Name: oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster
Uploaded: 2018-05-31T14:45:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por um prêmio estratégica do Wellcome Trust para o centro para a imunidade, infecção e evolução (http://ciie.bio.ed.ac.uk; concessão referência n º 095831). PFV foi apoiado por uma bolsa Branco Weiss (https://brancoweissfellowship.org/) e Fellowship de um Chanceler (Faculdade de ciências biológicas, Universidade de Edimburgo); JASJ foi apoiado por uma bolsa de estudo do NERC E3 DTP PhD.

1. manter moscas
<ol><li>Manter as moscas em frascos de plástico de 23 mL contendo 7 mL do meio de Lewis recém-feitos (modificado da referência31; triplo 1L destilada H2O, ágar 6,1 g, 93,6 g de açúcar mascavado, 68g de milho, fermento instantâneo g 18,7, agente anti-fúngico de Tegosept de 15 mL) em incubadoras a 25 ± 1 ° C, em um h:12 12 h luz: escuro ciclo com ~ 60% de umidade. Conecte os frascos com algodão não-absorvente.</li>
	<li>Depois de 14 em 14 dias, transferi adultos de 20 a 30 para um frasco novo de comida, com levedura instantânea, seca, adicionada à superfície, por 2-3 dias permitir que a postura ocorrer. Após este período de tempo, certifique-se de que os ovos são visíveis na superfície do alimento. Remova moscas adultas. Nota: Isso mantém moscas em frascos como única geração, populações de idade correspondente.</li>
	<li>Deixe os ovos para desenvolver. Nota: A 25 ° C, moscas adultas começam a eclose de pupas no dia 11 e continuam nos dias 12 a 14.</li>
</ol>2. prepare moscas Experimental
<ol><li>Recolher os ovos da geração do pai em uma gaiola de coleção de população/embrião num prato de apple-ágar de 75 mL (1 L triplo destilada H2O, ágar de 30g, 33 g de sacarose, 330 mL de sumo de maçã, agente anti-fúngico de 7 mL Tegosept), com um spread de colar de levedura (mistura de fermento seco com água para uma consistência de manteiga de amendoim). Adicione lã de algodão embebido de água para a gaiola para fornecer a umidade. Nota: Para evitar confusão causados por diferenças na densidade larval de criação de efeitos, é importante que moscas experimentais em frascos diferentes são criadas em densidades semelhantes. O passo acima é realizado para evitar a confusão de efeitos.</li>
	<li>Incubar por 24 h a 25 ° C em um 12 h:12 h ciclo de luz: escuro até postura ocorreu. Se houver demasiado poucos ovos após 24 h, fornece um longo período de habituação. Substituir placas de ágar-apple e permitir a postura ocorrer por um mais 24 h.</li>
	<li>Leve pratos ovo-carregado apple-ágar da jaula de população. Remova a pasta de fermento restante e qualquer moscas mortas da superfície do agar.</li>
	<li>Submergir o ágar-ágar em 20 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x e desalojar delicadamente os ovos da apple-agar com um pincel fino. Enquanto suspenso em PBS, transferir os ovos para um tubo de centrífuga de 50 mL e deixar por 5 min para que os ovos afundam até o fundo. Nota: a maioria dos ovos são encontrados na borda externa do ágar.</li>
	<li>Remover cortando o fundo de 4 mm de uma ponta da pipeta filtrada p1000 e usar a ponta da pipeta para desenhar 1 mL de solução, tirada do fundo do tubo de centrífuga de 50 mL. Transferir isso para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e deixe repousar. Nota: Quando a pipetagem ovos, snap-liberando o êmbolo é mais eficiente do que uma versão suave.</li>
	<li>Remova cortando o fundo de 4 mm de uma ponta da pipeta filtrada p20. Definir a pipeta com um volume desejado e tirar do fundo do tubo do microcentrifuge. Nota: Com a prática, um volume de 5 µ l contém cerca de 100 ovos.</li>
	<li>Dispense os ovos coletados sobre os alimentos e deixá-los a desenvolver para a quantidade de tempo necessária.</li>
