. esperimenti che impiegano infezioni sistemiche ignorare queste difese e, pertanto, fornire un quadro del tutto diverso di come insetti montare le difese contro gli agenti patogeni naturali. Questo è particolarmente rilevante se lo scopo del lavoro è di testare le previsioni sull'ecologia e l'evoluzione dell'infezione, dove l'uso di agenti patogeni naturali e itinerari dell'infezione sono importante16,17. Lavoro recente ha evidenziato come il percorso intrapreso dai patogeni significativamente influenza malattia risultato18,19, suscita vie immuni distinte20,21, può determinare l'effetto protettivo di ereditato endosimbionti16e potrebbe anche giocare un ruolo importante nell'evoluzione dell'host difese17.
Un altro motivo per impiegare orale itinerari dell'infezione è che permette l'indagine della variazione nella trasmissione dell'agente patogeno misurando lo spargimento batterica durante l'escrezione fecale dopo infezione orale22,23, 24. comprendere le fonti di eterogeneità di ospite nella trasmissione della malattia è impegnativo in popolazioni naturali25,26, ma componenti di trasmissione, come agente patogeno spargimento, sotto controllati del laboratorio di misurazione condizioni offre un utile approccio alternativo27. Da nutrire mosche batteri e misura batterica spargimento sotto una varietà di contesti genetici ed ambientali in condizioni sperimentali controllate, è possibile identificare fonti di variazione della trasmissione tra padroni di casa.
Qui, descriviamo un protocollo per infettare oralmente d. melanogaster con batteri patogeni e per quantificare la crescita batterica e spargimento che segue (Figura 1). Descriviamo questo protocollo su due batteri Pseudomonas : un ceppo virulento di patogeno opportunista p. aeruginosa (PA14) e un ceppo meno virulento del naturale volare patogeno p. entomophila. Pseudomonas sono batteri gram-negativi comuni con una gamma ampia host, infettando gli insetti, nematodi, piante e vertebrati e si trovano nella maggior parte dei ambienti4,6. Infezione enterica di Drosophila da p. aeruginosa e p. entomophila risultati in patologia a epiteli intestinali12,13,14,15, 28. Mentre ci concentriamo su questi due batteri patogeni, i metodi descritti qui possono in linea di principio essere applicati a qualsiasi agente patogeno batterico di interesse con modifiche minori. A seguito di esposizione orale, misuriamo la sopravvivenza post-infettiva e misurare il carico di microbo all'interno di singoli mosche e i microbi vitali versato nell'ambiente, espressa in unità (CFUs) di formazione di colonie. Infine, perché l'immunocompetenza intestino deriva da una combinazione di barriera epiteliale e risposte umorali, misuriamo anche la sopravvivenza delle linee volare dove queste difese sono interrotti. In particolare, Drosocrystallin (Dcy) mutanti sono stati precedentemente indicati per essere più suscettibili all'infezione batterica orale a causa di una matrice peritrofica impoverito nel budello29. Misuriamo anche la sopravvivenza in un mutante di Relish (Rel), che è ostacolata dalla produzione di peptidi antimicrobici contro batteri gram-negativi tramite la IMD percorso30.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vials</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>58.490</td>
			<td>Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Agar, ash 2.0-4.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown sugar</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>66032</td>
			<td>Light brown soft sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize</td>
			<td>Dove&#39;s Farm</td>
			<td></td>
			<td>Organic maize flour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermipan yeast</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>96360</td>
			<td>Dry, instant yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5501</td>
			<td>&#62;=99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Sucrose BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>15788517</td>
			<td>X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50ml)</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>210261</td>
			<td>Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (0.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.699</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (1.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>20821.33</td>
			<td>ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Conical Flask</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>214-0038</td>
			<td>Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>1001-020</td>
			<td>Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou sample container</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>129A</td>
