Name: enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors at JoVE.com

JMN reconhece o apoio financeiro do Instituto Nacional de General Medical Ciências (T32GM088129) e do Instituto Nacional de Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) ambos os institutos nacionais de saúde. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. Este projeto também foi apoiado pela citometria e núcleo de classificação de célula no Baylor College of Medicine com financiamento do NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 e S10 RR024574) e a assistência especializada de Joel M. Sederstrom.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do Baylor College of Medicine e institucional Cuidado Animal.
1. digestão e colheita tumor
Nota: O tempo necessário para a colheita é ~ 3-5 min/tumor e o tempo necessário para o processamento é ~ 1 h + 2-3 min/tumor.
<ol><li>Eutanásia em ratos por inalação de dióxido de carbono e uma mangueirada cada rato com etanol a 70% antes da colheita para evitar a contaminação de cabelo. ...

<ol>
	<li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+hallmarks+of+cancer.">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li><li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth.">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li><li>Chiou, V. L., Burotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudoprogression+and+Immune-Related+Response+in+Solid+Tumors.">Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).</li><li>Menon, S., Shin, S., Dy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Cancer+Immunotherapy+in+Solid+Tumors.">Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors.</a> Cancers. 8 (12), 106 (2016).</li><li>Denkert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Lymphocytes+As+an+Independent+Predictor+of+Response+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Breast+Cancer.">Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+effects+of+ablative+radiation+on+local+tumor+require+CD8++T+cells:+changing+strategies+for+cancer+treatment.">Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment.</a> Blood. 114 (3), 589-595 (2009).</li><li>Stakheyeva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+immune+component+of+tumor+microenvironment+in+the+efficiency+of+cancer+treatment:+perspectives+for+the+personalized+therapy.">Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-Cytometry:+A+Method+for+Highly+Multiplex+Quantitative+Tissue+Imaging+Analysis+Applied+to+Dendritic+Cell+Subset+Microanatomy+in+Lymph+Nodes.">Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li><li>Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cell+Subsets+in+Tumor-Bearing+Mice.">Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li><li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis.">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li><li>Casadevall, A., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigorous+Science:+A+How-To+Guide.">Rigorous Science: A How-To Guide.</a> mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyTOF+supports+efficient+detection+of+immune+cell+subsets+from+small+samples.">CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples.</a> Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).</li><li>Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Mass+Cytometry+(CyTOF)+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells.">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li><li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model.">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li></ol>

O tempo é composto de moléculas e componentes celulares diversos e complexos. Recentes sugerem que a caracterização exata deste ambiente pode fornecer um melhor entendimento do tratamento de sucesso ou fracasso e pode até mesmo ajudar a identificar os mecanismos de resistência terapêutica. Por exemplo, aumentando os níveis de intratumoral de várias células imunossupressoras (i.e., MDSCs, pilhas de T reguladoras, etc.) pode atenuar efetoras imune respostas e abrogar efeitos imunoterapia. Por ou...