</ol>3. bacteriana cultura
<ol><li>Para o cultivo de culturas de entomophila p. e p. aeruginosa , inocular 10 mL de caldo de Luria-Bertani (LB) com 100 µ l de um estoque congelado bacteriano a 30 ° C (p. entomophila) e 37 ° C (p. aeruginosa), respectivamente. Agite a 150 rpm, durante a noite. Certifique-se de que a cultura bacteriana atinja a fase de saturação.</li>
	<li>Para garantir as bactérias usadas para inocular as moscas estão na fase exponencial e rapidamente replicando, inocular a cultura durante a noite em uma subcultura de nova, de um volume desejado, na manhã seguinte. Certifique-se de que o pre-inóculo é 10% do volume total da cultura subcultura. Nota: A infecção Oral requer alta. Portanto, é necessário crescer um volume substancial de cultura bacteriana para que suficiente cultura de inoculação pode ser produzida para a dose desejada e tamanho experimental. Calcular quanto subcultura é necessário para produzir as doses infecciosas necessárias usando a equação MsVs = MeuVeu, onde M representa uma cultura de densidade óptica medida em 600 nm (OD600) valor e V representa a sua volume. Subscritos letras referem-se a cultura é usada como uma subcultura (s) ou uma dose infecciosa (i).</li>
	<li>Cresce essa subcultura em um Erlenmeyer de 2 L, em um volume tal que a superfície da subcultura cai (no máximo) logo acima o início declive no balão. Não encha acima esta marca como ele será stunt o crescimento de bactérias.</li>
	<li>Certifique-se de que bactérias dessa subcultura estão em fase de crescimento exponencial medindo-se a cada 30 min de OD. Nota: Isto ocorre após 3-5 h, onde a subcultura atinge uma OD600 entre 0,6-0,8.</li>
	<li>Despeje volumes iguais dessa subcultura em 50 mL de tubos de centrífuga e girar a subcultura a 2.500 x g, durante 15 min a 4 ° C para as bactérias de Pelotas. Uma vez peletizado, remover e em seguida girar o sobrenadante novamente às condições acima para confirmar a remoção da maioria das bactérias. Nota: Uma pastilha de tamanho desprezível (menor que 1 mm de altura) confirma isso.</li>
	<li>Combine as pelotas bacterianas dos tubos separados por re-suspensão-los em 5 mL de subcultura sobrenadante e recombinar destas soluções em um tubo único de 50 mL. Gire esta cultura concentrada a 2.500 x g, durante 15 min a 4 ° C para as bactérias de Pelotas.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet final de bactérias na solução de 5% de sacarose em água. Verifique o OD e ajustar a dose infecciosa desejada (OD600 = 100 para entomophila p.8 e OD600 = 25 para p. aeruginosa16,28), suspendendo novamente as pelotas em 5% solução aquosa de sacarose para o volume necessário. Nota: A quantidade de solução a 5% de sacarose água a ser adicionado pode ser calculada usando a equação na etapa 3.2.1 (MsVs = MeuVeu).</li>
</ol>4. por via oral, infectando moscas
<ol><li>Para garantir a infecção oral, morrer de fome as moscas para 2 – 4 h antes da exposição às bactérias, transferindo as moscas para frascos de ágar padrão (triple 1L destilada H2O ágar de 20 g, 84 g de açúcar mascavado, agente anti-fúngico de Tegosept de 7 mL).</li>
	<li>Prepare frascos de infecção enquanto moscas são estarmos esfomeadas. Fazer um frasco de infecção de Pseudomonas por pipetagem 500 µ l de ágar padrão de açúcar para a tampa de um tubo de amostra de 7 mL e deixe-o secar. Coloque um disco de papel de filtro na tampa e pipetar 100 µ l de cultura bacteriana diretamente sobre o disco de filtro. Para infecções de controle, substitua a cultura bacteriana com o mesmo volume de solução a 5% de sacarose água no filtro de papel.</li>
	<li>Adicionar moscas única para o tubo de amostra e deixar durante 18-24 h.</li>