			<td>7ml polystyrene sample container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17208</td>
			<td>Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>BP1426</td>
			<td>Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Embryo Collection Cages</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>59-101</td>
			<td>Flystuff- fits 100mm petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>353072</td>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>12649595</td>
			<td>Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>CHE2068</td>
			<td>Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- non absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABL</td>
			<td>Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABS</td>
			<td>BP small quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator</td>
			<td>Gallenkamp</td>
			<td>INR-200-010V</td>
			<td>220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70&#186;C. Shaking frequency: 0...400 rpm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbance Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>ELx808&#8482; Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen 5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392304</td>
			<td>Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Plus Real Time qPCR System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Software 2.3</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Statistical Software</td>
			<td>https://cran.r-project.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741015</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741065</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741045</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>774288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>739288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>740288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster

Moscerino della frutta Drosophila melanogaster è uno dei migliori sistemi di modello sviluppato di infezione e l'immunità innata. Mentre la maggior parte del lavoro si è concentrata su infezioni sistemiche, c'è stato un recente aumento di interesse nei meccanismi di immunocompetenza intestino ai patogeni, che richiedono metodi di infettare oralmente mosche. Qui presentiamo un protocollo per esporre oralmente individuali vola verso un patogeno opportunista batterico (Pseudomonas aeruginosa) e un agente patogeno batterico naturale di d. melanogaster (Pseudomonas entomophila). L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo affidabile per esporre mosche maschi e femminile a tali agenti patogeni. Forniamo risultati rappresentativi mostrano fenotipi di sopravvivenza, carichi di microbo e batterico spargimento, che è rilevante per lo studio dell'eterogeneità nella trasmissione dell'agente patogeno. Infine, confermiamo che Dcy mutanti (manca la matrice peritrofica protettiva nell'epitelio dell'intestino) e assaporare mutanti (manca una via di deficit immunitario funzionale (IMD)), mostrano una predisposizione aumentata all'infezione batterica orale. Questo protocollo, quindi, descrive un metodo affidabile per infettare mosche utilizzando la via di infezione, che può essere estesa allo studio di una fonti di varietà genetica e ambientale di variazione in esiti di infezione intestinale e trasmissione batterica orale.

Qui, presentiamo illustrativi risultati dagli esperimenti dove d. melanogaster oralmente è stato infettato con p. aeruginosa o p. entomophila. Nella figura 2 viene illustrato il successo infezione orale di mosche dopo un periodo di esposizione 12h o 24h per le colture batteriche di OD600 = 25 e 100 per p. aeruginosa (Figura 2A) e p. entomophila (Figura 2B C), rispettivamente. Figura 2B illustra l'importanza dell'utilizzo di una cultura più concentrata di p. entomophila, indicato tramite l'aumento in carica batterica quando mosche sono esposti a colture batteriche di maggiore densità ottica. Maschi e femminile Oregon R (OreR) mosche eliminare p. aeruginosa infezione allo stesso tasso (Figura 3) e versato lo stesso numero di p. aeruginosa CFUs (Figura 4A). Quando infettati con p. entomophila tuttavia, mosche OreR maschili e femminili differiscono nel numero di capannone di batteri, in modo che cambia nel tempo (Figura 4B). Maschi e femmine muoiono da p. aeruginosa (Figura 5A) e p. entomophila (figura 5B) ai tassi differenti. Vediamo anche che Dcy mutanti (che mancano la matrice peritrofica protettiva nell'epitelio dell'intestino) e mutanti di Relish (che mancano un percorso immune funzionale di IMD), mostrano la sopravvivenza in diminuzione dopo p. aeruginosa p. entomophila e infezione orale (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica dei protocolli per la