O tempo supressivo recentemente tem sido reconhecido como uma marca registrada de câncer e é conhecido por desempenhar um papel significativo no desenvolvimento e progressão, proteção de cânceres de tumor sólido, bem como atenuar sua susceptibilidade à imunoterapia1. O tempo é composto por vários subconjuntos celulares e fenótipos, os quais fornecem a introspecção crítica do estado imunológico do tumor. Estes subconjuntos imunológicos podem ser ainda mais estratificados em células de origem mieloide, ou linfócitos, que juntos constituem a maioria das respostas de imune inata e adaptativa2,3. Recentes avanços no campo da imunoterapia têm demonstrado que as estratégias de imunoterapia (i.e., inibidores da barreira imune, receptor de antígeno quimérico células-T, etc.) têm o potencial para induzir câncer durável regressões; no entanto, eles permanecem relativamente ineficazes em tumores sólidos cancros4,5. Numerosos grupos mostraram o obstáculo crítico que o tempo pode jogar no tratamento sucesso6,7, e ainda assim, há uma necessidade de avaliar com precisão novas imunoterapias no cenário pré-clínico enfocando especificamente seus capacidade de modular ou superar o tempo8.
Os esforços atuais para caracterizar o tempo normalmente utilizam ou microscopia ou fluem cytometry juntamente com anticorpo rotulagem estratégias para identificar subconjuntos de celulares imunes e suas características9,10. Estas duas estratégias fornecem informações excepcionalmente diferentes, como microscopia permite valorização espacial de subconjuntos de celulares e citometria de fluxo fornece alto rendimento e quantificação mais ampla de mudanças celulares. Apesar das recentes melhorias no multiplex fluorescente imuno-histoquímica otimizando sistemas de imagem espectrais, que agora podem suportar até 7 parâmetros, tamanho limitado do painel torna nível mais amplo imune de perfil difícil e, portanto, esta técnica é frequentemente reservados para mais focada análises. Como resultado, citometria de fluxo permanece um do mais amplamente utilizado imunológico técnicas de criação de perfil. Apesar de seu uso generalizado na caracterização do tempo, os métodos utilizados para processamento e coloração são bastante variável. Mais frequentemente protocolos utilizam um tumor dissociando enzima (ou seja, colagenases, DNase, etc.) e métodos de dissociação manual para atingir as suspensões de célula única, seguido por anticorpo manchando e análise7. Apesar dos benefícios de cada método, numerosos grupos mostraram a extensa variabilidade que pode ser induzida através destas técnicas11. Isto faz comparações de estudo transversal de tumor microambiente perfil extremamente difícil, mesmo quando avaliar o mesmo modelo de tumor murino. Além disso, esses métodos fornecem um potencial limitado para avaliar tumor celular e imunológico tumor infiltrar componentes independente, desde que ambos os componentes são intercalados após a digestão. Quantidade de amostra então limita multi-painel manchando e análise, que se torna um grande problema ao tentar caracterizar subconjuntos imunológicos raros (i.e., tumor-específicas células T)12. Técnicas mais recentes como citometria de massa ou citometria por hora de voo (CyTOF), permitem alta dimensão análise fenotípica de subconjuntos de celulares com alguns sistemas de apoio a projetos de painel superior a 42 parâmetros independente13. Apesar do enorme poder da CyTOF tecnologia em perfil imune, continua a ser limitada devido a despesa, conhecimentos de análise e o acesso ao equipamento. Além disso, muitos protocolos de CyTOF recomendam purificação de subconjuntos imunes para melhorar a relação sinal-ruído14, e, assim, sugerimos que o nosso método de enriquecimento poderia ser usado a montante da análise CyTOF para melhorar a qualidade dos dados.
Neste documento descrevemos uma digestão de microambiente do tumor e análise método que incorpora imune tumor infiltrar na separação. A finalidade desse método é permitir que independente da elevado-produção de perfil do infiltrado imune tumor e frações celulares do tumor para caracterização mais ampla do microambiente do tumor. Usando esse método, demonstramos ainda mais a importância da realização de análises de todo tumor, como um modelo de tumor sólido subcutânea foi encontrado para ter significativa heterogeneidade espacial de imunológica. Em geral, esse método pode com mais precisão e de forma consistente comparar entre amostras porque enriquece para subconjuntos celulares imunes dentro do tumor e permite a caracterização independente das células do tumor e imunes frações de um tumor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">6 to 12 week old male C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:113px;">Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">Mice used in our tumor studies</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line</td>
			<td style="width:113px;">Acquired from collaborator&#160;</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% isopropyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:113px;">EMD Milipore&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PX1840</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Murine surgical tool kit</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:167px;">Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">24-well plate&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">T1024</td>
			<td style="width:167px;">Or any 24-well flat bottom plate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI-1640 media</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R0883</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase I&#160;</td>
			<td style="width:113px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">234153</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:113px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">LS004189</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Low Speed Orbital Shaker</td>
			<td style="width:113px;">BioExpress (supplier: Genemate)&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S-3200-LS</td>
			<td style="width:167px;">Or any orbital shaker.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Thermoregulating incubator</td>
			<td style="width:113px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-255-27</td>
			<td style="width:167px;">Or any other thermo-regulated incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:113px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">E177</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 mL Pipette and tips</td>
			<td style="width:113px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">13-690-032</td>
			<td style="width:167px;">Or any other pipette and tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40 um Cell Strainers</td>
			<td style="width:113px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">C1062-P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">15 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">C1012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">10 mL Luer-Lok Syringe without needles</td>
			<td style="width:113px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lymphoprep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:113px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7811</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Transfer Pipettes</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;">P7212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">96-well U-bottom plates</td>
			<td style="width:113px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DPBS</td>
			<td style="width:113px;">Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D8573</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set&#160;</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">00-5523-00</td>
			<td style="width:167px;">Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thermoregulated Centrifuge</td>
			<td style="width:113px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">For 96-well cell volumetric counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:216px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)&#160;Clone 2.4G2&#160;</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">553141</td>
			<td style="width:167px;">Fc Block</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34962</td>
			<td style="width:167px;">Fixable viability stain</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">47-0451-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-5961-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD8-&#945; Antibody (KT15), PE</td>
			<td style="width:113px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-53473&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-0041-81</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">56-5321-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-0114-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">48-4801-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17-0112-81</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-5931-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25-5982-80</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710</td>
			<td style="width:113px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46-9972-82</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711</td>
			<td style="width:113px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">563755</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment and characterization of the tumor immune and non-immune microenvironments in established subcutaneous murine tumors

O microambiente imune tumor (tempo), recentemente, tem sido reconhecida como um mediador crítico da resposta do tratamento em tumores sólidos, especialmente para imunoterapias. Recentes avanços clínicos em imunoterapia destacam a necessidade de métodos pode ser reproduzidos com precisão e completamente caracterizar o tumor e seu associado infiltrado imune. Digestão enzimática do tumor e análise do fluxo cytometric permitam ampla caracterização dos vários subconjuntos de células imunes e fenótipos; no entanto, profundidade de análise muitas vezes é limitada pela fluoróforo restrições no projeto do painel e a necessidade de adquirir amostras de tumor grande observar raras populações imunes de interesse. Assim, nós desenvolvemos um método eficaz e alta taxa de transferência para separar e enriquecendo o infiltrado imune tumor dos componentes não imune tumor. A digestão de tumor descrito e separação centrífuga baseado em densidade técnica permite separada caracterização do tumor e tumor infiltrar imune fracções e preserva a viabilidade celular e assim, fornece uma ampla caracterização do tumor estado imunológico. Este método foi usado para caracterizar extensa espacial imune heterogeneidade em tumores sólidos, que demonstra ainda mais a necessidade de técnicas de perfil imunológica de tumor todo consistente. Em geral, esse método proporciona uma técnica eficaz e adaptável para a caracterização imunológica do subcutâneos tumores sólidos de murino; como tal, esta ferramenta pode ser usada para melhor caracterizar as características imunológicas tumorais e na avaliação pré-clínica de novas estratégias de imunoterapia.

Nossos resultados demonstram o benefício significativo de TIL separação de componentes de tumor não imune, conforme explicado no protocolo. Além disso, usando o método descrito Demonstramos a heterogeneidade imunológica significativa de tumores sólidos estabelecidos.
Um problema significativo com muitas técnicas de dissociação de tumor é a perda da viabilidade da amostra, geralmente como resultado de condições de d...

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Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Pesquisa do câncer

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...