	<li>Para confirmar a infecção oral, primeiro superfície-esterilize as moscas imediatamente após a exposição bacteriana, colocando-os em 100 µ l de etanol 70% por 20 a 30 s. remover o etanol e adicionar 100 µ l de triplo destilada água para 20-30 s antes de retirar a água. Adicione 100 µ l de PBS 1x e homogeneizar a mosca.</li>
	<li>O homogeneizado de transferência para a linha superior de uma placa de 96 poços e adicione 90 µ l de 1X PBS a cada poço abaixo.</li>
	<li>Serialmente dilua este exemplo para distinguir um valores de intervalo de UFC. Leve 10 µ l do homogeneizado no poço superior e adicione isto ao poço abaixo. Repita essa etapa com o segundo, a transferência de 10 µ l para o terceiro e assim por diante, para tantos diluições em série conforme necessário. Nota: É importante que novas pontas de pipetas são usadas para cada conjunto de diluições.</li>
	<li>As diluições de série em uma placa de ágar LB em gotas de 5 µ l, para garantir que todas as gotas permanecem discretas da placa.</li>
	<li>Incubar as placas de ágar LB durante a noite em 30 ° C e 37 ° C para p. entomophila e p. aeruginosa, respectivamente e contam CFUs visíveis. Nota: Enquanto micróbios do intestino de Drosophila exigem condições distintas de crescimento anaeróbico, meio seletivo, por exemplo Pseudomonas isolamento médio (PIM), pode ser usado para certificar-se que apenas de Pseudomonas CFUs são contados.</li>
	<li>Calcule o número de CFUs por voar pela contagem do número de colônias presentes na diluição serial onde 10 – 60 CFUs são claramente visíveis. Em seguida multiplica pelo fator de diluição presente para calcular o número de bactérias por mosca.</li>
	<li>Realizar análise estatística. Sempre que necessário, transforme os CFUs por mosca a uma distribuição normal. Fazer este registro-transformação. Uma vez transformado, use modelos lineares generalizados (MLG)30,31,32 para testar como grupos de tratamento diferem em CFUs por mosca (usando pacotes de software estatísticos comumente disponível como R33). Nota: O restante homogenate mosca pode ser usado para medir a expressão gênica, através da análise quantitativa de transcrição reversa PCR (RT-qPCR). Corrigir o homogeneizado em 50 µ l de reagente de isolamento de RNA, extrair o RNA e quantificar a concentração de gene imune específico por RT-qPCR (ver , por exemplo, Gupta e Vale16 para um protocolo detalhado). A expressão de transcritos do gene imune específica deve ser normalizada para os níveis de transcrição de um gene de limpeza (ou seja, rp49) e expressa como uma dobra de mudança em relação ao controle de moscas usando o método 2−ΔΔCt 31, 32,33,34.</li>
</ol>5. gravação sobrevivência após infecção
<ol><li>Infectar moscas por via oral conforme descrito na etapa 4.2.</li>
	<li>Transferir os infectados ou controle de moscas de seus frascos de infecção respectivos em norma Lewis frascos e manter em uma incubadora a 25 ° C em um 12 h:12 h claro-escuro do ciclo (ou desejado condições). Espantar moscas até que eles estão mortos.</li>
	<li>Conte o número de moscas vivos ou mortos em cada frasco todos os dias, ou tão frequentemente quanto necessário.</li>
	<li>Transferi as moscas para novos frascos cada 5 dias para evitar as moscas, ficando pressas na comida.</li>
	<li>Apresentar estes dados como curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier (KM) ou média ± SE sobrevivência proporcional parcelas. Para analisar o efeito de diversos fatores e/ou suas respectivas interações com o outro usar um pacote estatístico (por exemplo, o pacote de "sobrevivência" em R33) para executar uma análise de sobrevivência, tais como o modelo de riscos proporcionais de Cox35.</li>