misurazione di sopravvivenza, spargimento e carica batterica interna dopo l'infezione orale in Drosophila melanogaster. Un'illustrazione di 3 esperimenti potenziale dopo l'infezione orale di d. melanogaster. Misurare la 'sopravvivenza' trasferimento singoli mosche per fiale e registrando la loro durata infetto. Misurare 'spargimento' trasferendo mosche singole provette per microcentrifuga da 1,5 mL con 50 µ l di terreno di Lewis nel tappo. Dopo 24 h nel tubo, rimuovere al volo e vortice il tubo con 100 µ l di 1X PBS. Rimuovere e questa soluzione su agar nutriente LB per calcolare lo spargimento batterico della lastra. Misurare lo spargimento al volo stesso longitudinalmente, trasferendo mosche ai tubi freschi con il mezzo di Lewis nel tappo dopo 24 h e lavatrice e placcatura tubo ora contaminato. 'Carico interno' della Mosca può essere misurato prendendo un infetto fly, superficie di sterilizzazione, e d'omogeneizzazione prima infine placcatura omogenato su agar nutriente LB. Questo può essere eseguito dopo spargimento è stato misurato per calcolare come il 'carico interno' e correlare spargimento. L'illustrazione utilizzata in questa figura è stata originariamente disegnata da B. Nuhanen36. Gli autori lo hanno modificato per accompagnare la curva di Kaplan-Meier di esempio che è presa da Wikimedia Commons37. Tutte le altre illustrazioni sono originali. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> Figura 2: dose infettante dei batteri dopo l'infezione orale. (A) dose infettiva di maschio e femmina Oregon-R Vola a seguito dell'esposizione ad una cultura di p. aeruginosa (OD600 = 25) per 12 h. La media e SE sono stati calcolati da 3 maschi e 3 femmine. (B) dose infettiva di femmine di selvaggio-tipo esogamico dopo l'esposizione ad una delle quattro p. entomophila culture (OD600 = 100, 25, 50 e 75) o controllare 5% soluzione di saccarosio per 24 h. La differenza statistica di (F3,76 = 18.567, p < 0,001) nella dose infettiva fra i trattamenti di esposizione è denotato da diverse lettere sopra bar. I mezzi sono stati calcolati da 5 mosche per il OD600 = 0 dose e 18-20 per tutte le altre dosi. (C) la dose infettiva di maschio e femmina Oregon-R Vola a seguito di esposizione alla cultura di p. entomophila (OD600 = 100) per 24 h. La media e SE sono stati calcolati da 20 maschi e 20 femmine. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> Figura 3: Carico interno p. aeruginosa in mosche dopo infezione orale. Il carico batterico media ± SE di sesso maschile e femminile Oregon-R vola dopo l'infezione orale con p. aeruginosa (OD600 = 25) fino a post-infezione 168 h. La media e SE di ogni punto di tempo sono calcolati da 3 individui. Carica batterica interna della Mosca cambia in modo significativo nel tempo (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> Figura 4: batterica spargimento dopo l'infezione orale. (A) p. aeruginosa capannone dalle mosche stessi utilizzati nella Figura 3, fino post-all'infezione 120 h. La media e SE sono stati calcolati da 3 maschi e 3 femmine. (B) p. entomophila capannone da maschio e femmina Oregon-R vola dopo l'infezione orale con p. entomophila (OD600 = 100) fino a post-infezione 120 h. La media e SE sono stati calcolati da 34 maschi e 38 femmine. Sia p. aeruginosa di p. entomophila, il numero di CFUs capannone da un Mosca cambia in modo significativo nel tempo (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> Figura 5: sopravvivenza di mosche dopo infezione batterica orale. Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier (KM) di (A) Oregon-R maschio e femmina vola dopo l'infezione orale con p. aeruginosa (OD600 = 25) o controllare 5% soluzione di saccarosio. La curva di sopravvivenza di KM è stata calcolata da 4 flaconcini di 20 mosche per gruppo di trattamento. (B) OreR maschio e femmina vola dopo infezione orale con p. entomophila (OD600 = 100). La curva di sopravvivenza di KM è stata calcolata da 4 singolo controllo mosche e 34 mosche infette per sia i maschi che le femmine. (C) Immune mutanti: Dcy (mutante di matrice Drosocrystallin-peritrofica) e Rel (mutante Relish-IMD), esposti a p. entomophila (Pe), p. aeruginosa (Pa14) o una soluzione di saccarosio di 5% di controllo. Tutti i gruppi infetti muoiono significativamente più velocemente che il controllo di mosche (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Questo protocollo descrive metodi per esporre oralmente e di infettare il moscerino della frutta Drosophila melanogaster con batteri patogeni e per misurare il numero di batteri infettivi capannone dopo l'infezione dell'intestino. Descriviamo ulteriormente l'effetto di mutanti immuni sulla sopravvivenza vola dopo l'infezione batterica orale.

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