</ol>6. medir a carga bacteriana
<ol><li>No ponto de tempo desejado, transferi uma única mosca infectada para um tubo de microcentrifugadora estéril 1,5 mL.</li>
	<li>Superfície esterilizar as moscas, conforme descrito na etapa 4.4.</li>
	<li>Homogeneizar a mosca e quantificar a carga bacteriana usando o protocolo descrito nos passos 4.5 – 4.10.</li>
</ol>7. Meça o derramamento bacteriana
<ol><li>Medir o derramamento juntamente com a carga interna.</li>
	<li>Após a infecção, transferi única moscas para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo ~ 50 µ l de meio de Lewis para 24 h.</li>
	<li>Remover as moscas para a medição de carga interno (consulte a etapa 6) e lavar os tubos com 100 µ l de PBS 1x vortexing pesadamente por 3 s.</li>
	<li>Medir os CFUs em deste lavagem por chapeamento na LB ágar usando o mesmo protocolo, conforme descrito nas etapas 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Após a infecção, transferi única moscas para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo ~ 50 µ l de meio de Lewis para 24 h.</li>
	<li>Transferir as moscas para novos microcentrifuga tubos contendo ~ 50 µ l de meio de Lewis para uma mais 24 h. lavagem dos tubos contaminados com 100 µ l de PBS 1x vortexing pesadamente por 3 s.</li>
	<li>Medir os CFUs em deste lavagem por chapeamento na LB ágar usando o mesmo protocolo descrito nos passos 4.6 – 4.8.</li>
	<li>Repita os passos 7.2 e 7.3 e registro de mortalidade voar em cada transferência.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffmann, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Genotype+and+Coinfection+Modify+the+Relationship+of+within+and+between+Host+Transmission.">Host Genotype and Coinfection Modify the Relationship of within and between Host Transmission.</a> Am Nat. 186 (2), 252-263 (2015).</li><li>Fellous, S., Duncan, A. B., Quillery, E., Vale, P. F., Kaltz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+influence+on+disease+spread+following+arrival+of+infected+carriers.">Genetic influence on disease spread following arrival of infected carriers.</a> Ecol Lett. 15 (3), 186-192 (2012).</li></ol>

Apresentamos um protocolo para confiantemente oralmente, infectando d. melanogaster com patógenos bacterianos. Focamos em p. aeruginosa e p. entomophila, mas este protocolo pode ser facilmente adaptado para permitir a infecção de outras espécies bacterianas, por exemplo, Serratia marcescens7. Aspectos-chave deste protocolo irão variar entre espécies bacterianas. Por conseguinte, a dose infecciosa mais eficiente, correspondente de virulência e suscetibilidade de genótipo do hospedeiro devem tudo ser consideradas e idealmente testadas em estudos-piloto. Expondo as moscas para culturas bacterianas de uma gama de densidades ópticas e medir a sua dose infecciosa e sobrevivência é um ponto de partida adequado quando trabalhar com novas espécies bacterianas ou linhas de voar.
Etapas do protocolo como voam fome antes da alimentação e re-suspensão bacterianas pelotas em solução de sacarose 5% são comuns na infecção oral e aumentam a confiabilidade da infecção bacteriana durante a exposição7,8, 9 , 10. no entanto, é importante notar que, durante a exposição, moscas essencialmente vivem sobre uma superfície de cultura bacteriana. No processo de andar sobre esta cultura, bactérias irão tornar-se alojou na superfície da mosca, especialmente a cutícula ou em torno das cerdas24. Estas bactérias epicuticulares, não refletem uma infecção entérica bem sucedida, mas ainda seria detectado pela mosca homogeneização e chapeamento. Para reduzir o potencial de falsos positivos, é essencial a superfície esterilizar moscas através de imersão em etanol a 70% para até 1 min.
Quando considerando taxas derramamento bacterianas, infecção oral é essencial. O número de agentes patogénicos que um host libera no ambiente é muitas vezes difícil de medir e a carga interna é muitas vezes tomada como um proxy para a gravidade da infecção e, consequentemente, transmissão26,27. Medição de carga bacteriana ao lado de derramamento bacteriana permite uma análise da relação entre esses dois componentes importantes da doença de gravidade e propagação38. Uma limitação do método apresentado é que a carga bacteriana interno de moscas de análise requer amostragem destrutiva. Isso torna difícil investigar tendências longitudinais do crescimento do patógeno e desembaraço no mesmo indivíduo. No entanto, é possível superar esta limitação por coortes de amostragem destrutiva de indivíduos em diferentes fases da infecção, sob a suposição de que a carga média micróbio em cada coorte reflete a dinâmica longitudinal do patógeno dentro de qualquer dado individuais. Vertendo a bacteriana não sofre as mesmas limitações, e oferecemos exemplos de como derramamento pode ser quantificada em uma amostra transversal ou longitudinalmente para investigar como derramamento muda dentro de um indivíduo ao longo do tempo.
Muitos traços de hospedeiro e patógeno em conjunto determinam a propensão do indivíduo para transmitir a doença25,26,39. Enquanto o significado desses traços provavelmente varia entre sistemas de patógeno-hospedeiro, vertendo provavelmente é um determinante importante da transmissão fecal-oral. A capacidade de medir o derramamento bacteriana abre a oportunidade de testar esta hipótese. Tendo caracterizado dinâmica hospedeiro-patógeno em um painel desejado de linhas voar, experimentadores poderiam oralmente infectar indivíduos e colocá-los ao lado de hosts não infectados e suscetíveis durante seus períodos infecciosos. Estas moscas 'destinatários' poderiam então ser analisadas para carga bacteriana interno em vários pontos de tempo como uma forma de medir diretamente a transmissão.

Mosca da fruta (também conhecida como a mosca do vinagre), d. melanogaster, tem sido usada extensivamente como um organismo modelo para infecção e imunidade contra uma variedade de patógenos1,2. Este trabalho tem oferecido fundamentais insights sobre as consequências fisiológicas da infecção e também foi pioneiro em desvendar as vias moleculares subjacentes a resposta imune do hospedeiro contra infecções bacterianas, fúngicas e virais de parasitoide. Este conhecimento não é apenas útil para entender a resposta imune inata de insetos e outros invertebrados, mas porque muitos dos mecanismos imunes são evolutivamente conservados entre os insetos e mamíferos, Drosophila também tem estimulado a descoberta dos principais mecanismos imunes em mamíferos, incluindo seres humanos3.
A maioria dos trabalhos sobre Drosophila infecção e imunidade centrou-se em infecções sistêmicas, usando métodos de inoculação que entregam patógenos diretamente no corpo do inseto por picada ou injeção4,5,6. A vantagem destes métodos em permitindo a entrega de uma dose infecciosa controlada é claro e apoiado por um vasto corpo de trabalho sobre infecções sistêmicas. No entanto, muitos patógenos bacterianos naturais de d. melanogaster são adquiridos através de alimentação onde a imunocompetência de intestino desempenha um papel significativo no acolhimento da defesa7,8, de matéria orgânica em decomposição 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. experiências que empregam infecções sistêmicas contornar essas defesas e, portanto, fornecer um quadro completamente diferente do como insetos montagem defesas contra patógenos naturais. Isto é especialmente relevante se o objetivo do trabalho é testar predições sobre a ecologia e evolução da infecção, onde o uso de agentes patogénicos naturais e rotas de infecção são importante16,17. Trabalho recente destacou-se como a rota tomada por patógenos significativamente afeta a doença resultado18,19, provoca distintas vias imune20,21, pode determinar o efeito protetor da Herdado de endossimbiontes16e podem mesmo jogar um papel importante na evolução do anfitrião defesas17.
Outro motivo para empregar orais rotas de infecção é que permite a investigação da variação na transmissão de patógeno medindo derramamento bacteriana durante a excreção fecal após infecção oral22,23, 24. compreender as fontes de heterogeneidade de acolhimento na transmissão da doença é desafiador em populações naturais de25,26, mas componentes de transmissão, tais como patógeno derramamento, sob laboratório controlado de medição condições oferece uma abordagem alternativa útil27. Por alimentação de moscas de bactéria e medição bacteriano derramamento sob uma variedade de contextos de fatores genéticos e ambientais, em condições experimentais controladas, é possível identificar fontes de variação na transmissão entre hospedeiros.
Aqui, descrevemos um protocolo para infectar oralmente d. melanogaster com patógenos bacterianos, e para quantificar o crescimento bacteriano e derramamento que segue (Figura 1). Nós descrevemos este protocolo em duas bactérias Pseudomonas : uma cepa virulenta do patógeno oportunista p. aeruginosa (PA14) e uma menos virulenta do natural voar patógeno p. entomophila. Pseudomonads são bactérias Gram-negativas comuns com uma gama ampla de anfitrião, infectando insetos, nematoides, plantas e animais vertebrados e são encontrados na maioria dos ambientes4,6. Infecção entérica de drosófila por p. aeruginosa e p. entomophila resulta em patologia para epitélios intestinal12,13,14,15, 28. Enquanto focamos estes dois patógenos bacterianos, os métodos descritos aqui podem em princípio ser aplicados a qualquer agente patogénico bacteriano de interesse com pequenas modificações. Após exposição oral, medimos a sobrevivência pós infecção e medir a carga de micróbio dentro moscas individuais e os micróbios viáveis derramado no ambiente, expressado em unidades (CFUs) formadoras. Finalmente, porque o intestino imunocompetência resulta de uma combinação da barreira epitelial e respostas humorais, medimos também a sobrevivência da moscas linhas onde essas defesas são rompidas. Especificamente, Drosocrystallin (Dcy) mutantes foram mostrados anteriormente para ser mais suscetível à infecção bacteriana oral devido a uma matriz de peritrophic empobrecido no intestino29. Também medimos a sobrevivência em um mutante Relish (Rel), que é impedida de produzir peptídeos antimicrobianos contra bactérias Gram-negativas através do IMD caminho30.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vials</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>58.490</td>
			<td>Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7002</td>
			<td>Agar, ash 2.0-4.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown sugar</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>66032</td>
			<td>Light brown soft sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maize</td>
			<td>Dove&#39;s Farm</td>
			<td></td>
			<td>Organic maize flour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fermipan yeast</td>
			<td>Bidvest</td>
			<td>96360</td>
			<td>Dry, instant yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-4-hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5501</td>
			<td>&#62;=99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td>Sucrose BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.5% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>15788517</td>
			<td>X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (50ml)</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>210261</td>
			<td>Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (0.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.699</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube (1.5ml)</td>
			<td>Sarstedt Ltd.</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td>Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>20821.33</td>
			<td>ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Conical Flask</td>
			<td>VWR International Ltd.</td>
			<td>214-0038</td>
			<td>Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>1001-020</td>
			<td>Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bijou sample container</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>129A</td>
			<td>7ml polystyrene sample container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas isolation agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17208</td>
			<td>Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Miller</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd.</td>
			<td>BP1426</td>
			<td>Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Embryo Collection Cages</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>59-101</td>
			<td>Flystuff- fits 100mm petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>353072</td>
			<td>Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle</td>
			<td>Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>12649595</td>
			<td>Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Ltd.</td>
			<td>CHE2068</td>
			<td>Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- non absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABL</td>
			<td>Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool- absorbent</td>
			<td>Cowens Ltd</td>
			<td>ABS</td>
			<td>BP small quantity 20 bags x 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator</td>
			<td>Gallenkamp</td>
			<td>INR-200-010V</td>
			<td>220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70&#186;C. Shaking frequency: 0...400 rpm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbance Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>ELx808&#8482; Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen 5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>Biotek Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td>For Absorbance Microplate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392304</td>
			<td>Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Plus Real Time qPCR System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step One Software 2.3</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R Statistical Software</td>
			<td>https://cran.r-project.org/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741015</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741065</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>741045</td>
			<td>Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>774288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>739288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L filtered pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-one Inc</td>
			<td>740288</td>
			<td>Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral bacterial infection and shedding in drosophila melanogaster

Mosca da fruta Drosophila melanogaster é um dos melhores sistemas de modelo desenvolvido de infecção e imunidade inata. Enquanto a maior parte do trabalho centrou-se em infecções sistêmicas, tem havido um aumento de interesse nos mecanismos de imunocompetência do intestino aos agentes patogénicos, que exigem métodos oralmente infectar moscas. Aqui nós apresentamos um protocolo para expor oralmente moscas individuais para um patógeno oportunista de bactérias (Pseudomonas aeruginosa) e um patógeno bacteriano natural de d. melanogaster (Pseudomonas entomophila). O objetivo do presente protocolo é fornecer um método robusto para expor moscas masculinas e femininas para esses patógenos. Nós fornecemos resultados representativos mostrando fenótipos de sobrevivência e cargas de micróbio bacteriano derramamento, que é relevante para o estudo da heterogeneidade na transmissão do patógeno. Finalmente, podemos confirmar que os mutantes Dcy (falta a matriz peritrophic protetora no epitélio do intestino) e Relish mutantes (falta um caminho de deficiência imunológica funcional (IMD)), mostra o aumento da susceptibilidade à infecção bacteriana oral. Este protocolo, portanto, descreve um método robusto para infectar moscas usando via oral, de infecção, que pode ser estendida para o estudo das fontes de fatores genéticos e ambientais variedade de variação nos resultados de infecção do intestino e transmissão bacteriana.

Aqui, apresentamos resultados ilustrativos de experimentos onde d. melanogaster oralmente foi infectado com p. aeruginosa ou p. entomophila. A Figura 2 demonstra a infecção oral bem sucedida de moscas após um período de exposição de 12h ou 24h para culturas bacterianas de OD600 = 25 e 100 para p. aeruginosa (Figura 2A) e p. entomophila (Figura 2B C), respectivamente. Figura 2B ilustra a importância do uso de uma cultura mais concentrada de p. entomophila, mostrado pelo aumento na carga bacteriana quando moscas são expostas a culturas bacterianas de maior densidade óptica. Moscas de Oregon R (OreR) masculinas e femininas claro infecção p. aeruginosa na mesma taxa (Figura 3) e lançar o mesmo número de p. aeruginosa CFUs (Figura 4A). Quando infectados com p. entomophila , no entanto, moscas de OreR masculinas e femininas diferem no número de galpão de bactérias, de forma que muda ao longo do tempo (Figura 4B). Machos e fêmeas morrem de p. aeruginosa (Figura 5A) e p. entomophila (Figura 5B) em taxas diferentes. Vemos também que Dcy mutantes (que faltam a matriz peritrophic protetora no epitélio do intestino) e Relish mutantes (que não possuem uma linha imune funcional do IMD), mostram a diminuição da sobrevivência após p. entomophila e de p. aeruginosa infecção oral (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig1.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática dos protocolos para a medição de sobrevivência, derramamento e interna carga bacteriana após infecção oral em Drosophila melanogaster. Uma ilustração de 3 experiências potenciais após a infecção oral de d. melanogaster. Medir a 'sobrevivência' transferência única moscas para frascos e registrando sua expectativa de vida infectada. Medir o 'desprendimento' Transferindo única moscas para tubos de microcentrifuga 1,5 mL com 50 µ l de meio de Lewis na tampa. Após 24 h no tubo, remova a mosca e vortex o tubo com 100 µ l de 1X PBS. Remover e esta solução na LB ágar para calcular o derramamento bacteriana da placa. Medir o derramamento na mosca da mesma no sentido longitudinal, transferência de moscas para frescos tubos com meio de Lewis no tampão após 24 h e lavando e chapeamento do tubo agora contaminado. Carga de uma mosca' interno' pode ser medida por tomar um infectado uma mosca, superfície esterilização-e homogeneizando-lo antes de finalmente chapeamento do homogeneizado em ágar LB. Isto pode ser executado após o derramamento foi medido para calcular como a 'carga interno' e correlacionar derramamento. A ilustração mosca usada nesta figura foi originalmente desenhada por B. Nuhanen36. Os autores têm modificado para acompanhar a curva de exemplo Kaplan-Meier, que provém do Wikimedia Commons37. Todas as outras ilustrações são originais. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig2.jpg"> Figura 2: dose infecciosa de bactérias após a infecção oral. (A) dose infecciosa de masculino e feminino Oregon-R voa após exposição a uma cultura de p. aeruginosa (OD600 = 25) para 12 h. A média e SE foram calculados de 3 machos e 3 fêmeas. (B) a dose infecciosa de outcrossed fêmeas tipo selvagem, após a exposição a uma das quatro culturas p. entomophila (OD600 = 25, 75, 50 e 100) ou controlar a solução de sacarose 5% por 24 h. A diferença estatística de (F3,76 = 18.567, p < 0,001) na dose infecciosa entre tratamentos de exposição é indicado por letras diferentes acima de bares. Os meios foram calculados a partir 5 moscas para o OD600 = 0 a dose e 18-20, para todas as outras doses. (C) a dose infecciosa de masculino e feminino Oregon-R voa após exposição à cultura de p. entomophila (OD600 = 100) por 24 h. A média e SE foram calculados de 20 machos e 20 fêmeas. <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig3.jpg"> Figura 3: Carga de interno p. aeruginosa em moscas após infecção oral. Média ± SE carga bacteriana de masculino e feminino Oregon-R voa após infecção oral com p. aeruginosa (OD600 = 25) até pós-infecção 168 h. A média e SE de cada ponto de tempo são calculados a partir de 3 indivíduos. Carga bacteriana interno de uma mosca muda significativamente ao longo do tempo (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig4.jpg"> Figura 4: bacteriana derramamento após infecção oral. (A) p. aeruginosa derramadas por moscas mesmas usadas na Figura 3, até a pós-infecção 120 h. A média e SE foram calculados de 3 machos e 3 fêmeas. (B) entomophila p. derramado por masculino e feminino Oregon-R voa após infecção oral com p. entomophila (OD600 = 100) até pós-infecção 120 h. A média e SE foram calculados de 34 homens e 38 mulheres. Para p. aeruginosa e p. entomophila, o número de galpão de CFUs por uma mosca muda significativamente ao longo do tempo (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57676/57676fig5.jpg"> Figura 5: sobrevivência das moscas após infecção bacteriana oral. Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier (KM) de (A) Oregon-R macho e fêmea voa após infecção oral com p. aeruginosa (OD600 = 25) ou solução de sacarose 5% de controle. A curva de sobrevivência KM foi calculada a partir de 4 frascos de 20 moscas por grupo de tratamento. (B) OreR macho e fêmea voa após infecção oral com p. entomophila (OD600 = 100). A curva de sobrevivência KM foi calculada a partir de 4 único controle de moscas e 34 moscas infectadas para machos e fêmeas. (C) imunes mutantes: Dcy (Drosocrystallin-peritrophic mutante de matriz) e Rel (mutante Relish-IMD), expostos a p. entomophila (Pe), p. aeruginosa (Pa14) ou uma solução de sacarose 5% controle. Todos os grupos infectados morrem significativamente mais rápido do que o controle de moscas (p < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57676/57676fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Este protocolo descreve métodos para oralmente expor e infectar a mosca de fruta Drosophila melanogaster com patógenos bacterianos e para medir o número de bactérias infecciosas galpão após infecção do intestino. Ainda mais, descrevemos o efeito de mutantes imunes na mosca sobrevivência após infecção bacteriana oral.

Infecção bacteriana e oral Shedding em Drosophila melanogaster.

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Research

JoVE Journal

Biology

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